本发明涉及一种检测LRP2基因rs2544390基因型的方法。
背景技术：
痛风(Gout)是由嘌呤代谢紊乱和肾小管源性的尿酸排泄障碍而引起关节及某些器官损害的一种代谢疾病。近年我国发病率快速增长，年轻化趋势明显，现症患者达1.2亿人以上，其中痛风3000万以上。遗传和环境多因素致病机制未完全明了，至今95％以上患者未能达标治疗。痛风早期的临床表现为间断发作性急性关节炎，主要为单关节受累，肿痛一般持续7-10天，可通过药物或自发缓解，间歇期无症状。随着病程的延长，痛风发作次数、受累关节数逐渐增加，间歇期也开始出现症状，同时关节或皮肤软组织中痛风石形成，严重者出现关节毁损或致残，出现肾脏结石、慢性肾损伤等，最终可能发展成慢性肾功能衰竭。
高血酸尿症(Hyperuricemia，HUA)、饮酒、代谢综合征、高血压、肥胖、利尿剂的服用等危险因素都与痛风的发生发展有关。目前关于痛风的发病机制尚不清楚，但大量研究表明是痛风是一种由环境和遗传因素共同作用引起的多基因遗传病，目前已知的痛风相关基因有ABCG2、IRGM等。研究发现高血酸尿症人群中仅有10％左右的人可能发展成痛风，说明不直接参与尿酸代谢的基因也可能与痛风易感性有关。鉴于痛风对患者引起的严重危害和沉重的负担，对痛风易感基因的筛查和研究日益受到人们的关注。
人属低密度脂蛋白受体相关蛋白2(low-density lipoprotein receptor-relate dprotein LRP2)位于染色体4q22-q23，编码由655个氨基酸组成的跨膜蛋白，为ATP结合转运蛋白G超家族成员。LRP2分子是一种细胞表面蛋白，属于一种内吞性受体，是低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)基因家族七大成员之一。LRP2除了参与内吞作用外，还具有细胞信号传导功能。LRP2bp作为与LRP2结合的一种新型接头分子，可能通过与受体相互作用，招募各种蛋白分子形成蛋白复合体，介导受体参与信号转导。人低密度脂蛋白受体相蛋白2结合蛋白在各种组织和器官中广泛表达，在人子宫、睾丸、小肠、结肠、血液白细胞及人胰腺癌细胞系中表达水平较高。LRP2基因在肝脏和肾小管组织中表达，根据嘌呤降解途径在肝脏被激活或者肾小管的尿酸排泄减少推断出在摄入酒精的背景下LRP2基因突变影响尿酸水平。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测LRP2基因rs2544390基因型的方法。本发明还公开了用于扩增和检测样品LRP2基因SNP rs2544390的引物序列。
本申请人设计了一种检测LRP2基因SNP rs2544390基因型的方法，用来检验LRP2基因SNP rs2544390的基因型，该结果可用于LRP2基因SNP rs2544390相关的痛风易患性风险评估。
本发明的第一个目的是提供一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法，步骤如下：
(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2；
(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；
作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；
(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GA。
作为优选，所述PCR扩增时所用引物为(1)-(3)中的一种：
(1)上游引物：LRP2-F 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'
下游引物：LRP2-R 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'
(2)与(1)中的互补序列；
(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：
作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的试剂盒，所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增上述重组阴性质粒和重组阳性质粒的引物；所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
作为优选，所述引物为(1)-(3)中的一种：
(1)上游引物：LRP2-F 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'
下游引物：LRP2-R 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'
(2)与(1)中的互补序列；
(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：
作为优选，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。
本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下：
(1)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样
本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析：
所述HRM分析的条件为：
94℃ 90s；
60℃ 30s；
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；
(2)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GA。
本发明的第四个目的是提供序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2在制备检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的是提供序列表中SEQ ID No.1、序列表中SEQ ID No.2、权利要求5-8任一所述的试剂盒在制备辅助评估痛风易患性试剂中的应用。
本发明的方法能够准确检测LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的方法对LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于痛风易患性的辅助判断。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的HRM方法灵敏度实验结果。
图2为本发明的方法特异性实验结果。
图3为样本用本发明的HRM方法分析结果。
图4为样本的LRP2rs2544390(c.79+13985G>A)位点的测序结果；其中a为野生型序列，b为杂合突变型序列，c为纯合突变型序列。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方案对本发明做更详细阐述。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物和所用序列合成及测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1LRP2rs2544390标准品的制备
