一种鸡体重性状基因诊断试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种鸡体重性状基因诊断试剂盒及其应用，属于生物育种
技术领域：
。
背景技术：
：indel是指在近缘物种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion/deletion)，是同源序列比对产生空位(gap)的现象。indel在基因组中分布广泛，在分布密度上仅次于单核苷酸多态性(snp)，但远高于ssr。indel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行pcr扩增的标记，其本质仍属于长度多态性标记，可利用便捷的电泳平台进行分型。indel标记准确性高、稳定性好，分型系统简单，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种、医学诊断等研究领域。人类标记的检测已经成为基因诊断的重要手段，随着位于功能基因上indel标记的开发，结合染色体步移和基因精细定位，可将这些标记应用于农业动物经济性状的功能基因的筛选，有利于优良基因的进一步开发和利用。中国的地方鸡种生长速度较慢，一直是育种过程中面临的问题。国外商品肉鸡和蛋鸡的选育由来已久，其在控制生长的相关基因上是否与中国地方鸡种具有差异，目前研究还知之甚少。在地方鸡的育种中需要选育出生长速度快的基因型个体，来满足育种的需求。因此利用分子生物手段来诊断某个体与体重相关基因的基因型，这对育种来说是非常重要和必要的。体重是一种重要的数量性状，在鸡中具有高的遗传性，体重能直接反映营养摄入和支出的平衡，导致瘦肉或脂肪的沉积和骨骼肌的生长。随着家禽遗传标记辅助育种不断深入，大量的性状已经在遗传水平上确定了候选区域。我国有丰富的地方鸡品种资源，如何对其评估、保护和选育是迫切需要解决的问题。qpctl(glutaminylpeptidecyclotransferase-like)是qpct的一种同工酶，qpctl在人类的肥胖中具有一定的作用，而在家禽动物鸡中发现其在生长发育中可能扮演了重要作用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种鸡qpctl基因启动子多态性标记的检测引物，该检测引物特异性强，对鸡qpctl基因启动子多态性标记扩增效率高。本发明还提供了包含上述检测引物的检测试剂盒。本发明还提供了鸡qpctl基因启动子多态性标记的应用。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种鸡qpctl基因启动子多态性标记的检测引物，其特征在于：依据如seqidno.1所示的序列设计，所述检测引物的扩增片段覆盖该序列5‘端起的第20-409位。该引物采用现有技术中常用的设计方法，也可以根据检测方法的不同进行设计。本发明的检测引物扩增出的多态性标记位于qpctl基因的启动子部位。本发明中发现鸡不同体重的差异是由于qpctl基因启动子区域的两个分别为52bp和224bp的插入造成的，这两个片段的插入/缺失构成具有三种基因型的复等位基因。这三种基因型分别为：基因型a是qpctl基因启动子区52bp和224bp插入基因型，核苷酸序列如seqidno.1所示，5‘端起第21-72位插入，第136-248位、268-362位和393-408位插入(由于这三个分别为112、96、和16bp的插入/缺失片段彼此相邻，而且在所有分型个体中保持一致，将其定义其为一个224bp大片段)；基因型b是qpctl基因启动子区224bp插入和52bp缺失基因型，核苷酸序列如seqidno.2所示；基因型c是qpctl基因启动子区224bp缺失和52bp插入基因型，核苷酸序列如seqidno.3所示，其中c基因型为genbanknc_006119.3中的序列。目前人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有snp、单链构象多态技术(sscp)、pcr-rflp和直接测序技术等，但snp和sscp操作繁琐；普通的pcr-rflp方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；而直接测序技术成本较高。本发明的鸡qpctl基因启动子多态性标记，仅通过常规pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳即可分型。具体的，所述引物序列如下所示：上游引物p-f：5’-ctggaatgagcccacatccg-3’；下游引物p-r：5’-cacccgacgggatgttatcg-3’。鸡为二倍体动物，通过上述的a、b、c三种基因型自由组合可以得到aa基因型、bb基因型、cc基因型、ab基因型、bc基因型、ac基因型，可通过上述引物进行pcr扩增，检测扩增产物判断基因型。选择第136-248位、268-362位和393-408位三个片段纯合缺失的鸡个体，即为选出aa基因型、bb基因型、ab基因型的鸡个体，淘汰其他基因型的个体。包含上述检测引物的检测试剂盒。具体的，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和dnamarker中的一种或几种。本发明通过对其他鸡群体进行判型，并测序验证了上述检测引物的准确性。研究表明本发明的检测引物能有效地判断不同体重性状的基因型，可以用于鸡的生长性状的分子标记辅助选择，进而建立纯合优势基因型的鸡种群。鸡qpctl基因启动子多态性标记在鸡体重性状选育中的应用，所述多态性标记如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示，这三种标记在鸡同源染色体上形成复等位基因，分别对应a、b、c等位基因型。具体的，检测如seqidno.1所示序列5‘端起第21-72位、第136-248位、268-362位和393-408位是缺失或插入，选择第136-248位、268-362位和393-408位三个片段双染色体插入的鸡个体(aa、bb、ab基因型)，淘汰第136-248位、268-362位和393-408位三个片段双染色体缺失(cc基因型)或者单染色体缺失基因型的鸡个体(ac、bc基因型)。