无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法与流程

文档序号：15224324发布日期：2018-08-21 17:56阅读：574来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体plq2a及制备方法。

背景技术：

植物乳杆菌（lactobacillusplantarum，l.plantarum）作为一种肠道宿主菌株可耐受胃内低ph值、高盐的环境，最适生长温度为30-37℃，能耐受10℃左右的低温，但在45℃以上的环境中出现生长抑制，常见于奶油、肉类、蔬菜等制成的发酵食品并可从多数植物中分离得到，故因此得名。研究表明，植物乳杆菌符合美国食品与药品管理局（fda）的gras（generallyrecognizedassafe）规定以及欧洲食品安全局（efsa）的安全资格认证（qualifiedpresumptionofsafety）标准，通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用，利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白表达系统，以其作为口服药用蛋白载体很大程度上解决了蛋白易在消化道中发生水解的问题，从而使多种口服药用蛋白都能有效地发挥防治疾病的作用。

psip409系列质粒是植物乳杆菌特有的穿梭质粒载体，由于它具备puc来源于大肠杆菌（escherichiacoli，e.coli）和256rep来源于植物乳杆菌两个复制子，因此它可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达。但该系列质粒载体使用了红霉素抗性基因(erythromycin，em)作为筛选标记，一旦抗性基因转移到宿主染色体内，很可能产生严重的生物安全隐患，因此该系统潜在的应用价值受到了限制。另外，nguyen等认为红霉素在酸性条件下会发生降解，这对外源基因的诱导表达造成了不利的影响。红霉素也会使菌体产生“生理应激”，从而影响目的基因表达。所以我们要用非抗生素筛选标记代替该载体的抗生素抗性基因并使改建后载体能在受体菌植物乳杆菌nc8/δalr（l.plantarumnc8/δalr）中稳定复制表达外源蛋白，从而使我们的乳酸菌制品达到对机体无害要求。

丙氨酸消旋酶（alanineracemase，alr）基因广泛存在于原核生物基因组中，该基因可将l-丙氨酸转化为d-丙氨酸，d-丙氨酸是细胞壁中重要的交联成分，是菌株生长的必需物质，因此该酶对原核细胞的生长至关重要。虽然绝大多数微生物都含有两种丙氨酸消旋酶基因：生物合成型（biosyntheticalanineracemase，alr)和代谢型（catabolicalanineracemase，dadx/b），但对于乳酸乳球菌和乳酸杆菌来说，丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通mrs培养基中不生长，只有在额外添加d-丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通mrs培养基中不生长，只有在额外添加d-丙氨酸的培养基中生长，利用alr基因作为筛选标记相关研究在国外已有成功的范例，在选择压力下，带有alr标记的质粒具有较高的稳定性，并且在绝大多数发酵培养基中不会出现d-丙氨酸，因此本研究采用alr基因作营养互补型植物乳杆菌非抗生素性筛选标记。

大肠杆菌asd基因编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶，是二氨基庚二酸(dap)合成途径中的关键酶，dap是革兰氏阴性菌细胞壁上肽聚糖的基本成分，asd基因发生缺失突变后，由于不能合成细胞壁而导致溶菌死亡。因此选用大肠杆菌asd基因缺失株e.coli6212/δasd作为中间宿主菌，可以解决植物乳杆菌连接转化效率低，很难筛选到阳性重组子的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为解决植物乳杆菌细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌及植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，而提供一种既能在e.coli6212/δalr中复制又能在l.plantarumnc8/δalr中锚定表达的无抗性筛选锚定表达载体plq2a。

植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体plq2a，其碱基序列如seqidno.1所示。

植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体plq2a的制备方法，它包括：

1）双锚定表达载体命名为psip409pgsa’-1261的制备

参照质粒plp-1261inv上lp-1261基因序列设计含有同源手臂端的无缝克隆引物，并在lp-1261的上游添加sd序列（aggaaacagacc）和hindⅲ酶切位点，下游添加sali和hindⅲ酶切位点，扩增含有同源手臂端298bp的lp-1261序列，引物序列如下：