要建立HRM分析方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守和特异性的序列，要保证反应的高特异性。本发明合成包含LRP2rs2544390(c.79+13985G>A)位点的野生型和纯合突变型DNA序列，利用基因重组技术将其克隆到pMD18-T载体中，构建出pMD18-T-rs2544390的野生型和纯合突变型重组质粒，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量后作为待建立方法的标准品，野生型重组质粒为重组阴性质粒，纯合突变型重组质粒为重组阳性质粒，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs2544390的构建和转化
1.合成LRP2rs2544390(c.79+13985G>A)野生型和纯合突变型DNA序列，本发明合成的序列171bp，序列如下：
(1)野生型序列
GAGGCAGCATGGATTGTGGTGGAAAGAACATCACATGTCAAGTCAGGACATTCATGGGTCTTGTTCCTGATGAATGAAGGAAAAATGGGCACAGACGAAGAGGGCCCCTGACTGCTGAAAAGGACCCATGGCCACTTGTCTCCTGGGCATAGTCTCCCTCATCTCAGTCCC
(2)纯合突变型序列
GAGGCAGCATGGATTGTGGTGGAAAGAACATCACATGTCAAGTCAGGACATTCATGGGTCTTGTTCCTGATGAATGAAGGAAAAATGGGCACAGACGAAGAGGGCCCCTGACTGCTGAAAAGGACCCATGGCCACTTGTCTCCTGGACATAGTCTCCCTCATCTCAGTCCC
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
2.连接反应：将上述合成的DNA片段与pMD18-T进行连接，采用如下连接体系进行配制：
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
3.pMD18-T-rs2544390质粒的转化以及PCR鉴定
(1)从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻；
(2)取步骤2得到的连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；
(3)42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min；
(4)于1.5ml EP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃120转/分轻摇培养90min；
(5)将上述培养液短暂离心吸去900μl后取剩余的100μl涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；
(6)从平板上挑取单克隆菌落于500μL Amp抗性LB液体培养基的1.5ml EP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时；
(7)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；
(8)用引物LRP2-F和LRP2-R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。
引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：LRP2-F 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'
下游引物：LRP2-R 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'
体系如下：
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30sec，35个循环；72℃10min。
4.重组阴性质粒和重组阳性质粒提取
采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒，测定浓度和纯度，同时取10μl纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
二、标准品的获取和定量
(1)将步骤一得到的冻存的含有重组质粒pMD18-T-rs2544390的大肠杆菌DH5a 100μl接种于15ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；
(2)采用北京百泰克生物科技有限公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒；
(3)利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计(ND5000)对提取的质粒测定浓度，根据A260/A280判断质粒的纯度，A260/A280＝1.81。
实施例2HRM-PCR检测LRP2rs2544390方法的建立
一、待测样本的制备
提取30例样本的外周血基因组DNA，用作LRP2基因PCR扩增的模板。具体提取方法如下：
(1)取1ml全血，加入3ml TE，颠倒混匀后静置10min，8000rpm离心5分钟，弃上清液；
(2)重复上述步骤2-3次至沉淀为白色；
(3)加入900μl 10％SDS和10μl 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；
(4)将离心管冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min；
(5)小心吸取上清后再加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min；
(6)取上清，加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清；
(7)加500μl 70％的乙醇洗涤沉淀，短暂离心后弃上清，开盖干燥至乙醇完全挥发；
(8)加50μl双蒸水或TE溶解DNA中，-20℃保存。
二、特异性引物的设计与合成
本发明通过对Ensemble数据库中LRP2rs2544390基因序列进行检索，查找人属LRP2基因SNP位点rs2544390的基因序列，用Primer Premier 5软件和Oligo 7软件进行引物设计，设计的上下游引物序列包括所突变的扩增位点(c.79+13985G>A)，选取适合设计引物的片段序列为靶目标，应用Primer Premier 5软件和Oligo 7软件，设计几组扩增片段长度在400bp以内的引物。然后进行数据库引物BLAST特异性比对，选择特异性高，评分好的引物送至公司合成作为初选引物，再进行引物筛选，选择最适合扩增条件的引物用于HRM实验分析。
该引物序列如下：
上游引物：LRP2-F 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'
下游引物：LRP2-R 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'