本发明的新发现的多态性标记可用于鸡的辅助选择和分子育种，有助于节省生产成本并加快遗传选育进展，具有很大的经济应用价值和科研价值。并且对于该多态性标记的52bp和224bp插入缺失基因片段来说，常规pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳即可分型，根据琼脂糖凝胶电泳结果可以准确、快速、方便的检测qpctl基因不同体重性状基因型。本发明中可通过pcr扩增检测第136-248位、268-362位和393-408位是缺失或插入，所述pcr扩增时使用的引物如下所示：上游引物p-f：5’-ctggaatgagcccacatccg-3’；下游引物p-r：5’-cacccgacgggatgttatcg-3’。所述pcr扩增的反应体系为：2×taqpcrmastermix5.0μl，ddh2o3.0μl，引物p-f0.5μl，引物p-r0.5μl，dna模板1.0μl。所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。所述dna模板可采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶k法提取。通过观察所述pcr扩增的产物条带大小检测所述第136-248位、268-362位和393-408位是否插入。其中a基因型的扩增片段为469bp，b基因型的扩增片段为417bp，c基因型的扩增片段为245bp，通过琼脂糖凝胶电泳即可分型，不需要酶切。aa基因型表现为469bp条带；bb基因型表现为417bp条带；cc基因型表现为245bp条带；ab基因型表现为469bp、417bp条带；bc基因型表现为417bp、245bp条带；ac基因型表现为469bp、245bp条带。选出aa基因型、bb基因型、ab基因型的鸡个体，弃去其他基因型的个体。本发明建立的分子生物学方法大大提高了基因型的判定效率和准确性，而且方法简便，分型时间短，不需要测序和限制性内切酶，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。该方法可以快速判定出不同体重性状的基因型，从而缩短育种时间，加快育种进程。附图说明图1为本发明实施例3的技术流程示意图；图2为实施例3中各样本鸡qpctl基因启动子不同体重性状基因型的pcr电泳图；图3为实施例3中鸡qpctl基因启动子的不同基因型测序序列图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。实施例1本实施例中用于检测鸡qpctl基因启动子多态性标记的检测引物如下所示：上游引物p-f：5’-ctggaatgagcccacatccg-3’；下游引物p-r：5’-cacccgacgggatgttatcg-3’。本发明的实施例检测的为位于qpctl基因启动子部位的多态性标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示，或如seqidno.2所示，或如seqidno.3所示，是由于qpctl基因启动子区域的两个分别为52bp和224bp的插入造成的，这两个片段的插入/缺失构成具有三种基因型的复等位基因。基因型a是qpctl基因启动子区52bp和224bp插入基因型，核苷酸序列如seqidno.1所示，5‘端起第21-72位插入，第136-248位、268-362位和393-408位插入(由于这三个分别为112、96、和16bp的插入/缺失片段彼此相邻，而且在所有分型个体中保持一致，将其定义其为一个224bp大片段)；基因型b是qpctl基因启动子区224bp插入和52bp缺失基因型，核苷酸序列如seqidno.2所示；基因型c是qpctl基因启动子区224bp缺失和52bp插入基因型，核苷酸序列如seqidno.3所示。在实际的研究中发现，不存在一条染色体上52bp和224bp同时缺失的基因型。鸡为二倍体动物，通过上述的a、b、c三种基因型自由组合可以得到aa基因型、bb基因型、cc基因型、ab基因型、bc基因型、ac基因型六种基因型的鸡个体。实施例2本实施例中用于检测鸡qpctl基因启动子多态性标记的检测试剂盒包括如实施例1所示的引物，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和dnamarker。实施例3本实施例中鸡qpctl基因启动子多态性标记的应用，研究技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤：(1)样品的采集采集河南农业大学种鸡场f2代资源群(固始鸡×安卡)860只、淅川乌骨鸡323只、，固始鸡143只，卢氏鸡192只，长顺鸡135只，高产蛋鸡海兰228只、快大肉鸡罗斯308189只。翅静脉采血，加1/3抗凝剂，利用dna提取试剂盒提取基因组dna，保存于4℃冰箱备用。(2)引物设计根据ncbi公布的qpctl基因序列(genbankaccessionnc_006119.3)设计引物。上游引物p-f：5’-ctggaatgagcccacatccg-3’；下游引物p-r：5’-cacccgacgggatgttatcg-3’。(3)pcr扩增pcr反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的pcr反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mleppendorfpcr管中，然后分别加入模板dna，再瞬时离心后进行pcr扩增；pcr反应体系见表1。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。其中，2×taqpcrmastermix购自北京康为公司。