本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物器官高活性线粒体的快速提取方法及其专用提取液。
背景技术：
花作为被子植物的重要特征之一，由萼片、花瓣、雄蕊(雄蕊群)和雌蕊(雌蕊群)组成，其与植物的生殖过程密切相关，是保证被子植物传粉、受精及顺利结实的重要生殖器官。因此，花部器官作为植物生殖生物学研究的重点对象而备受关注。并且，由于花器官作为植物生殖繁育的重要场所，生命活动旺盛，而线粒体作为能量代谢的重要细胞器，能够进行氧化磷酸化和电子传递等生理活动以响应不同的细胞事件，在植物生殖发育中起着能量供应的重要作用，因此花亦是研究线粒体呼吸和能量代谢的重要组织器官。
目前，提取高活性线粒体用于呼吸，能量代谢及超氧化物水平的研究体系多见在动物研究中的报道，以在心肌细胞和骨骼肌细胞中提取技术较为成熟；然而在植物中，提取线粒体的研究对象主要集中在模式植物拟南芥、水稻及其单细胞的花粉管等，且提取方法过于冗繁。目前研究中大多数植物种类为非模式植物，且研究对象多为植物生理状态活跃的组织和器官，迄今为止，尚无针对非模式植物，特别是针对具重要生殖功能的花部器官进行快速提取高活性线粒体的技术方法，从而导致对植物生殖发育中的花部器官线粒体呼吸乃至植物能量代谢的研究相对滞后，因此，高效活性植物线粒体的提取技术需求迫切且至关重要。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提取植物器官的线粒体的方法。
本发明所提供的植物器官线粒体的提取方法，可包括步骤(x1)：采用提取液提取植物器官中的线粒体；所述提取液中可含有蔗糖、焦磷酸钠、edta、磷酸二氢钾、bsa、半胱氨酸、抗坏血酸和式(ⅰ)所示的聚合物；n为30～50之间的自然数；
式(ⅰ)所示的聚合物即为聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，pvp)。
所述提取液中可含有0.27-0.33m蔗糖、22.5-27.5mm焦磷酸钠、1.8-2.2mmedta、9-11mm磷酸二氢钾、9-11mg/mlbsa、3.6-4.4mm半胱氨酸、18-22mm抗坏血酸和9-11mg/ml式(ⅰ)所示的聚合物。
所述提取液可为含有0.27-0.33m蔗糖、22.5-27.5mm焦磷酸钠、1.8-2.2mmedta、9-11mm磷酸二氢钾、9-11mg/mlbsa、3.6-4.4mm半胱氨酸、18-22mm抗坏血酸和9-11mg/ml式(ⅰ)所示的聚合物的水溶液。所述提取液的ph值可为7.3-7.8(如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8)。
所述提取液具体可为含有0.3m蔗糖、25mm焦磷酸钠、2mmedta、10mm磷酸二氢钾、10mg/mlbsa、4mm半胱氨酸、20mm抗坏血酸和10mg/ml式(ⅰ)所示的聚合物的水溶液，ph值具体可为7.5。
上述提取方法中，所述“采用提取液提取植物器官中的线粒体”的方式可为a1)或a2)：
a1)将植物器官和所述提取液混合，匀浆，收集滤液并差速离心分离植物器官的线粒体；
a2)将植物器官、所述提取液和研磨介质混合，匀浆，收集滤液并差速离心分离植物器官的线粒体。
所述a1)或所述a2)中，植物器官和所述提取液的配比可为1g：1-2ml。
上述任一所述提取液中可含有蔗糖、焦磷酸钠、edta、磷酸二氢钾、bsa、半胱氨酸、抗坏血酸和式(ⅱ)所示的聚合物；
式(ⅱ)所示的聚合物即为pvp-40。
所述提取液中可含有0.27-0.33m蔗糖、22.5-27.5mm焦磷酸钠、1.8-2.2mmedta、9-11mm磷酸二氢钾、9-11mg/mlbsa、3.6-4.4mm半胱氨酸、18-22mm抗坏血酸和9-11mg/ml式(ⅱ)所示的聚合物。
