草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用分子生物学和细胞生物学方法获得并鉴定草鱼细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的基因序列。

背景技术：

细胞粘附分子是分布在细胞表面的一类蛋白质，它们可介导细胞与细胞，细胞与介质之间的相互作用。在免疫系统中，细胞粘附分子对于白细胞的运输和分化具有不可替代的作用。它们不仅可直接激活细胞信号转导通路，并且可在其他受体信号转导过程中保持必要的细胞与细胞接触。因为以细胞物理接触为基础的细胞通讯对免疫反应的协调进行具有重要作用，因此粘附分子在免疫系统中发生的抗体识别作用、共刺激作用和细胞粘附中都扮演了重要的角色。

细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是一类属于免疫球蛋白超家族的单次跨膜糖蛋白。ICAM-1的表达可被细菌脂多糖(LPS)，佛波酯和一些细胞因子，比如:白介素-1，TNF-和IFN-诱导表达。ICAM-1在炎症和免疫相关进程中发挥着重要作用。特别地，它能作为辅助刺激分子在白细胞跨内皮层迁移和T细胞激活中发挥重要作用。目前，多种ICAM-1的配体已被发现，包括淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，巨噬细胞1，抗原鼻病毒，纤维蛋白原和恶性疟原虫感染红细胞。至今，鱼类ICAM-1还未见报道，且草鱼的ICAM-1分子还未发现。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种草鱼细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因的分离和鉴定方法。本发明发现了草鱼基因组中一个可以编码介导草鱼ICAM-1的基因，并用细胞生物学的方法证实它能特异介导血淋巴细胞(PBLs)的粘附。为实现本发明的目的，本发明提供了包括基因克隆、粘附分子成熟蛋白表达质粒的构建、粘附分子表达质粒的转化、草鱼血淋巴细胞粘附等方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定，其特征在于，包括以下步骤：

S1、克隆得到草鱼ICAM-1编码序列：从草鱼基因组中找到ICAM-1的序列，设计引物，从草鱼头肾组织中克隆得到草鱼ICAM-1的编码序列和氨基酸序列；

S2、提取草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒：对草鱼ICAM-1的编码序列进行酶切位点扫描分析，对照载体pcDNA3.1/myc-His(-)的多克隆位点上的酶切位点，选择目的编码序列所不含的酶切位点作为构建质粒的酶切位点，设计含有酶切位点的引物，PCR扩增，进行胶回收产物，然后进行双切酶消化反应，用连接酶将其连接到所需载体，在42℃热激转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并培养，提取草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒；

S3、ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达：设定温度下，将草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒转染到含COS-7细胞的培养基中，转染表达；

S4、草鱼血淋巴细胞的分离及染色：用断颈法收集草鱼血液按1:1加入培养基并混匀，通过密度梯度离心处理得到草鱼血淋巴细胞，将得到的草鱼血淋巴细胞分为两份，其中一份加入细菌脂多糖进行处理后，向两份草鱼血淋巴细胞加入荧光染料进行孵育染色处理；

S5、草鱼血淋巴细胞的粘附实验：将荧光染料标记的草鱼血淋巴细胞加入转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中孵育；将同样数目未经荧光染料染色的细胞加入到转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中孵育作为负对照，孵育结束后，用预热的缓冲液洗除去未粘附的细胞，对粘附的细胞分别进行荧光测试。

进一步地，所述步骤S1中的引物：gcICAM-1CDSF 5’TTTCTAAAGCCCAGTACTAGAG3’，gcICAM-1CDSR 5’TGGCAGATGCAGCAAACCCAG 3’。

进一步地，所述步骤S1中的草鱼ICAM-1的编码序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述步骤S1中的草鱼ICAM-1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述步骤S2中的含酶切点位点的引物：

gcICAM-1EXF 5’ccgctcgagaagATGGCGAAGCAGTCGTTTTTTCT 3’，

gcICAM-1EXR 5’cggggtaccAGCAAAGATATTGCTCTGAGAG 3’。

进一步地，所述的步骤S3的具体操作如下：将1μg pcDNA3.1/myc-His(-)或者pcDNA3.1/myc-His/gcICAM-1质粒和1.5μl Lipofectamine 2000试剂在500ul的无血清DMEM培养基中混合，室温下孵育15分钟；用PBS缓冲液洗涤24孔板中的COS-7细胞三次，将转染混合物加入其中；转染4小时后，将转染混合物换成含10％FBS的DMEM培养基，培养48小时后供细胞粘附实验使用。