扩增片段大小为：171bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-GAGGCAGCATGGATTGTGGTGGAAAGAACATCACATGTCAAGTCAGGACATTCATGGGTCTTGTTCCTGATGAATGAAGGAAAAATGGGCACAGACGAAGAGGGCCCCTGACTGCTGAAAAGGACCCATGGCCACTTGTCTCCTGGGCATAGTCTCCCTCATCTCAGTCCC-3’。
或
5’-GAGGCAGCATGGATTGTGGTGGAAAGAACATCACATGTCAAGTCAGGACATTCATGGGTCTTGTTCCTGATGAATGAAGGAAAAATGGGCACAGACGAAGAGGGCCCCTGACTGCTGAAAAGGACCCATGGCCACTTGTCTCCTGGACATAGTCTCCCTCATCTCAGTCCC-3’。
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
三、HRM-PCR反应体系和反应条件
分别以待测样本DNA、重组阴性质粒和重组阳性质粒为模板，以上述引物LRP2-F和LRP2-R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR体系：
其中引物采用LRP2-F和LRP2-R，HRM-PCR采用生工生物(上海)，Green-2-Go qPCR Mastermix试剂盒。HRM分析仪为百源基因ASA-9600实时荧光定量PCR仪。
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环；
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30s
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
四、结果分析
根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GA。
五、灵敏度实验
将重组阳性质粒和重组阴性质粒均稀释至50ng/μl，然后将二者混合进行梯度稀释，重组阳性质粒占比依次为50％、25％、12.5％、5％、2％和1％，按照上述HRM-PCR反应体系和参数进行扩增，分析突变检出范围，即灵敏度。
反应体系如下：
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
结果参照图1，实验数据显示，当重组阳性质粒与重组阴性质粒体积比分别为1:1、1:3、1:7、1:19、1:49和1:99时，均能检测出重组阳性质粒，所以本发明的HRM检测方法的灵敏度为1％。
图1为本发明的HRM方法灵敏度实验结果。
六、特异性实验
以LRP2阳性质粒标本和LRP2阴性质粒标本为模板，以无菌水作为模板进行特异性研究。用上述LRP2-F和LRP2-R为扩增引物，采用以下体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR体系：
其中所采用的引物和试剂盒及仪器设备均于上述保持一致。
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环；
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
结果参照图2，实验数据显示，当以LRP2突变阳性和LRP2野生阴性标本作为模板进行扩增分析时，可出现两条扩增曲线，当以无菌水作为模板进行扩增时，仪器检测系统在40个循环之后仍不能产生S型荧光扩增曲线，表明该反应体系特异性良好。
图2为本发明的扩增方法特异性实验结果。
实施例3应用本发明的检测方法检测样本基因突变
以实施例2步骤中的检测条件，对32例样本进行HRM分析，与重组阳性质粒和重组阴性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的突变类型。根据HRM分析结果针对每种基因型随机挑选1个样本在生工生物(上海)进行Sanger测序验证。
HRM分析结果参见表1和图3，数据显示32例样本中LRP2基因rs2544390野生型有22例，G>A杂合突变型有7例，G>A纯合突变型3例。
图3为样本用本发明的HRM方法分析结果。
Sanger测序结果参见图4。
图4为样本的LRP2rs2544390(c.79+13985G>A)位点的测序结果；其中，a为样本编号7的测序结果，LRP2rs2544390为野生型，b为样本编号17的测序结果，LRP2rs2544390为G>A杂合改变，c为样本编号31的测序结果，LRP2rs2544390为G>A纯合改变。可见，与本发明方法检测的结果完全一致。
表1应用本发明的方法对样本的分析结果
实施例4用于检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的试剂盒
本发明的用于检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的试剂盒包括以下组分：
(1)LRP2rs2544390标准品：重组阴性质粒和重组阳性质粒，按照实施例1中的方法制备。
(2)引物：该引物序列为：
上游引物：LRP2-F 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'
下游引物：LRP2-R 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'。
(3)含饱和荧光染料Eva Green的HRM-PCR扩增试剂。
应用该试剂盒检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法与实施例2相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州百源基因技术有限公司
<120> 一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 171
<212> DNA
<213> 人属低密度脂蛋白受体相关蛋白(ow-density lipoprotein receptor-relate dprotein )
<400> 1
gaggcagcat ggattgtggt ggaaagaaca tcacatgtca agtcaggaca ttcatgggtc 60
ttgttcctga tgaatgaagg aaaaatgggc acagacgaag agggcccctg actgctgaaa 120
aggacccatg gccacttgtc tcctgggcat agtctccctc atctcagtcc c 171
<210> 2
<211> 171
<212> DNA
<213> 人属低密度脂蛋白受体相关蛋白(ow-density lipoprotein receptor-relate dprotein )
<400> 2
gaggcagcat ggattgtggt ggaaagaaca tcacatgtca agtcaggaca ttcatgggtc 60
ttgttcctga tgaatgaagg aaaaatgggc acagacgaag agggcccctg actgctgaaa 120
aggacccatg gccacttgtc tcctggacat agtctccctc atctcagtcc c 171