本发明属于食源性病原菌检测领域，关于一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光PCR检测试剂盒及其方法。
背景技术：
肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的细菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，是毒性最强的细菌之一。它在繁殖过程中分泌肉毒毒素，该毒素是目前已知的最强剧毒物，可抑制神经末梢释放乙酰胆碱，导致肌肉松弛型麻痹。以前有的军队将这种毒素用于制作生化武器。人们食入或者吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，出现眼睑下垂、复视、斜视、吞咽困难、头晕、呼吸困难和肌肉乏力等症状，严重者可因呼吸麻痹而死亡。而肉毒杆菌在自然界分布广泛，土壤中常可检出，偶亦存在于动物粪便中。根据所产生毒素的抗原性不同，肉毒杆菌分为A、B、Ca、Cb、D、E、F、G这8个型，能引起人类疾病的有A、B、E、F型，其中以A、B型最为常见。
肉毒杆菌给人类生活带来如此严重的影响，建立一种能够检测肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的试剂为目前所需。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR引物和探针。
本发明的另一目的在于提供一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的引物组，引物组的核苷酸序列如下所示：
肉毒A型引物：
BT-AF1：5'-TTGAGGAGTCACTTGAAGTTG-3'，
BT-AR1：5'-TGCTAATGTTACTGCTGGATCTG-3'；
肉毒B型引物：
BT-BF1：5'-TTGGGTGAAAAGTTATTAGAGATG-3'，
BT-BR1：5'-ACAGTTACACTAGCAATGTTTGTG-3'；
肉毒E型引物：
BT-EF1：5'-GAAAAATATTTGGATAATTCCAG-3'，
BT-ER1：5'-AGGGTCATAATAACTACTATCTCCAT-3'；
肉毒F型引物：
BT-FF1：5'-GTAATCCTGCAGGGGAAGTTT-3'，
BT-FR1：5'-TTGTAGTTCTAGTAACTGGATGGAA-3'。
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的荧光探针，探针核苷酸序列如下所示：
肉毒A型探针：
BT-AP1：5'-CCTCTTTTAGGTGCAGGCAAATTTGCT-3'；
肉毒B型探针：
BT-BP1：5'-TTCGAGTGGAACACGTCTATCTCCAAGAT-3'；
肉毒E型探针：
BT-EP1：5'-AAATGTAATTGGTACAACCCCCCAAGA-3'；
肉毒F型探针：
BT-FP1：5'-TAAACCATATTTAGGAAATGAACACACGCC-3'。
进一步的，所述探针中还标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、TEXAS RED和CY5中的一种；所述淬灭基团选自BQ1和BQ2中的一种；且不同探针标记的荧光基团各不相同。
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的检测试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物组。
进一步的，该试剂盒中还含有上述所述的探针。
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的检测方法，包含以下步骤：
1)提取样本DNA；
2)以提取的DNA作为模板，使用上述所述的引物组BT-AF1、BT-AR1、BT-BF1、BT-BR1、BT-EF1、BT-ER1、BT-FF1、BT-FR1，及上述所述的探针BT-AP1、BT-BP1、BT-EP1和BT-FP1进行四重荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增曲线进行曲线分析，确定样品中是否含有肉毒杆菌A、肉毒杆菌B、肉毒杆菌E、肉毒杆菌F。
进一步的，步骤2)的荧光定量PCR扩增反应体系为：
酶液含有Taq酶。
进一步的，步骤2)的四重荧光定量PCR反应程序为：93～95℃预变性5～10min，1个循环；93～95℃变性5～15s，；55～60℃退火、延伸、信号采集30～60s；循环36～43次。
本发明的有益效果是：
本发明提供的一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，能够实现快速准确得对肉毒杆菌A/B/E/F型进行分型。准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
附图说明
图1是肉毒杆菌A/B/E/F阳性标准品10倍稀释梯度系列样品的扩增曲线图；
图2是肉毒杆菌A型的FAM通道定量标准曲线图；
图3是肉毒杆菌B型的VIC通道定量标准曲线图；
图4是肉毒杆菌E型的TEXAS RED通道定量标准曲线图；
图5是肉毒杆菌F型的CY5通道定量标准曲线图；
图6是本发明方法对阳性对照和阴性对照样品的扩增结果图；
图7是本发明方法对10个样本的扩增检测结果图。
具体实施方式
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的引物组，引物组的核苷酸序列如下所示：
肉毒A型引物：
BT-AF1：5'-TTGAGGAGTCACTTGAAGTTG-3'，
BT-AR1：5'-TGCTAATGTTACTGCTGGATCTG-3'；
肉毒B型引物：
BT-BF1：5'-TTGGGTGAAAAGTTATTAGAGATG-3'，