1261f:ttcgaaggcgccaagcttaggaaacagaccatgaatttcaaaacagct

1261r:cacgtgctgtaatttgaagcttgtcgaccgccgcaatcgtgcc；

将锚定表达载体psip409pgsa’用hindⅲ单酶切，获得线性化载体psip409pgsa’（hindⅲ）6202bp；将锚定序列lp-1261与psip409pgsa’无缝克隆连接，将连接产物化学法转化e.colitop10感受态细胞，利用红霉素抗性基因筛选阳性克隆，获得双锚定表达载体命名为psip409pgsa’-1261；

2）p23-alr-asd基因制备

参照pya4545载体asd基因序列，ncbi公布的p23启动子和植物乳杆菌alr基因序列将asd基因，p23启动子和alr基因串联，获得p23-alr-asd基因并人工合成（大小3027bp），其碱基序列如seqidno.2所示；

3）用p23-alr-asd基因替换载体psip409pgsa’-1261上红霉素（em）基因获得无抗性筛选标记锚定表达载体plqa

用p23-alr-asd基因替换载体psip409pgsa’-1261上红霉素基因，参照基因序列psip409pgsa’-1261设计引物，扩增去除红霉素基因5405bp的409pgsa’-1261片段，引物如下：

lpsf:ttctatgagtcgcttttttaaatttg

lpsr:ggatcccgcacgcatagcggtgc；

将扩增的409pgsa’-1261纯化后与p23-alr-asd无缝克隆连接，电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，铺普通lb固体培养基，利用asd基因与宿主菌实现营养互补筛选阳性克隆，测序鉴定正确的双抗原锚定表达质粒命名为plqa；

4）plq2a载体构建

引入三个hindⅲ酶切位点，将alr基因内的hindⅲ酶切位点aagctt突变为aaactt，点突变引物如下：

hindf:ccagtctctggcatcaaacttgcaatggcaac

hindr:tttgatgccagagactggtggccgaattggac；

同时载体上还含有两处sali酶切位点，将alr基因下游的sali酶切位点gtcgac突变gtagac，引物如下：

1261attf:cactacctgatgttgtagacgaaaagccctgac

1261attr:tacaacatcaggtagtgacacttctttgacctg；

以质粒plqa为模板pcr扩增产物纯化后，用dpni限制性内切酶处理后，电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，经过两次突变后的筛选阳性载体命名为plq2a，载体总计8432bp。

发明详述：由于植物乳杆菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌有一定的难度，如果将连接产物直接电转化效率更低，很难筛选到阳性重组子，甚至筛选不出来重组子，笔者在利用植物乳杆菌作为宿主菌构建无抗性筛选表达载体遇到了同样问题，所以选用比较容易筛选阳性重组子的革兰氏阴性菌大肠杆菌asd基因缺失株e.coli6212/δasd作为中间宿主菌，将asd-alr基因串联替换植物乳杆菌诱导表达载体上红霉素标记基因，连接产物先电转化入asd基因缺失株e.coli6212/δasd，利用质粒上的asd基因与宿主菌e.coli6212/δasd营养互补筛选阳性重组质粒，之后将阳性质粒再电转化至alr缺失l.plantarumnc8/δalr，利用质粒上的alr基因与l.plantarumnc8/δalr营养互补筛选阳性重组质粒，解决了植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，同时实现了无抗性筛选目的。

