本发明属于海洋真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法。
背景技术：
先前发明人从海洋真菌penicilliumsp.hk1-6中分离得到系列penicilone类化合物——penicilonesa-d，并发现penicilonesa-d对耐药菌(如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌)显示出很强的抗菌活性，表明penicilonesa-d具有被开发为抗耐药菌药物的良好前景。为了解决penicilonesa-d的药源问题，发明人对海洋真菌penicilliumsp.hk1-6的发酵、分离条件进行了优化，得到了一种可大规模制备penicilonesa-d的方法。
技术实现要素：
海洋真菌penicilliumsp.hk1-6的菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年7月5日；保藏编号：cgmccno.12762；分类命名：青霉penicilliumsp.。菌株保藏信息可参见，在先中国发明专利申请(申请号cn201610831163.3)。
本发明所述的海洋真菌penicilliumsp.hk1-6来源于红树林根际土壤(参见：中国专利申请cn201610831163.3)。
penicilonesa-d(即化合物1-4)，结构如下：
本发明提供一种制备化合物1-4的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)先在菌种培养基中对海洋真菌penicilliumsp.hk1-6进行菌种培养；
(2)再在发酵培养基中对步骤(1)中的海洋真菌penicilliumsp.hk1-6进行发酵培养；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用有机溶剂a萃取1～5次，优选3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用有机溶剂b浸提1～5次，优选3～5次，合并浸提液后减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏后，经过减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3-6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分fr.1～fr.10(即100％石油醚洗脱为组分fr.1，80％石油醚洗脱为组分fr.2，依此类推，0％石油醚洗脱组分为fr.10)；
(4)组分fr.4先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂为meoh∶h2o＝85∶15，最后得到化合物4；组分fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，得化合物2；组分fr.8先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂meoh∶h2o＝75∶25，最后经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，分别得到化合物1和3。本发明制备方法中涉及洗脱剂、流动相等比例的均指体积比。
其中所述菌种培养基和发酵培养基各自独立地选自液体或固体的gpy培养基、或液体或固体的pda培养基。
固体pda培养基：每1000ml水中，土豆200g(煮沸取汁)，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g，琼脂12-20g。
液体pda培养基：每1000ml水中，土豆200g(煮沸取汁)，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g。
固体gpy培养基：每1000ml水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g，琼脂12-20g。
液体gpy培养基：每1000ml水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g。
本发明上述制备方法中，所述的有机溶剂a优选乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或乙醚中的一种或几种；所述的有机溶剂b优选甲醇、乙醇、thf或丙酮中的一种或几种。
本发明上述制备方法步骤(1)中菌种培养温度优选为15-25℃；培养时间优选为2-10天，进一步优选为3、5、7天，菌种培养方式选自静置培养或摇床培养；步骤(2)中发酵培养温度优选为15-30℃，进一步优选20-25℃；培养时间优选为20-40天，进一步优选21、24、28、30、32、35天，发酵培养方式选自静置培养或摇床培养；步骤(4)中所述的正相硅胶柱层析中采用的固定相的硅胶目数为100～200目、200～300目或300～400目，优选200～300目。
本发明的优点在于利用海洋真菌penicilliumsp.hk1-6制备penicilonesa-d，每升发酵液中可分离得到几十毫克penicilonea、b，而且本发明制备方法简便易行，利于工业化大生产，利用100l的发酵罐生产，产量可达克级以上，有效地解决了penicilonesa-d的来源问题，有利于penicilones类药物的开发。
附图说明
图1化合物3的1hnmr(600mhz，cdcl3)图；
图2化合物3的13cnmr(150mhz，cdcl3)图；
图3化合物3的hsqc(cdcl3)图；
图4化合物3的1h-1hcosy(cdcl3)图；
图5化合物3的hmbc(cdcl3)图；
图6化合物3的noesy(cdcl3)图；
图7化合物4的1hnmr(600mhz，cdcl3)图；
图8化合物4的13cnmr(150mhz，cdcl3)图；
图9化合物4的hsqc(cdcl3)图；
图10化合物4的1h-1hcosy(cdcl3)图；
图11化合物4的hmbc(cdcl3)图；
图12化合物4的noesy(cdcl3)图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)海洋真菌penicilliumsp.hk1-6菌种的培养
真菌penicilliumsp.(hk1-6)的菌种培养所用的培养基为固体pda培养基(每1000ml水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖15g，海水素30g，琼脂12g)；使用时倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板。真菌菌株penicilliumsp.(hk1-6)接种于培养基平板中，在25℃下摇床培养5天。
(2)海洋真菌penicilliumsp.hk1-6的发酵
真菌penicilliumsp.hk1-6的发酵培养所用的发酵培养基为液体pda培养基，每1000ml水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖20g，海水素35g；使用时分装于锥形瓶中。真菌菌株接种于锥形瓶的培养基中，于15-20℃静置培养28天。
(3)发酵物中成分的初步分离
取步骤(2)所得的发酵物30l，将发酵液和菌体分离后，发酵液用乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用甲醇浸提3～5次，减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，先进行减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3-6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分fr.1～fr.10(即100％石油醚洗脱为组分fr.1，80％石油醚洗脱为组分fr.2，依此类推，0％石油醚洗脱组分为fr.10)。
(4)penicilonesa-d(即化合物1-4)的分离提取
将步骤(3)得到的组分fr.4先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂为meoh∶h2o＝85∶15，最后得到peniciloned即化合物4(135mg)；组分fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，最后得到peniciloneb即化合物2(702mg)；组分fr.8先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂meoh∶h2o＝75∶25，最后经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，分别得到penicilonea即化合物1(1.55g)和penicilonec即化合物3(121mg)。
penicilonea(1)：uv(meoh)λmax＝332，224nm；cd(0.08mm，meoh)λmax(δε)356(7.3)，270(-3.3)nm；ir(kbr)vmax3415，2925，2854，1703，1635，1453，1377，1321，1099，873cm-1；1hnmr(cdcl3，600mhz)and13cnmr(cdcl3，150mhz)，见表1；hresimsm/z497.2536(calcdforc29h37o7，497.2534)，519.2353(calcdforc29h36o7na，519.2353).