进一步地，所述的步骤S4的具体操作如下：

(ⅰ)分离：用断颈法处死草鱼，注射器收集血液，迅速加入含50mg肝素钠且不含FBS的RPM-1640培养基按1:1混匀；在50ml的离心管中加入8ml密度为1.083kg/l的Histopaque溶液，再在其上轻轻加入等体积的稀释的草鱼血液；在吊桶离心机上以转速1600g离心30分钟，收集Histopaque溶液和培养基界面的细胞即为草鱼血淋巴细胞；

(ⅱ)染色：用台盼蓝染色检查活细胞数目，然后用含有10％的RPM-1640培养基重悬细胞，并将细胞转入培养基中培养过夜后，收集细胞并分为两份，其中一份用20μg/ml的细菌脂多糖处理1小时；收集细菌脂多糖处理或未处理细胞与5μM calcein-AM在室温下孵育15分钟；未能进入细胞的calcein-AM染料用草鱼血淋巴细胞洗涤三次去除；该染色细胞用于下述的粘附实验。

进一步地，所述的步骤S5的具体操作如下：将荧光染料即calcein-AM标记的草鱼血淋巴细胞浓度调整为3.33×10⁶个/ml，取300ul细胞悬液加入转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中，并在27℃孵育2个小时；同样数目未经calcein-AM染色的细胞也加入到转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中作为负对照；孵育结束后，未粘附的细胞用预热的PBS轻轻洗涤除去；粘附细胞的荧光用尼康荧光显微镜观察；粘附的细胞用含有0.1％Triton X-100的PBS融解，细胞内的calcein被释放，用荧光计数器测量荧光强度。

本发明的有益效果是：ICAM-1对淋巴细胞跨内皮细胞作用是必需的，该基因分离鉴定可用于鱼类免疫学机制研究；血清中存在着可溶性的ICAM-1(sICAM-1)，它来自于蛋白酶切割膜形式的ICAM-1；在临床上，检测血清中的sICAM-1水平可用于辅助诊断鱼病。

附图说明

图1为细胞粘附实验；

A：空载pcDNA3.1/myc-His(-)质粒转染COS-7细胞；B：ICAM-1表达质粒pcDNA3.1/myc-His/ICAM-1转染COS-7细胞，PBLs未经LPS刺激；C：ICAM-1表达质粒pcDNA3.1/myc-His/ICAM-1转染COS-7细胞，PBLs经20ug/ml LPS刺激；D：荧光强度测定结果。

图2为LFA-1在各细胞组分中的表达；

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式。

下面结合具体实施例和附图1、附图2进一步详细描述本发明的技术方案，具体工艺步骤如下：

实施例一、克隆得到草鱼ICAM-1编码序列

利用生物信息学分析，从草鱼基因组中找到疑似ICAM-1的序列，并根据该序列设计引物：gcICAM-1CDSF 5’TTTCTAAAGCCCAGTACTAGAG 3’，gcICAM-1CDSR 5’TGGCAGATGCAGCAAACCCAG 3’，从佛波酯处理的草鱼头肾组织中克隆得到草鱼ICAM-1的编码序列。

本步骤成功进行后，得到草鱼ICAM-1的编码序列，该碱基序列是序列表中的SEQ ID No.1。(注：序列SEQ ID No.1已提交GenBank ID为：KY963996，不过目前还不能检索到该序列。)由该碱基序列翻译得到草鱼ICAM-1，该氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.2。