跨膜结构域锚定模型聚-γ-谷氨酸合成酶a（poly-γ-glutamicacidsynthetasea，pgsa）是枯草芽孢杆菌（bacillussubtilic）多聚谷氨酸合成酶系统pga的组成蛋白，它可以作为一种细菌表面展示元件将该酶系统稳定地锚定在细胞壁表面。脂蛋白锚定模型lp_1261（lipoproteinanchor）是植物乳杆菌abc转运体底物结合蛋白（peptideabctransportersubstrate-binding）能将外源蛋白稳定的锚定表达在植物乳杆菌表面，本发明利用pgsa和lp_1261两种锚定模型，在其间添加了sd序列，并通过营养互补筛选标记alr-asd将两种荧光蛋白egfp和mcherry同时锚定表达在植物乳杆菌表面，实现了双抗原共同锚定表达，拓宽了乳酸菌作为载体表达外源基因的应用，为进一步研究乳酸菌作为口服药用蛋白载体的应用奠定基础，构建无抗性筛选锚定表达载体plq2a实现了即能在e.coli6212/δalr中复制又能在l.plantarumnc8/δalr中锚定表达双抗原。

本发明提供了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体plq2a，它是生物安全外源蛋白表达系统，以asd缺失株e.coli6212/δasd和alr缺失l.plantarumnc8/δalr为宿主菌，将来源于乳酸乳球菌（lactococcuslactissubsp.cremorisstrainjm4）基因组上p23启动子作为alr基因表达的启动子，以pya4545，pya4545-mcherry，plp-1261inv，psip409pgsa’，psip409pgsa’-il-10，psip409pgsa’-egfp为基础载体，构建以pgsa’和lp-1261为双锚定模型的营养互补筛选标记大肠杆菌-乳酸菌无抗锚定表达载体plq2a，并以egfp及mcherry作为报告基因进行筛选及锚定表达验证。

附图说明

图1质粒409eat和409eatf用psti和sali双酶切电泳图，（m：dl5000dna分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-2：409eatf质粒酶切，载体片段长度4436bp和p23alrtf长度1336bp；3-4：409eat质粒酶切，载体片段4436bp和p23alrt长度1312bp；

图2409eatf电转l.plantarumnc8/δalr1号和3号菌的westernblotting结果，m:蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kda、50kda、40kda、20kda；1：阴性对照l.plantarumnc8/δalr；2：l.plantarumnc8/δalr409eatf1；3：l.plantarumnc8/δalr409eatf3；4：阴性对照l.plantarumnc8/δalr上清；5：l.plantarumnc8/δalr409eatf1上清；6：l.plantarumnc8/δalr409eatf3上清；

图3e.coli6212/δasd-409ata菌落pcr鉴定，m：dl5000dna分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-8：e.coli6212/δasd-409ata单菌落；9阴性对照；

图4409ata质粒hindⅲ单酶切电泳图，m：dl5000dna分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1：409ata质粒酶切，大片段长度4305bp和小片段长度2035bp；

图5409ata电转l.plantarumnc8/δalr质粒小量制备结果，m：dl5000dna分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-4：l.plantarumnc8/δalr-409ata单菌1-4号；

图6l.plantarumnc8/δalr-psip409pgsa’-egfpat荧光显微镜观察结果；

图7l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m荧光显微镜观察结果，a：l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m绿色荧光蛋白发光观察；b：l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m红色荧光蛋白发光观察；c：l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m绿色和红色荧光蛋白发光观察merged图片；d：阴性对照l.plantarumnc8/δalr绿色荧光蛋白发光；e：阴性对照l.plantarumnc8/δalr红色荧光蛋白发光；f：阴性对照l.plantarumnc8/δalr绿色和红色荧光蛋白发光观察merged图片；

图8l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m反复冻融方法提取菌体膜蛋白用鼠抗egfp单抗为一抗westernblot结果，m:蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kda、55kda、40kda；阴1：阴性对照l.plantarumnc8/δalr；阴2：阴性对照l.plantarumnc8/δalr-psip409pgsa’a；1-3：l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m1-3号菌；

图9l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m反复冻融方法提取菌体膜蛋白用鼠抗his单抗为一抗westernblot结果，m:蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kda、55kda、40kda；阴1：阴性对照l.plantarumnc8/δalr；阴2：阴性对照l.plantarumnc8/δalr-psip409pgsa’a；1-3：l.plantarumnc8/δalr-plq2a1-3号；

