本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测广谱支原体的LAMP引物组、试剂盒及其应用。
背景技术：
哺乳动物细胞的培养过程中，支原体(Mycoplasma)污染历来是一个令人头疼的问题，主要原因有三点：1)、支原体体积非常小，直径为0.1μm，一般过滤除菌无法去除，光学显微镜下难以看清它的形态结构；2)、支原体生命力顽强，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，且对青霉素有抗药性；3)、细胞受支原体污染初期，部分敏感细胞可见细胞生长增值变慢、形态变圆。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。支原体最终会导致细胞死亡，不过更常见的情况是，支原体与细胞共存。在这过程当中，支原体慢慢增殖，直至对细胞产生明显的影响，如干扰细胞迁移、信号转导、淋巴细胞活化和细胞因子表达。对于相关科研工作者来说，最可怕的是支原体污染在不知不觉中改变许多参数，使研究成果的可信度大打折扣。
常用的支原体检测手段包括传统的培养法、ELISA法、PCR法等，这些方法都有不同程度的优缺点。目前PCR法是主流的支原体检测方法，但该技术有五个明显的缺点，1)、需要多个反应温度，整个过程必须要有精确控制温度的热循环仪；2)、PCR扩增只需要两条引物，经常会出现非特异性扩增；3)、细胞生长的代谢物质会抑制PCR反应，直接用细胞培养上清进行支原体检测，往往产生假阴性结果；4)PCR法灵敏度低，通常需要离心富集支原体或先提取基因组DNA；5)结果需要通过电泳来确认，过程繁琐。
为克服PCR的上述缺点，近十几年来开发了多种核酸等温扩增技术。其中Notomi在2000年开发的环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是众多等温扩增技术中的翘楚，它具有明显的优势：首先整个扩增过程只需要使用一个温度，无需精确控温的热循环仪，只需一个水浴锅即可完成。其次，扩增需要使用多个引物，使得此方法的检测特异性显著提高。最后，可通过特殊的染料肉眼观察检测结果。
LAMP可以检测细菌、真菌等病原微生物，并具有很好的特异性和灵敏度。但目前尚无基于颜色判定的LAMP广谱支原体检测的相关应用。
技术实现要素：
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种检测广谱支原体的LAMP引物组及一种支原体可视化检测试剂盒。其具体技术方案如下：
本发明提供了一种检测广谱支原体的LAMP引物组，由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB组成，外引物F3如SEQIDNO.1所示，外引物B3如SEQIDNO.2所示，内引物FIP如SEQIDNO.3所示，内引物BIP如SEQIDNO.4所示，环引物LF如SEQIDNO.5所示，环引物LB如SEQIDNO.6所示。
进一步地，上述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的摩尔比为1:1:8:8:2:2。
本发明还提供了一种含有上述LAMP引物组的支原体可视化检测试剂盒。
进一步地，上述试剂盒还包括变色指示剂、BstDNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、等温扩增缓冲液和MgSO4。
更进一步地，上述变色指示剂为羟基萘酚蓝。
进一步地，外引物F3在支原体可视化检测试剂盒的LAMP反应液中的终浓度为0.2μM，外引物B3在支原体可视化检测试剂盒的LAMP反应液中的终浓度为0.2μM，内引物FIP在支原体可视化检测试剂盒的LAMP反应液中的终浓度为1.6μM，内引物BIP在支原体可视化检测试剂盒的LAMP反应液中的终浓度为1.6μM，环引物LF在支原体可视化检测试剂盒的LAMP反应液中的终浓度为0.4μM，环引物LB在支原体可视化检测试剂盒的LAMP反应液中的终浓度为0.4μM。
进一步地，上述试剂盒还包括阳性模板。
更进一步地，上述阳性模板为含有猪鼻支原体23srRNA5’端部分基因片段的质粒。
本发明还提供了上述LAMP引物组或支原体可视化检测试剂盒在检测支原体污染中的应用。
进一步地，本发明提供了上述LAMP引物组或支原体可视化检测试剂盒在检测支原体污染的细胞培养液中的应用，该应用采用环介导等温扩增，环介导等温扩增的条件为60-62℃恒温反应1h，90℃5min灭活，终止反应。结果判定标准为：反应结束后，肉眼直接观察反应管，蓝紫色体系为阴性结果(图1左)，天蓝色体系为阳性结果(图1右)。
本发明的支原体LAMP检测试剂盒对8种不同种属的支原体物种和三种常见环境微生物进行检测，用于评价该试剂盒的广谱性和特异性。结果显示，利用该方法检测8种支原体均为阳性，其余三种非支原体物种扩增结果为阴性。对支原体污染的细胞上清检测中，将细胞培养上清液稀释104倍后，反应液仍为阳性。
本发明提供的试剂盒使用颜色变化代替浑浊度的变化来判定结果，易于检测；使用的指示剂为羟基萘酚蓝(HNB)价格便宜，比使用荧光指示剂的LAMP反应具有更高的性价比；且指示剂在反应前添加，不会影响扩增，且避免开盖带来的污染。本LAMP检测试剂盒检测细胞培养上清中的支原体污染，只需要反应1h即可，相对于常规的PCR反应(2～4小时)大大缩短了检测时间。本发明试剂盒可快速、便捷、灵敏地检测细胞培养过程中常见支原体污染，其操作简单、性价比高，反应结果易于观察，支原体广谱性和特异性俱佳，非常实用细胞实验室定期、常规的支原体污染检测，减少后期细胞培养过程中支原体污染带来的损失。