所述提取液可为含有0.27-0.33m蔗糖、22.5-27.5mm焦磷酸钠、1.8-2.2mmedta、9-11mm磷酸二氢钾、9-11mg/mlbsa、3.6-4.4mm半胱氨酸、18-22mm抗坏血酸和9-11mg/ml式(ⅱ)所示的聚合物的水溶液。所述提取液的ph值可为7.3-7.8(如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8)。
所述提取液具体可为含有0.3m蔗糖、25mm焦磷酸钠、2mmedta、10mm磷酸二氢钾、10mg/mlbsa、4mm半胱氨酸、20mm抗坏血酸和10mg/ml式(ⅱ)所示的聚合物的水溶液，ph值具体可为7.5。
上述任一所述的提取方法还可包括步骤(x2)：将步骤(x1)提取的植物器官的线粒体和重悬缓冲液混合，差速离心再次分离植物器官的线粒体；所述重悬缓冲液中可含有蔗糖、tesna(中文名称为n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸单钠盐)和bsa。
所述重悬缓冲液中可含有0.27-0.33m蔗糖、9-11mmtesna和0.9-1.1mg/mlbsa。
所述重悬缓冲液可为含有0.27-0.33m蔗糖、9-11mmtesna和0.9-1.1mg/mlbsa的水溶液。所述重悬缓冲液的ph值可为7.3-7.8(如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8)。
所述重悬缓冲液具体可为含有0.3m蔗糖、10mmtesna和1mg/mlbsa的水溶液，ph值具体可为7.5。
上述任一所述的提取方法还可包括步骤(x3)：采用线粒体呼吸缓冲液保存步骤(x1)或步骤(x2)获得的植物器官的线粒体；所述线粒体呼吸缓冲液中可含有蔗糖、tesna、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁和bsa。
所述线粒体呼吸缓冲液中可含有0.27-0.33m蔗糖、9-11mmtesna、9-11mm氯化钠、4.5-5.5mm磷酸二氢钾、1.8-2.2mm硫酸镁和0.9-1.1mg/mlbsa。
所述线粒体呼吸缓冲液可为含有0.27-0.33m蔗糖、9-11mmtesna、9-11mm氯化钠、4.5-5.5mm磷酸二氢钾、1.8-2.2mm硫酸镁和0.9-1.1mg/mlbsa的水溶液。所述线粒体呼吸缓冲液的ph值可为7.0-7.5(如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)。
所述线粒体呼吸缓冲液具体可为含有0.3m蔗糖、10mmtesna、10mm氯化钠、5mm磷酸二氢钾、2mm硫酸镁和1mg/mlbsa的水溶液，ph值具体可为7.2。
上述提取方法中，所述保存的参数可为：4℃以下保存5h以下(如0℃保存5h、4℃保存3h)。
其中，对于不含叶绿体或叶绿体含量较少植物样品(如本发明实施例中的荷花花托、荷花花被片)，可按照步骤(x1)和(x3)进行提取。对于叶绿体含量较多的植物样品(如本发明实施例中的白玉兰花柱)，可依次按照步骤(x1)、(x2)和(x3)进行提取。
本发明还保护上述任一所述提取液和/或上述任一线粒体呼吸缓冲液和/或上述任一重悬缓冲液。
上述任一所述提取液和/或上述任一线粒体呼吸缓冲液和/或上述任一重悬缓冲液在提取植物器官线粒体中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中，所述植物器官可为b1)至b14)中的任一种：b1)被子植物器官；b2)被子植物花部器官；b3)荷花花部器官；b4)白玉兰花部器官；b5)荷花花被片；b6)荷花雌蕊；b7)荷花花托；b8)荷花花柱；b9)荷花柱头；b10)白玉兰花被片；b11)白玉兰雌蕊；b12)白玉兰花托；b13)白玉兰花柱；b14)白玉兰柱头。
本发明专利由国家自然科学基金(no.31770201)和国家重点研发计划课题(no.2017yfd0600503)共同资助。