图10质粒plq2a线性载体片段结果：（a）为用sali和xbai单酶切出8432bp线性载体片段结果，（b）为用hindⅲ单酶切酶出8168bp和264bp的片段结果，m1:：dl10000dna分子量标准，从上到下分子量依次为：10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp，其中2000bp加亮；m2：dl5000dna分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1、2、5：质粒plq2a；3、4：plq2a用分别用sali和xbai单酶切出8432bp线性载体片段；6：plq2a用hindⅲ单酶切出8168bp和264bp的片段；

图11无抗性筛选双抗原锚定表达载体plq2图谱。

具体实施方式

实施例1用alr-em双标记载体409eatf内alr基因与宿主菌l.plantarumnc8/δalr营养互补筛选验证

（1）psip409pgsa’-il-10双酶切

用sali和psti双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收载体上含有红霉素和复制子的4436bp基因片段，片段的碱基序列如seqidno.6所示。

（2）alrt与alrtf基因扩增

提取l.plantarumnc8株基因组，以其为模板，设计引物，引物alr基因内含有sali酶切位点，不便于载体构建，所以设计时将引物延长，这样即能将alr扩增出来，又能将其突变，将酶切位点中第一个c突变为g，扩增的基因命名alrt（1149bp）。为了检测alr基因回归植物乳杆菌后表达情况，另外设计在alr基因序列3’端添加了flag标签引物，便于alr基因表达检测，扩增的基因命名为alrtf（1176bp）。

引物如下：

alrtf：atggttgtaattggggagcaccgccacacacaagtcacagtggact（alr基因内含有sali酶切位点，将c突变为g）

alrtr：gatcatttggcgtgcctgcagttaatctatataaactctcg（下划线标注为载体上的同源序列，斜体标注为psti酶切位点）

alrtfr：gatcatttggcgtgcctgcagttatttgtcatcgtcatctttgtagtcatctat

ataaactctcg（下划线标注为载体上的同源臂，斜体标注为psti酶切位点，灰色标记为flag标签）

a.pcr反应体系如下：

b.pcr反应条件如下：

（3）乳酸乳球菌启动子p23与alr基因融合

1）启动子p23扩增

以合成的含p23启动子基因序列的puc57-pori23fnbpa为模板，扩增含有同源臂的启动子序列。

p23f：gaatggagaccggggtcgacgaaaagccctgacaaccctc（下划线为与载体上sali酶切位点上游同源序列，斜体标注为sali酶切位点）

p23r：gtggcggtgctccccaattacaaccataacatcattgtcattcat（下划线部分为与alrt（alrtf）基因同源序列）

a.pcr反应体系如下：

b.pcr反应条件如下：

2）启动子p23分别与alrt、alrtf基因做soe-pcr

使用引物p23f和alrtr、alrtfr分别融合出两段基因p23alrt（1355bp）、p23alrtf（1382）琼脂糖凝胶回收融合片段。

a.pcr反应体系如下：

b.pcr反应条件如下：

（4）p23alrt、p23alrtf基因与psip409pgsa’-il-10（psti和sali双酶切）片段载体连接

p23alrt、p23alrtf与psip409pgsa’-il-10载体（用psti和sali双酶切）使用无缝克隆试剂盒（seamlessassemblycloningkit购自中美泰和生物技术北京有限公司）连接，cacl2法转化入大肠杆菌topo10感受态细胞，涂布红霉素lb固体培养基，质粒小量制备后酶切鉴定，切出载体片段4436bp和1312bp的p23alrt（p23alrtf大小1336bp）电泳见图1，将酶切阳性质粒测序鉴定，结果比对后测序同源性100%，分别命名为409eat和409eatf。将测序正确质粒409eat和409eatf分别电转化入alr基因缺陷l.plantarumnc8/δalr感受态细胞，利用红霉素抗性基因和营养互补基因筛选阳性重组子命名为l.plantarumnc8/δalr-409eat和l.plantarumnc8/δalr-409eatf。