以下将结合附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1示出了本发明的体系检测结果判定；反应结束后肉眼观察体系颜色变化，阴性呈蓝紫色(左图)，阳性呈天蓝色(右图)；
图2示出了本发明的体系特异性与广谱性评价，样品1～3分别为大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，样品4～13分别为10种支原体样品，样品14为猪鼻支原体阳性质粒，样品15为灭菌超纯水；图2a为LAMP反应体系检测结果，图2b为2％琼脂糖凝胶电泳结果；
图3示出了本发明的体系灵敏度评价，以感染M.arginini支原体的细胞培养上清(培养3天)为模板，进行10倍梯度稀释，管号1～7分别为稀释100倍至106倍，各取1μl作为检测模板，结果为1号～5号呈天蓝色，6～7呈蓝紫色。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件的修改或替换，均属于本发明的范畴。
实施例1、引物设计
从美国基因数据库Genbank检索细胞培养过程中常见的8种支原体M.hyorhinis、M.fermentans、M.arginini、M.hominis、M.orale、M.salivarium、M.pirum、AcholeplasmaLaidlawii的ITS-23srRNA序列，通过clustalX软件进行同源序列分析比对，找到特异性的保守靶基因片段。本实施例选择23srRNA序列5’端区域，使用primerexplorerV4进行在线LAMP引物设计，获得F3/B3和FIP/BIP引物，再通过手动调整选择合适的环引物。设计好的引物通过primer-blast软件，在线分析它们的特异性与广谱性，最终优化引物如下：
外引物F3：
5’-AAGAGTTTTTGGTGGATGC-3’(如SEQIDNO.1所示)
外引物B3：
5’-CTGCTGCTACTGAGATGTT-3’(如SEQIDNO.2所示)
内引物FIP：
5’-TCATTTCCAGCTAAACGAAGCTTATTTCTTGGGTCTGGAAGTCGA-3’(如SEQIDNO.3所示)
内引物BIP：
5’-GATTTCCGAATGGGGAAACCTAATTTTTACAGCGTGTCTCACTCAT-3’(如SEQIDNO.4所示)
环引物LF：
5’-TCGCAGGTAATCACGTCCTTC-3’(如SEQIDNO.5所示)
环引物LB：
5’-TTGTCATAATCGGTGAATCCATAG-3’(如SEQIDNO.6所示)
实施例2、建立支原体LAMP反应体系
设置不同终浓度的镁离子(4mM、6mM、8mM)，dNTP浓度(1mM、1.2mM、1.4mM)，甜菜碱(Betaine)浓度(0.6M、0.8M、1M)和Bst2.0酶(BstDNA聚合酶)浓度(4U、6U、8U、10U)。
反应结束后肉眼可观察到体系的颜色变化，如图1所示，阴性呈蓝紫色(左图)，阳性呈天蓝色(右图)。
通过反复试验确定了最为优选的支原体LAMP反应体系，即25μlLAMP反应液的配制比例为：10×IsothermalAmplificationBuffer(等温扩增缓冲液)2.5μl、10×LAMPprimermix(引物混合物)2.5μl、10mMdNTPs3μl、100mMMgSO41.5μl、5MBetaine4μl、3mM羟基萘酚蓝(HNB)1μl、8U/μlBst2.0酶(BstDNA聚合酶)1μl、模板1μl、灭菌超纯水补至25μl。
其中1×LAMPprimermix(引物混合物)中所包含的引物组分、序列及浓度如下表所示：
上述反应液的检测条件为：60-62℃恒温1h，80℃10min终止反应。
可选择的，阳性模板的成分为含有猪鼻支原体23srRNA5’端部分基因片段的质粒。
实施例3支原体LAMP检测试剂盒的广谱性及特异性评价
本发明的目的是开发一款能够检测细胞培养过程中常见支原体污染的试剂盒，既满足广谱性支原体检测，必须对非支原体样品具有特异性。本实施例以十种支原体样本M.hyorhinis、M.fermentans、M.arginini、M.hominis、M.orale、M.salivarium、M.pirum、M.pulmonis、M.bovis、M.buccale作为广谱性检测对象，以大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为特异性检测对象。结果显示，LAMP反应体系广谱性和特异性良好，能够检测出上述十种支原体样品，并且三种非支原体环境微生物检测为阴性，如图2a所示。图2b示出了2％琼脂糖凝胶的电泳结果。可见，两种方法的结果一致，但使用本发明的支原体LAMP检测试剂盒，检测步骤简化、时间大为缩短、成本也大大降低。
实施例4支原体LAMP检测试剂盒的灵敏度评价
本实施例以明确感染了M.arginini支原体的细胞培养液(培养3天)进行倍比稀释，评价本发明试剂盒的灵敏度。以细胞培养上清10倍浓度稀释，制备100～10-6稀释的模板，每个浓度梯度取1μl进行检测，按照优化后的LAMP反应体系进行基于颜色判定的LAMP检测，结果示于图3。结果显示该基于颜色判定的LAMP检测体系的检测下限为10,000倍稀释的细胞支原体污染上清液。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。