表1pcr反应体系灭菌超纯水(h2o)5.0μl2×taqpcrmastermix3.0μl引物p1-f(10pmol/l)0.5μl引物p1-r(10pmol/l)0.5μl待检测鸡的dna(50ng/μl)1.0μl总体积10.0μl(4)pcr扩增产物的检测及结果判定取7μlpcr扩增产物，2.5％的琼脂糖凝胶电泳(电泳电压：120v；电泳时间：40min)点样，凝胶成像系统检测，根据电泳图谱中出现的条带的大小判定：若有469bp的片段则为aa基因型纯合子；若有417bp的片段，则为bb基因型纯合子；若有245bp的片段，则为cc基因型纯合子；若有469bp、417bp的片段则为ab基因型；若为417bp、245bp片段则为bc基因型；若为469bp、245bp片段则为ac基因型。电泳图谱参见图2，自左至右泳道分别代表和基因型aa、bc、aa、ab、ac、ac、ab、aa、bb、cc、aa的电泳带型和dnamarkeri。对f2分离群体、4个地方品种(卢氏鸡、长顺鸡、固始鸡和淅川鸡)、高产型海兰蛋鸡和快大型罗斯308肉鸡的基因型分型结果如表2所示，对860只f2资源群体0、2、4、6、8、12w体重及体重相关性状的统计分析如表3所示，本发明的基于bonferroni校正进行f检验方法就是把p值都扩大6倍，是非常严格的f检验方法。通过对860只f2资源群体0、2、4、6、8、12w体重及体重相关性状的统计分析表明：在体重上aa、bb和ab基因型相对于cc、bc和ac为优势基因型(表3)。表2不同群体基因型检测结果统计表表3qpctl启动子基因型与f2资源群体重性状的关联结果(5)对qpctl基因的不同基因型(aa、bb、cc)进行测序，测序图如图3所示：图3a为qpctl基因cc基因型测序序列(无背景色的为插入的52bp序列，浅灰色背景的为引物，深灰色背景的为三种基因型都有的序列)，图3b为qpctl基因bb基因型测序序列(无背景色的为插入的三个112bp、96bp和16bp序列，浅灰色背景的为引物，深灰色背景的为三种基因型都有的序列)，图3c为qpctl基因aa基因型测序序列(无背景色的为插入的52bp及三个112bp、96bp和16bp序列，浅灰色背景的为引物，深灰色背景的为三种基因型都有的序列)。(6)待检个体的选择与淘汰依据表2的分析结果，淘汰cc、bc和ac基因型个体，培育纯合中国地方鸡种选留aa、bb基因型个体，和培育杂合中国地方鸡种选留ab基因型个体。将纯合aa、bb个体留种进行扩繁，将形成一个纯合群体；将杂合ab个体留种进行扩繁，将形成一个杂合群体；用于育种。<110>河南农业大学<120>一种鸡体重性状基因诊断试剂盒及其应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<211>469<212>dna<213>鸡<221>qpctl基因启动子a基因型<400>1ctggaatgagcccacatccggggtgacatcggtgctctgggtggcatcgtggttggcagt60gacattccacaggggtgacatcccacaaaagtgacatcccataacggtgacatcctacag120aggtgacatcccattgaggtgacatctcataagggtgacatcccataagggtagcatcct180atggaggtgacatcccaccaaggtggcatcccataagggtgacatcctacaaaggtcaca240tcctacagaggtgacatcccgttggggtgacatcccataaaggtgatatcccattggggt300ggcatcccgtaaaggtgacattccataagggtgacatcctacggagatgacatcccataa360gggtgacatcccaccaaggtgacatcccataaggctgacatcctacagaggtgacatccc420ataagggtgtcatcccgtagaggtgacaacgataacatcccgtcgggtg469<211>417<212>dna<213>鸡<221>qpctl基因启动子b基因型<400>2ctggaatgagcccacatccggggtgacatcccacaaaagtgacatcccataaaggtgaca60tcctacagaggtgacatcccattgaggtgacacctcataagggtgacatcccataagggt120agcatcctatggaggtgacatcccaccaaggtggcatcccataagggtgacatcctacaa180aggtcacatcctacagaggtgacatcccgttggggtgacatcccataaaggtgatatccc240attggggtggcatcccgtaaaggtgacattccataagggtgacatcctacggagatgaca300tcccataagggtgacatcccaccaaggtgacatcccataaggctgacatcctacagaggt360gacatcccataagggtgtcatcccgtagaggtgacaacgataacatcccgtcgggtg417<211>245<212>dna<213>鸡<221>qpctl基因启动子c基因型<400>3ctggaatgagcccacatccggggtgacatcggtgctctgggtggcatcgtggttggcagt60gacattccacaggggtgacatcccacaaaagtgacatcccataaaggtgacatcctacag120aggtgacatcccattgaggtgacatcccgttggtgtgacatcccaccaaggtgacatccc180ataaaggtgacatcccataagggtgtcatcccgtagaggtgacaacgataacatcccgtc240gggtg245<211>20<212>dna<213>人工序列<221>上游引物p-f<400>4ctggaatgagcccacatccg20<211>20<212>dna<213>人工序列<221>下游引物p-r<400>5cacccgacgggatgttatcg20当前第1页12