连接体系如下：

（5）westernblotting检测alr基因回归宿主菌表达丙氨酸消旋酶

采用flag标签抗体检测alr基因回归宿主菌表达丙氨酸消旋酶情况。挑取表达flag标签的l.plantarumnc8/δalr-409eatf单克隆种于含有5µg/ml红霉素的液体mrs培养基中过夜培养，转接液体mrs培养基（以菌液：培养基=1:50）待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，超声破碎处理样品，westernblotting一抗使用兔抗flag标签单克隆抗体室温孵育2h，二抗使用hrp标记羊抗兔igg室温孵育1h，tbst洗膜三次后显色，蛋白大小约42.4kd，表明alr基因成功表达，l.plantarumnc8/δalr转入质粒409eatf能完成营养互补，在不添加d-丙氨酸的mrs培养基中能够生长，达到筛选阳性重组子的目的，结果见图2。

实施例2营养互补型asd-alr双标记质粒载体409ata构建及在e.coli6212/δasd和l.plantarumnc8/δalr无抗性筛选验证

（1）质粒409eat用bamhi和sali双酶切，回收含有复制子和alr基因片段4625bp，碱基序列如seqidno.7所示。

（2）扩增asd基因，以pya4545质粒为模板，引物如下，扩含有同源弊端的片段1758bp。

pasd正f:cgctatgcgtgcgggatcctcttccctaaatttaaatataaac（下划线为与载体同源序列，斜体标记bamhi）

pasdr:gggttgtcagggcttttcgtcgacaacatcaggtagtgaca（下划线为与载体同源序列，斜体标记sali）

a.pcr反应体系如下：

b.pcr反应条件如下：

（3）asd基因与409eat（bamhi和sali双酶切）连接，连接产物电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，无抗性筛选阳性重组子，长出单菌落，菌落pcr鉴定结果电泳如图3，阳性菌小量制备质粒，重组质粒命名为409ata，质粒上有两个hindⅲ酶切位点，酶切鉴定结果如图4，吉林省库美生物科技有限公司测序鉴定，测序正确质粒电转化l.plantarumnc8/δalr，挑取单克隆质粒小量制备409ata电泳结果如图5。

连接体系如下：

实施例3无抗筛选锚定共锚定表达egfp和mcherry验证

（1）无抗筛选单锚定表达egfp质粒psip409pgsa’-egfpat构建及验证

1）以质粒psip409pgsa’-egfp为基础，将载体上em基因用asd-alr替换。参照409ata基因序列设计含有同源序列的无缝克隆引物，设计的引物具有通用性，引物上游参照载体上“256rep”复制子设计，利用此引物采用无缝克隆连接的方法可以将此系列载体上的红霉素用asd-alr基因替换，构建出无抗性筛选的表达载体，扩增出来的片段命名为256-asd-alr，片段大小3719bp，碱基序列如seqidno.8所示；在扩增时候添加了同源臂所以扩增出来的片段大小3765bp。

扩增256-asd-alr基因引物如下：

409ataf:gcagcgagtcagtgagcgagaaggattattcggctggttg（下划线为同源序列）

409atar:caaatttaaaaaagcgactcatagaattaatctatataaactctcg（下划线为同源序列）

a.pcr反应体系如下：

b.pcr反应条件如下：

2）参照psip409pgsa’-egfp基因序列设计引物，扩增片段5132bp的409p’-egfp片段

409p’egfp测f：5'ttctatgagtcgctttttt3'