序列SEQ ID No.1

cattgttttaaaatgaagaagcagtcgttttttctccccacgtcttttcggattttctgtatgcgactatttggatttggttttctgtacttcacactagttacagggacacatgctgatgaatgtcctcttcagctcaacccacagagagttgttgtggagtacgccggttctgtgtcagttaactgcagcacttctgtcacgcatcaagggatgggatgggaaaccagtgagaaacagattggcaagagcagagacaatctgatcacatggagagtgtcaaacctgacacaatgggacatactgccatactgctttataaactataatggacagtgtcaattagagctcccaataactatttaccagactccagacagtgtgtccatcagcactgtgaatcacaccggaccaatgatggagggaaaccagtatgagcttcagtgtgacgttctcaatgtggcccctgttcagaatctcactgtcaaatggtacaaaggacagactctggtggatcaaaccaacttccctgacaccaccatcactccagtgaataaaacagtcacactcatgatccgtccaaacagagctgatgatggagttcagtacaggtgtgaagcagagctggaactgggagaagaaggacctcaacctcctcctaaactcacatcagatcctctcagcattactgtatattataaaccgaccatcaatgagaccaaactgccctccaatgtgtctgtgtttcgtggctatgaaatggtgctggtctgtgaagccgaaggaaacccaaaaccaacaatcagctggaatatcagcacaaataatccagtttacagtaaatcttttactgtaacagattcaacacctgaggatctgtactgcattgcaaacaattctgttgccatcaccatcagacatgtaaaagtgtccaaacaaggtcttccagatatttccatcagtgctggggatcataaaggaccaatgacaacgggccagcagtataaactccagtgtgacgttctttatgtggcttctgttcggtatctcactgtcaaatggtacaaaggacagactctggtggatcaaaccaacttcactgacaccatcaagactccagtgaataaaacagtcacactcatgatccgtccagacagatctgatgatggagctcagtacaggtgtgaagcagagctggaactgggagcagaaggacctcaacctcctcctaaagtcacatcagatcctctcaacattactgtatattttaaaccgatcatcaatgagaccaaactgctttccaaagtgcctgtgtttcgtggctatgaaatggtgctggtctgtgaagccgaaggaaacccaaaaccaacaatcagctggaatatcagcacaaataatccagtttatagtgaaacttttactataacagattcaacaccagaagaagtgtcctgcattgcaaacaattctgttggcagcaccatcagacatgtaaaagtgattttaaaagaggattacctgcccctaatagcagggcttgttgccatcacagtggcgttcatctcagtcatcttcatcttcatctactctatctactacaaaacagccaagacgggccgttatagcctgaaggatgccaagcctagtgcacaaaatggaaacatagcacagaatggcaaagacaacactatccctatgaagaaactctctcagagcaatatctttgcttagacactatccaca

序列SEQ ID No.2

实施例二、提取草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒

由于该蛋白序列不具有信号肽，因此首先对该蛋白基因序列翻译所得的氨基酸序列进行生物信息学分析，通过结构域分析，确定该蛋白的成熟肽。

用NEB cutter软件对该蛋白成熟肽所对应的核酸序列进行分析，确定核酸序列上所含有的内切酶的酶切位点。选用pcDNA3.1/myc-His(-)为表达该蛋白成熟肽所需的载体，将该蛋白成熟肽对应核酸序列上所含的酶切位点与该载体上的多克隆位点上的酶切位点进行比对，选择表达载体上含有而目的核酸序列上没有的Xhol I和Kpn I位点作为构建质粒的酶切位点，设计含有酶切位点的引物为：gcICAM-1EXF 5’ccgctcgagaagATGGCGAAGCAGTCGTTTTTTCT 3’和gcICAM-1EXR 5’cggggtaccAGCAAAGATATTGCTCTGAGAG 3’。使用高保真酶phusion进行PCR扩增。

PCR反应条件如下：

PCR反应条件：l个循环：98℃30s；35个循环：98℃10s,59℃30s,72℃60s；l个循环：72℃10min,4℃保存。

扩增后用琼脂糖凝胶电泳分析产物,并把目标条带切下并进行胶回收,之后用XhoI和KpnI进行双酶切。

双切酶消化条件如下：

将上述反应体系混合，于37℃孵育3小时。酶切产物用琼脂糖进行电泳，将目的片段回收，并将目的片段用T4连接酶连接到所需的载体中。4℃连接过夜后将产物转化到JM109感受态大肠杆菌中，筛选出阳性克隆并用LB液体培养基扩大培养，用天根质粒抽提试剂盒提取质粒作为具有草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒。