peniciloneb(2)：uv(meoh)λmax＝336，221nm；cd(0.09mm，meoh)λmax(δε)358(9.4)，274(-4.8)nm；ir(kbr)vmax3265，2924，2853，1703，1614，1462，1366，1321，1289，1232，1124，1086，872cm-1；1hnmr(cdcl3，600mhz)and13cnmr(cdcl3，150mhz)，见表1；hresimsm/z479.2437(calcdforc29h35o6，479.2428).
penicilonec(3)：uv(meoh)λmax＝340，222nm；cd(0.05mm，meoh)λmax(δε)365(-7.2)，231(9.7)nm；ir(kbr)vmax3293，2925，2854，1703，1640，1531，1378，1244，1129，1069，891cm-1；hresimsm/z531.2152(calcdforc29h36clo7，531.2144)，553.1973(calcdforc29h35clo7na，553.1964).
peniciloned(4)：uv(meoh)λmax＝347，220nm；cd(0.08mm，meoh)λmax(δε)366(-9.1)，231(11.1)nm；ir(kbr)vmax3408，2925，2853，1705，1627，1527，1465，1326，1132，1096，997cm-1；hresimsm/z513.2057(calcdforc29h34clo6，513.2038).
表1.化合物1和2的1h(600mhz)and13c(150mhz)nmr(cdcl3)数据
实施例2
(1)海洋真菌penicilliumsp.hk1-6菌种的培养
真菌penicilliumsp.(hk1-6)的菌种培养所用的培养基为固体gpy培养基(每1000ml水中：蛋白胨5g，酵母膏1g，葡萄糖20g，海水素20g，琼脂20g)；使用时倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板。真菌菌株penicilliumsp.(hk1-6)接种于培养基平板中，在20℃下静置培养7天。
(2)海洋真菌penicilliumsp.hk1-6的发酵
真菌penicilliumsp.hk1-6的发酵培养所用的发酵培养基为液体gpy培养基，每1000ml水中加入：蛋白胨3g，酵母膏2g，葡萄糖15g，海水素40g；使用时分装于锥形瓶中。真菌菌株接种于锥形瓶的培养基中，于20-25℃摇床培养24天。
(3)发酵物中成分的初步分离
取步骤(2)所得的发酵物50l，将发酵液和菌体分离后，发酵液用乙醚萃取3次，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用乙醇浸提2次，减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，先进行减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3-6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分fr.1～fr.10(即100％石油醚洗脱为组分fr.1，80％石油醚洗脱为组分fr.2，依此类推，0％石油醚洗脱组分为fr.10)。
(4)penicilonesa-d(即化合物1-4)的分离提取
将步骤(3)得到的组分fr.4先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂为meoh∶h2o＝85∶15，最后得到peniciloned即化合物4(230mg)；组分fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，最后得到peniciloneb即化合物2(1.22g)；组分fr.8先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂meoh∶h2o＝75∶25，最后经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，分别得到penicilonea即化合物1(2.65g)和penicilonec即化合物3(210mg)。
实施例3
(1)海洋真菌penicilliumsp.hk1-6菌种的培养
真菌penicilliumsp.(hk1-6)的菌种培养所用的培养基为固体pda培养基(每1000ml水中：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖20g，海水素40g，琼脂20g)；使用时倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板。真菌菌株penicilliumsp.(hk1-6)接种于培养基平板中，在20℃下静置培养3天。
(2)海洋真菌penicilliumsp.hk1-6的发酵
真菌penicilliumsp.hk1-6的发酵培养所用的发酵培养基为液体gpy培养基，每1000ml水中加入：蛋白胨3g，酵母膏1g，葡萄糖20g，海水素30g；使用时分装于锥形瓶中。真菌菌株接种于锥形瓶的培养基中，于20℃摇床培养24天。
(3)发酵物中成分的初步分离
取步骤(2)所得的发酵物10l，将发酵液和菌体分离后，发酵液用乙醚萃取5次，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用乙醇浸提5次，减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，先进行减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3-6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分fr.1～fr.10(即100％石油醚洗脱为组分fr.1，80％石油醚洗脱为组分fr.2，依此类推，0％石油醚洗脱组分为fr.10)。