BT-BR1：5'-ACAGTTACACTAGCAATGTTTGTG-3'；
肉毒E型引物：
BT-EF1：5'-GAAAAATATTTGGATAATTCCAG-3'，
BT-ER1：5'-AGGGTCATAATAACTACTATCTCCAT-3'；
肉毒F型引物：
BT-FF1：5'-GTAATCCTGCAGGGGAAGTTT-3'，
BT-FR1：5'-TTGTAGTTCTAGTAACTGGATGGAA-3'。
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的荧光探针，探针核苷酸序列如下所示：
肉毒A型探针：
BT-AP1：5'-CCTCTTTTAGGTGCAGGCAAATTTGCT-3'；
肉毒B型探针：
BT-BP1：5'-TTCGAGTGGAACACGTCTATCTCCAAGAT-3'；
肉毒E型探针：
BT-EP1：5'-AAATGTAATTGGTACAACCCCCCAAGA-3'；
肉毒F型探针：
BT-FP1：5'-TAAACCATATTTAGGAAATGAACACACGCC-3'。
优选的，所述探针中还标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、TEXAS RED和CY5中的一种；所述淬灭基团选自BQ1和BQ2中的一种；且不同探针标记的荧光基团各不相同。
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的检测试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物组。
优选的，该试剂盒中还含有上述所述的探针。
一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的检测方法，包含以下步骤：
1)提取样本DNA；
2)以提取的DNA作为模板，使用上述所述的引物组BT-AF1、BT-AR1、BT-BF1、BT-BR1、BT-EF1、BT-ER1、BT-FF1、BT-FR1，及上述所述的探针BT-AP1、BT-BP1、BT-EP1和BT-FP1进行四重荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增曲线进行曲线分析，确定样品中是否含有肉毒杆菌A、肉毒杆菌B、肉毒杆菌E、肉毒杆菌F。
优选的，步骤2)的荧光定量PCR扩增反应体系为：
酶液含有Taq酶。
优选的，步骤2)的四重荧光定量PCR反应程序为：93～95℃预变性5～10min，1个循环；93～95℃变性5～15s，；55～60℃退火、延伸、信号采集30～60s；循环36～43次。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR引物和探针
本发明根据肉毒杆菌A/B/E/F型的核酸序列，设计了大量用于肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR的引物和探针；本发明经过大量筛选，筛选出一组灵敏度高和特异性强的引物和探针，序列如下：
肉毒A型引物：
BT-AF1：5'-TTGAGGAGTCACTTGAAGTTG-3'(SEQ ID NO:1)，
BT-AR1：5'-TGCTAATGTTACTGCTGGATCTG-3'(SEQ ID NO:2)；
肉毒B型引物：
BT-BF1：5'-TTGGGTGAAAAGTTATTAGAGATG-3'(SEQ ID NO:3)，
BT-BR1：5'-ACAGTTACACTAGCAATGTTTGTG-3'(SEQ ID NO:4)；
肉毒E型引物：
BT-EF1：5'-GAAAAATATTTGGATAATTCCAG-3'(SEQ ID NO:5)，
BT-ER1：5'-AGGGTCATAATAACTACTATCTCCAT-3'(SEQ ID NO:6)；
肉毒F型引物：
BT-FF1：5'-GTAATCCTGCAGGGGAAGTTT-3'(SEQ ID NO:7)，
BT-FR1：5'-TTGTAGTTCTAGTAACTGGATGGAA-3'(SEQ ID NO:8)；
肉毒A型探针：
BT-AP1：5'-FAM-CCTCTTTTAGGTGCAGGCAAATTTGCT-BQ1-3'(SEQ ID NO:9)；
肉毒B型探针：
BT-BP1：5'-VIC-TTCGAGTGGAACACGTCTATCTCCAAGAT-BQ1-3'(SEQ ID NO:10)；
肉毒E型探针：
BT-EP1：5'-TEXAS RED-AAATGTAATTGGTACAACCCCCCAAGA-BQ2-3'(SEQ ID NO:11)；
肉毒F型探针：
BT-FP1：5'-CY5-TAAACCATATTTAGGAAATGAACACACGCC-BQ2-3'(SEQ ID NO:12)。
作为优选实施例，所述PCR检测时，对不同的所述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述的肉毒杆菌A/B/E/F型基因探针上标记的荧光信号不相同。本发明选用了FAM、VIC、TEXAS RED和CY5荧光基团标记，但是本发明要求的权利不仅限于这4种固定荧光标记。
实施例2阳性标准品制备、四重荧光定量PCR检测方法
1)标准样品的制备
为了绘制四重荧光定量PCR的标准曲线，我们分别提取肉毒杆菌A型、肉毒杆菌B型、肉毒杆菌E型、肉毒杆菌F型的DNA作为PCR模板，分别用引物将相应的靶序列进行扩增，将扩增产物连入载体中，分别获得含肉毒杆菌A型、肉毒杆菌B型、肉毒杆菌E型、肉毒杆菌F型的靶序列的质粒，即肉毒杆菌A型阳性标准品、肉毒杆菌B型阳性标准品、肉毒杆菌E型阳性标准品、肉毒杆菌F型阳性标准品。
2)阳性标准样品的四重荧光定量PCR检测
将上述肉毒杆菌A型阳性标准品、肉毒杆菌B型阳性标准品、肉毒杆菌E型阳性标准品、肉毒杆菌F型阳性标准品进行10倍梯度稀释作为标准品来检测定量范围。
在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行扩增，每个梯度3个复孔；
