一种使用改良的光照培养架进行稻瘟病接种鉴定的方法与流程

本发明属于农业植物保护技术领域，具体涉及一种水稻秧苗种植和稻瘟病菌接种鉴定的方法。

背景技术：

由稻瘟病菌(magnaporthegrisea)引起的稻瘟病，是威胁全国水稻生产的最重要病害之一；选育和种植抗病品种是控制该病害最经济、有效的措施。但稻瘟病菌在漫长的进化过程中形成了遗传上的复杂多样性，其快速的变异致使抗病品种经过3-5年的大面积种植便失去抗性。对水稻品种抗稻瘟病的基因型进行推导，可以为选育合适的抗瘟品种和指导品种合理布局提供依据。研究稻瘟病菌生理小种致病性分化，掌握其变化规律以及快速监测技术是目前所迫切需要的任务。

我国对稻瘟病菌生理小种的研究主要依据在小种鉴别品种上的致病性反应划分类群，这一方法简便易行，且有较高的实用意义，多年来的研究结果也对抗病育种起了重要的指导作用，但也存在着工作量大、所需时间长，而且易受外界环境因素的影响等不足之处。特别是在温室内对水稻进行苗期抗性鉴定时，离体接种操作步骤繁琐，耗时耗力，接种不同菌株的水稻品种在空间隔离方面还存在很大的难度。活体接种虽然步骤相对简单，但种植于光照培养箱中的水稻秧苗的生长空间受到很大的限制且由于光照强度达不到要求造成黄叶和苗身细长等，另光照培养箱中的湿度一般在达不到95％，能达到的仪器由于雾气等原因影响光照，且秧苗的种植规模较小，特别是接种不同的稻瘟病菌后，空间隔离上存在操作和技术是上的困难。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种使用改良的光照培养架进行水稻秧苗种植和稻瘟病菌接种鉴定的方法，克服了现有技术上和操作上的困难，简单可行、成本低、周期短，为水稻品种的稻瘟病菌快速高效的抗性鉴定提供了保证。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案来实现：

一种水稻秧苗种植和稻瘟病菌接种鉴定的方法，包括以下步骤：

1)光照培养箱的改造

在普通的光照培养箱内(六面：上下左右前后)铺设反光布，并在光照培养箱的侧壁上开设孔洞；

2)水稻育苗

将水稻种子催芽后播于白瓷盘中，放置于光照培养箱中，苗期温室保持25-28℃；

3)稻瘟病菌制备

将活化后的稻瘟菌株转入番茄燕麦培养基，黑暗培养5-7天后刮去菌丝，置于蓝光、26℃下开盖产孢2-4天，用0.02％的tween-20溶液洗下孢子，过滤后离心弃上清液，加0.02％的tween-20溶液调节孢子浓度待用；