(4)penicilonesa-d(即化合物1-4)的分离提取
将步骤(3)得到的组分fr.4先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂为meoh∶h2o＝85∶15，最后得到peniciloned即化合物4(48mg)；组分fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，最后得到peniciloneb即化合物2(247mg)；组分fr.8先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂meoh∶h2o＝75∶25，最后经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，分别得到penicilonea即化合物1(531mg)和penicilonec即化合物3(52mg)。
实施例1-3中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。
实施例4
在菌种培养基中对海洋真菌penicilliumsp.hk1-6进行菌种培养，再在发酵培养基中对上述海洋真菌进行发酵培养，将发酵液和菌体分离后，发酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙醚或热水中的一种或几种萃取，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用甲醇、乙醇、thf、丙酮或热水中的一种或几种浸提，浸提液减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，进行减压硅胶柱层析，洗脱剂依次采用石油醚∶乙酸乙酯＝100∶0至0∶100的梯度进行洗脱，将其按照极性大小分成10个组分fr.1～fr.10；组分fr.4先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂为meoh∶h2o＝85∶15，最后得到化合物4；组分fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，得化合物2；组分fr.8先经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为chcl3∶meoh＝1∶1，再经ods反相硅胶柱层析，洗脱剂meoh∶h2o＝75∶25，最后经高效液相色谱hplc制备(所用色谱柱为agilentc18，9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15)，分别得到化合物1和3。化合物1-4(结构确证数据与实施例1一致)，其中所述菌种培养基和发酵培养基各自独立地选自液体或固体的gpy培养基、或液体或固体的pda培养基。
为了探索更广泛的适用于本发明制备化合物1-4的方法，本实施例中菌种培养基、发酵培养基中各成分的添加，均按本领域中常规比例添加或按任意比例添加。实验结果表明，上述常规选择的制备方法，均能得到化合物1-4，区别仅仅在于得到的化合物1-4的质量的不同。
实施例1-4的结果表明，按照本领域常规的菌种培养、发酵条件，常规的色谱分离或重结晶的条件对海洋真菌penicilliumsp.hk1-6进行菌种培养、发酵、分离纯化，均能得到化合物1-4。
实施例5本发明的化合物1-4的抗菌活性的测定
本发明的化合物按照文献方法(piercec.g.；uppulurip.；teistana.r.；wormleyjr.f.l.；mowate.；ramageg.；lopez-ribotj.l.nat.protoc.2008，3，1494-1500)，测试6株革兰氏阳性菌：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌2株：s.aureusatcc43300和s.aureusatcc33591，敏感型金黄色葡萄球菌2株：s.aureusatcc25923和s.aureusatcc29213，耐万古霉素的粪肠球菌1株：e.faecalisatcc51299，敏感型屎肠球菌1株：e.faeciumatcc35667；1株革兰氏阴性菌：大肠杆菌e.coliatcc25922。本发明化合物1-4对大肠杆菌e.coliatcc25922没有明显抗菌效果，但是对革兰氏阳性菌，尤其是对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌：s.aureusatcc43300和s.aureusatcc33591以及万古霉素耐药的粪肠球菌：e.faecalisatcc51299均显示出很强的抗菌活性，其最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)均小于或等于3.13μg/ml，对e.faecalisatcc51299的mic比阳性药万古霉素强1-3倍，显示出了将其开发作为抗耐药菌药物、药物先导化合物以及候选药物的良好前景。表2中仅列出化合物3-4的抗菌活性数据。
表2本发明的化合物3-4的抗菌活性数据
参考文献：
1.gao，j.m.；yang，s.x.；qin，j.c.，chem.rev.2013，113，4755-4811.
2.osmanova，n.；schultze，w.；ayoub，n.，phytochem.rev.2010，9，315-342.
3.中国专利申请号cn201610831163.3
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。本发明中所使用的中英文简称、代号等均可在参考文献或现有技术的技术手册、教科书、工具书中找到。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。