409p’egfp测r：5'ctcgctcactgactcgctg3'

a.pcr反应体系如下：

b.pcr反应条件如下：

3）256-asd-alr基因与409p’-egfp无缝克隆连接，电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，涂布lb固体培养基，37℃过夜培养，挑取单克隆，质粒小量制备后，将阳性质粒命名为psip409pgsa’-egfpa，阳性质粒大小8851bp，采用测序引物测序，引物序列如下：

p’ataalr测f：cgagagtttatatagattaa

p’atapuc测f：gcagcgagtcagtgagcgag

4）psip409pgsa’-egfpa载体hindⅲ酶切位点突变

将hindⅲ酶切位点aagctt突变为aaactt，点突变引物如下：

hindf:ccagtctctggcatcaaacttgcaatggcaac

hindr:tttgatgccagagactggtggccgaattggac

以质粒ppsip409pgsa’-egfpa为模板pcr扩增产物纯化后，用dpni限制性内切酶处理后，电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，筛选阳性克隆，突变后的载体命名为psip409pgsa’-egfpat质粒大小8851bp，碱基序列如seqidno.9所示；测序正确后电转化l.plantarumnc8/δalr，获得l.plantarumnc8/δalr-psip409pgsa’-egfpat荧光显微镜观察结见图6。

（2）无抗筛选双锚定表达egfp和mcherry验证

1）将psip409pgsa’-egfpat用hindⅲ单酶切获得8851bp的载体，采用dna纯化试剂盒纯化。

2）锚定序列lp-1261扩增

参照plp-1261inv序列设计引物，在上游引物中添加sd序列，由于需要添加sd序列和同源序列所以采用两轮pcr，将其添加到lp-1261序列的5’端，扩增lp-1261片段引物如下：

1261mf1：aagcttaggaaacagaccatgaatttcaaaacagct

1261mf2：cgagctgtacaagtaaaagcttaggaaacagacc

1261mr：cctcctcgcccttgctcaccatgtcgaccgccgcaatcg

a.第一轮pcr反应体系如下：

b.第一轮pcr反应条件如下：

以第一轮的pcr产物纯化后作为模板，使用上、下游引物1261mf2和1261mr进行第二轮pcr，反应体系与条件同第一轮，第二轮pcr产物lp-1261（大小301bp）。

3）荧光蛋白mcherry片段

以pya4545-mcherry质粒为模板，扩增mcherry片段，设计引物时候在片段3’端终止密码子taa前添加his标签序列，引物如下：

mcherryf：atggtgagcaagggcgaggagg

mcherryr1：

aagcttttaatggtgatggtgatgatgcttgtacagctcgtcc

mcherryr2：

gcaacacgtgctgtaatttgaagcttttaatggtgatg（下划线标注为载体同源序列，斜体标注为hindⅲ酶切位点）

a.第一轮pcr反应体系如下：

b.第一轮pcr反应条件如下：

以第一轮的pcr产物纯化后为模板，使用上、下游引物mcherryf和mcherryr2进行第二轮pcr，反应体系与条件同第一轮，第二轮pcr产物mcherry（大小755bp）。

4）锚定序列lp-1261、荧光蛋白mcherry片段与psip409pgsa’-egfpat（hindⅲ单酶切）载体无缝克隆连接

连接体系如下：

反应溶液50℃，连接15min，连接产物电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，涂布普通lb固体培养基，无抗性筛选阳性重组子，重组质粒命名为plq2a-e-m，吉林省库美生物科技有限公司测序鉴定。将鉴定阳性质粒plq2a-e-m电转化至l.plantarumnc8/δalr感受态细胞，涂布mrs固体培养基，获得基因工程l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m。

（5）基因工程l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m锚定表达egfp和mcherry的westernblot分析及菌体自发荧光检测

挑取l.plantarumnc8/δalr-plq2a-e-m单克隆接种于液体mrs培养基中过夜培养，转接液体mrs培养基（以菌液：培养基=1:50，37℃厌氧培养1h后加pssip诱导肽，继续培养4h待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，pbs洗三次后，制备玻片，使用倒置荧光显微镜观察荧光，结果如图7。采用反复冻融方法提取菌体膜蛋白，westernblot分析，分别用鼠抗egfp单抗和鼠抗his标签单抗一抗孵育，二抗使用hrp标记羊抗鼠igg室温孵育1h，tbst洗膜三次后显色，锚定序列pgsa’加上egfp蛋白大小约47.3kd如图8，锚定序列lp-1261加上mcherry蛋白大小约35.6kd如图9。