实验证明，本发明提供的方法具有如下优点：高效，即线粒体活性高；适用性广，可适用于多种被子植物花部器官线粒体的提取；保存时间长，在冰盒上可保持活性5h，可满足大量关于线粒体能量代谢和呼吸的研究；操作简单耗时短。本发明提供的方法为线粒体呼吸链及能量代谢的研究奠定坚实基础，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为tmrm标记的荷花花托线粒体的观察结果。
图2为mito-soxred标记的荷花花托线粒体的观察结果。
图3为tmrm标记的白玉兰花柱线粒体的观察结果。
图4为mito-soxred标记的白玉兰花柱线粒体的观察结果。
图5为tmrm标记的荷花花被片线粒体的观察结果。
图6为mito-soxred标记的荷花花被片线粒体的观察结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
提取液的溶质及其浓度为0.3m蔗糖、25mm焦磷酸钠、2mmedta、10mm磷酸二氢钾、1％(10mg/ml)pvp-40(中文名称为聚乙烯吡咯烷酮)、1％(10mg/ml)bsa、4mm半胱氨酸和20mm抗坏血酸；提取液的溶剂为蒸馏水；提取液的ph值为7.5。
重悬缓冲液的溶质及其浓度为0.3m蔗糖、10mmtesna(n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸单钠盐)和0.1％(1mg/ml)bsa，重悬缓冲液的溶剂为蒸馏水；重悬缓冲液的ph值为7.5。
线粒体呼吸缓冲液的溶质及其浓度为0.3m蔗糖、10mmtesna(n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸单钠盐)、10mm氯化钠、5mm磷酸二氢钾、2mm硫酸镁和0.1％(1mg/ml)bsa；线粒体呼吸缓冲液的溶剂为蒸馏水；线粒体呼吸缓冲液的ph值为7.2。
下述实施例中，提取线粒体的各个步骤均在4℃以下进行，具体为：提取液、重悬缓冲液和线粒体呼吸缓冲液需4℃预冷；研磨时需在冰盒上进行；收集上清液、滤液和沉淀时需在冰盒上进行。
下述实施例中，用tmrm荧光标记线粒体，以检测线粒体的膜电势。由于具有活性的线粒体均有膜电势并在激光的照射下发出荧光，因此tmrm荧光标记可以检测线粒体活性。
下述实施例中，用mito-soxred荧光标记线粒体，以检测线粒体的活性氧(ros)的产生。由于具有活性的线粒体的生理活动均会产生ros，因此mito-soxred荧光标记可以检测线粒体的能量代谢水平。
tmrm溶液：取荧光染料tmrm(分子式：c25h25cin2o7)，加入dmso溶解，得到荧光染料tmrm浓度为100nm的溶液。
mito-soxred溶液：取mito-soxred(分子式：c43h43n3ip)，加入dmso溶解，得到mito-soxred浓度为2.5μm的溶液。
实施例1、荷花花托线粒体的提取和检测
一、荷花花托线粒体的提取
1、取新鲜荷花花托，用刀片切成小块(体积约为1mm3)，得到荷花花托碎块。
2、取1-2g荷花花托碎块，加入2-4ml4℃预冷的提取液和适量石英砂，然后置于研钵中研磨至匀浆，尼龙网(规格为50μm)过滤，收集滤液。
3、取步骤2收集的滤液，4℃、2000g离心10min，收集上清液。
4、取步骤3收集的上清液，4℃、12000g离心20min，收集沉淀。沉淀即为提取的荷花花托线粒体。
向步骤4收集的沉淀加入300μl4℃预冷的线粒体呼吸缓冲液，重悬，得到荷花花托线粒体重悬液。
二、检测
1、取步骤一得到的荷花花托线粒体重悬液，采用tmrm溶液进行染色。吸取适量染色后的线粒体悬浮液制片，然后在激光共聚焦显微镜下用40×油镜或63×油镜的物镜观察。激发波长为543nm，接收波长范围为550-610nm。
实验结果见图1(左图为tmrm荧光标记的线粒体，右图为荧光标记线粒体与明场线粒体叠加)。结果表明，采用步骤一的方法提取的荷花花托线粒体具有较高的活性。