4)稻瘟病菌接种

将稻瘟病菌悬液接种于健康秧苗上，关闭光照、加湿器开启黑暗保湿24h后，打开光照、相对湿度保持100％，温度保持在27+0.5℃，5天后调查发病情况。

5)病害调查

病斑分6级，分级标准如下：

0级——叶面上无病斑；

1级——叶面上出现针尖大小的褐色小点；

2级——病斑褐色，直径约为0.5～1mm；

3级——病斑直径介于1～2mm，中央灰白色，边缘褐色；

4级——病斑长约3～4mm，有典型的“三部一线”，梭形，扩展；

5级——叶片上出现2个及2个以上的4级病斑。

进一步，所述的步骤(2)中用于育苗的土壤按照40kg/亩的用量均匀混入肥料。

进一步，所述的步骤(2)中种植完后每盘喷施1/600的百菌清30ml，每2天追施2‰尿素溶液50ml，接种前3天施最后1次尿素。

进一步，步骤(3)中所述的番茄燕麦培养基为：番茄汁150ml、琼脂18g、燕麦片40g、加水定容至1l。

进一步，步骤(3)中调节孢子浓度至5-10×10⁵个/ml。

进一步，步骤(5)中0、1、2级为抗病反应型r，3、4、5级为感病反应型s，各品种三次接种中有一张叶片呈感病反应者，记为对所接菌株感病。

本发明的有益效果为：

1)发明通过改良的光照培养架，并对其进行简单改造后即可用来种植水稻幼苗，能够很好的保证水稻幼苗生长发育所需要的光照，温度尤其是湿度等条件的需求；

2)操作方法简单易行，不需要专业的技术人员和技术手段；

3)成本低，反光布、子母扣、加湿器及其制备中所需工具和材料价格便宜，购买方便，可重复利用；

4)本发明解决了水稻活体接种稻瘟病菌后秧苗生长发育所需要的光照、湿度等空间条件。可用于植物病害和虫害的抗性鉴定工作。

总之，本发明提供的改良光照培养架用于水稻稻瘟病接种方法简单可行、成本低、周期短，能够实现有效快速的水稻稻瘟病抗性鉴定。

附图说明

图1是本发明改良光照培养箱的结构示意图；

图2是本发明稻瘟病活体接种分级鉴定效果；

图3是本发明方法活体接种效果；

图4是本发明方法离体接种效果；

图中：1、光照培养箱，2、反光布，3、日光灯，4、加湿孔。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一、下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明：

①改良光照培养架制备

用金羚牌双面背胶魔术贴子母扣将一种颗粒反光布反光的一面贴在普通的光照培养架的四周，在反光布合适的位置留直径约5cm的孔洞，将加湿器的管子伸入在该孔洞中以便雾气飘入；

如图1所示，在普通光照培养箱1的内壁上(六面：上下左右前后)设置一层颗粒反光布2，在光照培养箱1的顶部设置两个日光灯3，用于提供光源，在光照的培养箱1的侧壁上设置有加湿孔4，用于连接加湿器，用以控制光照培养箱1内的湿度。

②水稻育苗

土壤为稻田耕作层肥沃土，敲碎后按照40kg/亩的用量均匀混入复合肥。水稻种子经双氧水浸泡24h，灭菌水浸泡12h并催芽后播于白瓷盘中，并放置在①中制备的光照培养架上，每个品种1行，每盘15行，每行10粒。种植完后喷施1/600的百菌清。苗期温室保持25-28℃。每2天追施2‰尿素溶液50ml/盘，接种前3天施最后1次尿素。秧苗长至四叶一心期即用于接种。

③稻瘟菌制备

将活化后的稻瘟菌株转入番茄燕麦培养基(番茄汁150ml，琼脂18g，燕麦片40g，加水定容至1l。)中，26℃、黑暗培养5-7天后用无菌载玻片刮去菌丝，置于蓝光、26℃下开盖产孢2-4天，然后用0.02％的tween-20溶液洗下孢子，双层纱布过滤后于3000r/min离心5min，弃上清液，加0.02％的tween-20溶液调节孢子浓度至5-10×10⁵个/ml。

④稻瘟病菌接种

稻瘟病菌的接种我们采用的是活体接种和离体接种两种方法：

活体接种：用空气压缩泵驱动油漆喷枪将摇匀的孢悬液从四周及斜上方均匀喷在秧苗上，接种量为30ml/盘。接种后关掉光照培养架上的灯、开加湿器黑暗保湿24h，24h之后，将光照打开、相对湿度保持100％，温度保持在27±0.5℃。5天后调查发病情况。

离体接种：取四叶一心期秧苗心叶中上部约5cm，放入保湿后的3个培养皿中，每皿放置3个叶段。在叶表面喷0.02％的tween-20溶液至叶片上均匀分布细雾滴后，将摇匀的孢悬液接种于叶片上，将0.5cm*0.5cm见方的菌丝块接种于叶片上，每个叶段接种3块。光照培养架的光照关掉、加湿器开启黑暗保湿24h后，将光照打开、相对湿度保持100％，温度保持在27±0.5℃。5天后调查发病情况。

⑤病害调查。

如图2所示，病斑分6级，分级标准如下：

0级——叶面上无病斑。

1级——叶面上出现针尖大小的褐色小点。

2级——病斑褐色，直径约为0.5～1mm。

3级——病斑直径介于1～2mm，中央灰白色，边缘褐色。

4级——病斑长约3～4mm，有典型的“三部一线”，梭形，扩展。

5级——叶片上出现2个及2个以上的4级病斑。

其中0，1，2级为抗病反应型“r”；3，4，5级为感病反应型“s”。各品种三次接种中有一张叶片呈感病反应者，记为对所接菌株感病。

二、实验情况

通过对水稻育苗生长状况以及接种稻瘟病菌之后的发病情况等指标进行观察测定分析，如图3和图4所示，证实活体接种和离体接种都能水稻幼苗发病，说明该方法切实可行。

该方法操作简便、成本低、周期短，也可用于其他植物病菌和害虫的抗性鉴定。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。