实施例4无抗筛选双抗原锚定表达载体plq2a的构建方法

1、载体psip409pgsa’-1261的制备

1）参照质粒plp-1261inv上lp-1261基因序列设计含有同源手臂端的无缝克隆引物，并在lp-1261的上游添加sd序列（aggaaacagacc）和hindⅲ酶切位点，下游添加sali和hindⅲ酶切位点，扩增含有同源手臂端298bp的lp-1261序列，引物序列如下：

1261f:ttcgaaggcgccaagcttaggaaacagaccatgaatttcaaaacagct

1261r:cacgtgctgtaatttgaagcttgtcgaccgccgcaatcgtgcc；

2）将锚定表达载体psip409pgsa’用hindⅲ单酶切，获得线性化载体psip409pgsa’（hindⅲ），6202bp；

3）将锚定序列lp-1261与psip409pgsa’（hindⅲ）无缝克隆连接，将连接产物化学法转化e.colitop10感受态细胞，利用红霉素抗性基因筛选阳性克隆，获得双锚定表达载体命名为psip409pgsa’-1261。

2、p23-alr-asd基因制备

参照pya4545载体asd基因序列，ncbi公布的p23启动子和植物乳杆菌alr基因序列设计添加同源手臂端的融合pcr（soe-pcr）引物，将引物送苏州金唯智生物科技有限公司合成，将p23启动子（碱基序列如seqidno.3所示）、alr基因（碱基序列如seqidno.4所示）和asd基因（碱基序列如seqidno.5所示）串联，获得p23-alr-asd基因。

引物序列如下

asdf:cgctatgcgtgcgggatcctcttccctaaatttaaatataaac（下划线标注的是与plps载体上的同源手臂）

asdr:gtctacaacatcaggtagtg

23f：gaatggagaccggggtagacgaaaagccctgacaaccctc

23r：gtggcggtgctccccaattacaaccataacatcattgtcattcat

alrf：atggttgtaattggggagcaccgccacacacaagtcacagtggact（alr基因内含有sali酶切位点，将c突变为g）

alrr：caaatttaaaaaagcgactcatagaattaatctatataaactctcg（与plps载体上的同源手臂）

分别扩增asd基因，p23启动子和alr基因，pcr产物纯化后，以分别asdf和alrr作为上下游引物，将asd基因，p23启动子和alr基因串联，基因大小3027bp。

3、用p23-alr-asd基因替换载体psip409pgsa’-1261上红霉素（em）基因获得无抗性筛选双抗原锚定表达载体plqa

用p23-alr-asd基因替换载体psip409pgsa’-1261上红霉素基因，由于载体上没有合适的酶切位点线性化载体，所以采用pcr方法线性化载体，参照基因序列psip409pgsa’-1261设计引物，扩增去除红霉素基因5405bp的409pgsa’-1261片段，引物如下：

lpsf:ttctatgagtcgcttttttaaatttg

lpsr:ggatcccgcacgcatagcggtgc

将扩增的409pgsa’-1261纯化后与p23-alr-asd无缝克隆连接，电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，铺普通lb固体培养基，利用asd基因与宿主菌实现营养互补筛选阳性克隆，测序鉴定正确的双抗原锚定表达质粒命名为plqa。

4、plqa载体hindⅲ和sali酶切位点突变

在载体构建过程中致使载体引入三个hindⅲ酶切位点，影响载体使用，将alr基因内的hindⅲ酶切位点aagctt突变为aaactt，点突变引物如下：

hindf:ccagtctctggcatcaaacttgcaatggcaac

hindr:tttgatgccagagactggtggccgaattggac

同时载体上还含有两处sali酶切位点，将alr基因下游的sali酶切位点gtcgac突变gtagac，引物如下：

1261attf:cactacctgatgttgtagacgaaaagccctgac

1261attr:tacaacatcaggtagtgacacttctttgacctg

以质粒plqa为模板pcr扩增产物纯化后，用dpni限制性内切酶处理后，电转化e.coli6212/δasd感受态细胞，经过两次突变后的筛选阳性载体命名为plq2a，载体总计8432bp，突变后载体用分别用sali和xbai单酶切出8432bp线性载体片段结果如图10（a），用hindⅲ单酶切酶出8168bp和264bp的片段结果如图10（b），构建的plq2a载体，在pgsa’锚定序列下游可以通过xbai、xhoi、ecori、kpni酶切位点插入目的基因，可以在lp-1261锚定序列后通过sali酶切引入目的基因，质粒图谱见图11。