2、取步骤一得到的荷花花托线粒体重悬液，采用mito-soxred溶液进行染色。吸取适量染色后的线粒体悬浮液制片，然后在激光共聚焦显微镜下用40×油镜或63×油镜的物镜观察。激发波长为543nm，接收波长范围为560-610nm。
实验结果见图2(左图为mito-soxred荧光标记的线粒体，右图为荧光标记线粒体与明场线粒体叠加)。结果表明，采用步骤一的方法提取的荷花花托线粒体具有较高的活性氧(ros)水平。
实施例2、白玉兰花柱线粒体的提取和检测
1、取新鲜白玉兰花柱，用刀片切成小块(体积约为1mm3)，得到白玉兰花柱碎块。
2、取1-2g白玉兰花柱碎块，加入2-4ml4℃预冷的提取液和适量石英砂，然后置于研钵中研磨至匀浆，尼龙网(规格为50μm)过滤，收集滤液。
3、取步骤2收集的滤液，4℃、2000g离心10min，收集上清液。
4、取步骤3收集的上清液，4℃、12000g离心20min，收集沉淀。
5、取步骤4收集的沉淀，加入1ml4℃预冷的重悬缓冲液，重悬，得到重悬液。
6、取步骤5得到的重悬液，4℃、1500g离心5min，收集上清液。
7、取步骤6收集的上清液，4℃、12000g离心20min，收集沉淀。该沉淀即为提取的白玉兰花柱线粒体。
向步骤7收集的沉淀加入300μl4℃预冷的线粒体呼吸缓冲液，重悬，得到白玉兰花柱线粒体重悬液。
二、检测
1、取步骤一得到的白玉兰花柱线粒体重悬液，采用tmrm溶液进行染色。吸取适量染色后的线粒体悬浮液制片，然后在激光共聚焦显微镜下用40×油镜或63×油镜的物镜观察。激发波长为543nm，接收波长范围为550-610nm。
实验结果见图3(左图为tmrm荧光标记的线粒体，右图为荧光标记线粒体与明场线粒体叠加)。结果表明，采用步骤一的方法提取的白玉兰花柱线粒体具有较高的活性。
2、取步骤一得到的白玉兰花柱线粒体重悬液，采用mito-soxred溶液进行染色。吸取适量染色后的线粒体悬浮液制片，然后在激光共聚焦显微镜下用40×油镜或63×油镜的物镜观察。激发波长为543nm，接收波长范围为560-610nm。
实验结果见图4(左图为mito-soxred荧光标记的线粒体，右图为荧光标记线粒体与明场线粒体叠加)。结果表明，采用步骤一的方法提取的白玉兰花柱线粒体具有较高的活性氧(ros)水平。
实施例3、荷花花被片线粒体的提取和检测
一、荷花花被片线粒体的提取
1、取新鲜荷花花被片，用刀片切成小块(体积约为1mm3)，得到荷花花被片碎块。
2、取1-2g荷花花被片碎块，加入2-4ml4℃预冷的提取液和适量石英砂，然后置于研钵中研磨至匀浆，尼龙网(规格为50μm)过滤，收集滤液。
3、取步骤2收集的滤液，4℃、2000g离心10min，收集上清液。
4、取步骤3收集的上清液，4℃、12000g离心20min，收集沉淀。沉淀即为提取的荷花花被片线粒体。
向步骤4收集的沉淀加入300μl4℃预冷的线粒体呼吸缓冲液，重悬，得到荷花花被片线粒体重悬液。
二、检测
1、取步骤一得到的荷花花被片线粒体重悬液，采用tmrm溶液进行染色。吸取适量染色后的线粒体悬浮液制片，然后在激光共聚焦显微镜下用40×油镜或63×油镜的物镜观察。激发波长为540nm，接收波长范围为550-610nm。
实验结果见图5(左图为tmrm荧光标记的线粒体，右图为荧光标记线粒体与明场线粒体叠加)。结果表明，采用步骤一的方法提取的荷花花被片线粒体具有较高的活性。
2、取步骤一得到的荷花花被片线粒体重悬液，采用mito-soxred溶液进行染色。吸取适量染色后的线粒体悬浮液制片，然后在激光共聚焦显微镜下用40×油镜或63×油镜的物镜观察。激发波长为543nm，接收波长范围为560-610nm。
实验结果见图6(左图为mito-soxred荧光标记的线粒体，右图为荧光标记线粒体与明场线粒体叠加)。结果表明，采用步骤一的方法提取的荷花花被片线粒体具有较高的活性氧(ros)水平。