其中，荧光定量PCR扩增反应体系为：
酶液中含有Taq酶。
PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s；58℃退火、延伸、信号采集30s；循环40次。
3)绘制标准曲线及结果分析
检测结果如图1～5所示，图1为肉毒杆菌A/B/E/F阳性标准品10倍稀释梯度系列样品的扩增曲线图；图2为肉毒杆菌A型的FAM通道阳性标准品的标准曲线图，图3为肉毒杆菌B的VIC通道阳性标准品的标准曲线图，图4为肉毒杆菌E的TEXAS RED通道阳性标准品的标准曲线图,图5为肉毒杆菌F的CY5通道阳性标准品的标准曲线图。从图中可以看出，在101～105copies/ml范围内4种标准曲线均呈现良好的线性关系(FAM R2＝0.998；VIC R2＝0.992；TEXAS RED R2＝0.995，CY5R2＝0.994，检测下限为100copies/mL)。
上述结果说明本发明针对肉毒杆菌A/B/E/F型的基因分别设计特异性引物，在反应体系中含有肉毒杆菌A/B/E/F型基因模板的情况下，可以实现PCR反应，并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
实施例3一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光定量PCR检测方法
1)样本核酸提取：待提样品10例，含有5例肉毒杆菌A型样本，2例肉毒杆菌B型样本，肉毒杆菌E型1例样本，肉毒杆菌F型1例样本和1例阴性样本。
2)以提取的核酸为模板进行四重荧光定量PCR，反应体系为：
酶液含有Taq酶。
PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s；58℃退火、延伸、信号采集30s；循环40次。
同时，设置阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照为不含有肉毒杆菌A型、肉毒杆菌B型、肉毒杆菌E型、肉毒杆菌F型基因组的生理盐水溶液。阳性对照组为同时含有肉毒杆菌A型阳性标准品、肉毒杆菌B型阳性标准品、肉毒杆菌E型阳性标准品和肉毒杆菌F型阳性标准品的溶液。
3)结果分析：通过荧光扩增曲线图Ct值的大小来判断结果的阴阳性，确定样品中是否含有肉毒杆菌A/B/E/F型。当扩增曲线图Ct值≤38,并呈现明显指数增长时,结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值>38或无Ct值,结果表现为阴性；因此,为了在判断阴阳性时具有参照，检测样本时需要给肉毒杆菌A/B/E/F型分型的四重荧光定量PCR检测试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。
本发明实施例中，用于检测肉毒杆菌A/B/E/F型分型的四重荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX系列、Roche Lightcycler、Ccpheid smartcycler、Corbett Rortor-Gene、杭州博日系列。
检测结果如图6～7所示，其中图6为阳性对照和阴性对照扩增结果图；图7为阴性对照组和样本的扩增结果，其中检出5例肉毒杆菌A型，2例肉毒杆菌B型，肉毒杆菌E型1例和F型1例。检测结果符合预期，准确率达100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州维伯鑫生物科技有限公司
<120> 一种肉毒杆菌A/B/E/F型快速分型的四重荧光PCR引物、试剂盒及方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
ttgaggagtc acttgaagtt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
tgctaatgtt actgctggat ctg 23
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<212> DNA
<213> 人工引物
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ttgggtgaaa agttattaga gatg 24
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
acagttacac tagcaatgtt tgtg 24
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<213> 人工引物
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gaaaaatatt tggataattc cag 23
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<213> 人工引物
<400> 6
agggtcataa taactactat ctccat 26
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 9
cctcttttag gtgcaggcaa atttgct 27
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
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<400> 11
aaatgtaatt ggtacaaccc cccaaga 27
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工引物
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taaaccatat ttaggaaatg aacacacgcc 30