本发明的l.plantarumnc8/δalr、psip409pgsa’-il-10、psip409pgsa’-egfp、pya4545-mcherry在吉林农业大学吉林省动物微生态制剂工程研究中心构建保存；pya4545、e.coli6212/δasd由roycurtissiii博士惠赠（美国弗罗里达大学），plp-1261inv由lassefredriksen博士馈赠（departmentofchemistry,biotechnologyandfoodscience,norwegianuniversityoflifesciences,aas,norway）。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>无抗性筛选双抗原锚定表达载体plq2a及制备方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8432

<212>dna

<213>人工合成()

<400>1

ttctatgagtcgcttttttaaatttggaaagttacacgttactaaagggaatggagaccg60

gggtagacccttcaatagagttcttaacgttaatccgaaaaaaactaacgttaatattaa120

aaaataagatccgcttgtgaattatgtataatttgattagactaaagaataggagaaagt180

atgatgatatttaaaaaactttctcgttaagataggttgttggtgagcatgttatatacg240

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agatatattcaaagaaagataacatttaaacggatcatattagatattttaatagcgatt360

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gcagttgggaatcttcaaggagtaacagccacgatattattaaccattatcattattttt840

tgtgtccttatcgggatgactttttggcaagtgatgctttttttgaaggcttattcgatt900

cgccaagaagccaatgaccaattggtccggaatcaacaacttcaagattatctagtcaat960

atcgaacagcagtacaccgaattacggcgatttaagcatgattatcaaaacatcttatta1020

tcgttggagagttttgccgaaaagggcgatcagcaacagtttaaggcgtattaccaagaa1080

ttattagcacaacggccaattcaaagtgaaatccaaggggcagtcattgcacaactcgac1140

tacttgaaaaatgatcctattcgaggattagtcattcaaaagtttttggcagccaaacag1200

gctggtgttactttaaaattcgaaatgaccgaaccaatcgaattagcaaccgctaatcta1260

ttaacggttattcggattatcggtattttattagacaatgcgattgaacaagccgttcaa1320

gaaaccgatcaattggtgagttgtgctttcttacaatctgatggtttaatcgaaattacg1380

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acgaaaggcgctggtcgggggactggtttagctaatgtgcaggatttgattgccaaacaa1500

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attctttttggatatggaaattgaggataaccgccaagccggtttagaagtggcaactaa1800

gattcggcagatgatgccgtttgcgcaaattgtcttcattacaacccacgaggaactgac1860

attattaacgttagaacgaaaaatagcgcctttagattacattctcaaggaccaaacaat1920

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accattaaaggaagttgtttatttatatactgaaaaagaaaatccgggtcatattaattt2100

gttagccgttaccagaaaggttacttttccaggaaatttaaatgcgctggaagcccaata2160

tccaatgctctttcggtgtgataaaagttacttagttaacctatctaatattgccaatta2220

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aagagttcttcaagttctaagcaaacggccaattggaccgaatcagccgaattaccaacg3540

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gggttataccgtctcggtaagaacgggggcacgattgcggcggtcgacaagcttcaaatt3660

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aatcccataagggcgggagcagaatgtccgagactaattcatgaccaaaatcccttaacg3900

tgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgaga3960

tcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggt4020

ggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcag4080

agcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaa4140

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gcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacac4320

cgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa4380

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gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgt4500

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cctgataagattttcgatagcaagtactaccaatacaagctatctaacttggtactatta4920

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<210>2

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