实施例三、ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达

将COS-7(非洲绿猴肾成纤维细胞,CRL-1651^TM)在含有10％胎牛血清和双抗的DMEM(购自美国Thermo公司，货号：11885092培养基中，并在含5％CO2温度为37℃的培养箱中培养。将1×10⁵个/孔的COS-7细胞种在24孔板中。培养过夜后进行转染实验。首先，将1μg pcDNA3.1/myc-His(-)或者pcDNA3.1/myc-His/gcICAM-1质粒和1.5μl Lipofectamine 2000试剂在500ul的无血清DMEM培养基中混合，室温下孵育15分钟。同时，用PBS缓冲液洗涤24孔板中的COS-7细胞三次，将转染混合物加入其中。转染4小时后，将转染混合物换成含10％FBS的DMEM培养基，培养48小时后供细胞粘附实验使用。

实施例四、草鱼血淋巴细胞的分离及染色

草鱼用断颈法处死，用注射器收集血液，迅速加入含50mg肝素钠且不含FBS的RPM-1640培养基(1：1)并混匀。在50ml的离心管中加入8ml Histopaque溶液(密度：1.083kg/l)，再在其上轻轻加入等体积的稀释的草鱼血液。在吊桶离心机上以转速1600g离心30分钟，收集Histopaque溶液和培养基界面的细胞即为草鱼血淋巴细胞(PBLs)。在收集后用台盼蓝染色检查活细胞数目，然后用含有10％的RPM-1640培养基重悬细胞，并将细胞转入24孔板培养(1×10⁶个细胞/孔/ml)。培养过夜后，收集细胞并分为两份。其中一份用20μg/ml的细菌脂多糖处理1小时。收集LPS处理或未处理细胞与5μM calcein-AM在室温下孵育15分钟。未能进入细胞的calcein-AM染料用PBLs洗涤三次去除。该染色细胞可用于以下的粘附实验。

实施例五、草鱼血淋巴细胞的粘附实验

将荧光染料(calcein-AM)标记的PBLs浓度调整为3.33×10⁶个/ml,取300ul细胞悬液加入转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中，并在27℃孵育2个小时。同样数目未经calcein-AM染色的细胞也加入到转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中作为负对照。孵育结束后，未粘附的细胞用预热的PBS轻轻洗涤除去。粘附细胞的荧光用尼康荧光显微镜观察并照相保存。粘附的细胞用含有0.1％Triton X-100的PBS融解，细胞内的calcein被释放，其荧光强度用荧光计数器测量(激发和发射波长分别为485nm和538nm)。结果见图1

为进一步确认该粘附分子是ICAM-1，粘附在COS-7细胞上的PBLs用PBS强力洗涤下来。LPS处理或未处理的未经粘附实验的PBLs和粘附洗脱的PBLs的总RNA用Tripure试剂提取，各个样品的2ug总RNA被反转录为cDNA。检测这些细胞中的ICAM-1受体(LFA-1)的mRNA表达水平，间接判断该粘附分子为ICAM-1。结果如图2。

通过上述实施例获得的ICAM-1具有以下应用前景：

1.ICAM-1对淋巴细胞跨内皮细胞作用是必需的，该基因分离鉴定可用于鱼类免疫学机制研究。

2.血清中存在着可溶性的ICAM-1(sICAM-1)，它来自于蛋白酶切割膜形式的ICAM-1。在临床上，检测血清中的sICAM-1水平可用于辅助诊断。因此，发现并鉴定鱼类ICAM-1，使通过检测鱼类血清中的sICAM-1水平辅助诊断鱼病成为可能。

需要说明的是，对于前述的实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本申请并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本申请，某一些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和单元并不一定是本申请所必须的。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。