本发明涉及一种基于无缝克隆技术的克隆载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制备方法以及含有该载体的试剂盒的具体实施方案，属于基因工程领域。
背景技术：
克隆载体是开展基因保存、扩增、测序、表达及其体外转录与翻译等分析操作最普遍使用的工具之一，而t载体是目前克隆pcr产物最常用的克隆载体，该载体的应用是基于t-a克隆技术，其原理是在pcr扩增过程中，taqdna聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性，可向pcr扩增产物的3′末端添加一个突出的a碱基，因此可以和3′末端具有单个t碱基尾巴的t载体互补配对连接构建重组克隆质粒。
目前最常用的t载体主要来源于商业化产品，其制备方法可分为三大类：(1)采用产生平末端的ecorv等内切酶将环状克隆载体切割成线性载体，然后利用末端转移酶或taq酶，以ddttp或dttp为底物，在线性载体的3′末端添加单个t碱基(zhoumyandgomez-sanchezce.universaltacloning.currentissuesinmolecularbiology.2000,2:1-7)；(2)在前t载体的多克隆位点中引入特定限制性内切酶(比如xcmi、ahdi)酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3′末端具有单个t碱基突出的线性化t载体(中国专利cn100465278c,中国专利cn100383248c,中国专利cn101948862b)；(3)将含有特定限制酶位点的一对寡核苷酸片段引入出发载体中，此限制酶位点的特点是其经相应酶(ecorv)切割后能产生平末端，且切点前后碱基分别是t和a，然后以线性化的出发载体为模板，采用单引物pcr扩增或不对称pcr扩增产生单链，两条单链退火后即形成t载体(中国专利cn101177689b)。
虽然t-a克隆方法相对基于限制性内切酶酶切连接的克隆构建方法，具有操作简单、阳性克隆率高等优点，但也存在一些不足之处，具体如下所述：(1)比如为了确保pcr过程中不会产生碱基突变，需要使用高保真酶扩增目的基因，而高保真酶具有3′-5′的外切酶活性，不会在pcr产物3′末端添加额外的碱基，而需要通过回收pcr产物再使用taq酶进行加a反应，因此会使实验操作变的繁琐；(2)目前市场上销售的t载体制备步骤都比较繁琐，质量不稳定，价格昂贵，非重组背景较高，不能重复利用，不适合实验室自己制备生产；(3)蓝白斑筛选法，难以区分假阴性菌落；(4)传统的t-a克隆方法，不能控制插入到载体中目的基因的方向；(5)采用第一类方法制备的t载体存在加尾效率低以及线性化质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题；(6)采用第二类方法制备的t载体存在前t载体可能酶切不完全和酶切后连接效率低的问题。并且部分内切酶价格昂贵，或者容易在普通的克隆载体上有多个识别位点，因而限制了其应用；(7)采用第三类方法制备的t载体虽然具有极低的非重组背景，但是采用pcr扩增的方法一方面会增加操作步骤，另一方面必须使用价格昂贵的高保真酶扩增载体，增加生产成本。
因此，构建一种制备方法简单与稳定，同时具有快速、阳性克隆率高、高通量、价廉和可以循环使用的技术优势的定向克隆载体，将为分子生物学提供一种强有力的基因分析工具和具有广阔的市场前景。
技术实现要素：
本发明的目的：一、针对现有技术存在的上述不足，基于最新的无缝克隆技术，提供一种制备简单、阳性克隆率大于90％、价廉、不依赖于连接酶和可以循环使用的定向克隆载体；二、为各种基因文库的构建提供一种高通量的快速克隆载体。
发明内容之一：一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体的制备方法
以温州医科大学酶工程与医学诊断研究所保藏的mek5-pcmv5质粒为模板，采用引物mek5-pum19-t-f(序列如seqidn0.1所示)和mek5-pum19-t-r(序列如seqidn0.2所示)扩增，所得pcr产物经加a反应后与pum19-t(序列如seqidn0.4所示)载体连接，构建mek5-pum19-t重组质粒。其中上述两条引物5′端为无缝克隆同源臂，同源臂序列与takara公司的pcoldi和pcoldtf载体的多克隆位点中kpni酶切位点两侧序列一致，3′端为扩增mek5基因编码框序列，中间为kpni酶切位点(如图2所示)。采用kpni单酶切mek5-pum19-t重组质粒，胶回收载体片段，然后采用t4连接酶将回收的载体片段进行自连即获得新的质粒，命名为pwmu19-t(如图1所示)。因此，只要任何pcr产物两端含有与pwmu19-t载体一致的同源臂序列，都可以通过无缝克隆技术快速克隆至经kpni单酶切的pwmu19-t线性化载体中。
发明内容之二：一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体试剂盒
本发明专利提供一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体试剂盒，除试剂盒包装、衬垫、试剂管和使用说明书以外，该试剂盒组成成分包括：(1)线性化的pwmu19-t系列克隆载体；(2)对照dna片段(500bp)；(3)无缝克隆酶；(4)5×无缝克隆缓冲液；(5)菌落pcr通用鉴定引物；(6)无菌ddh2o。
其中所述线性化pwmu19-t系列克隆载体浓度为0.02pmol/μl，所述对照dna片段(500bp)浓度为0.04pmol/μl，所述无缝克隆酶和无缝克隆缓冲液可分别购自以下公司：和元生物技术(上海)股份有限公司，clonfast无缝克隆试剂盒；南京诺唯赞生物科技有限公司，同源重组一步克隆试剂盒，货号c112-01/02；南京金斯瑞生物科技有限公司，cloneezpcr克隆试剂盒，货号l00339；clontech，seamlesscloningwithin-fusioncloningkits，货号638911/638918；invitrogen，
本发明所述一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒，具备以下创新点和技术优势：
1.常用的表达载体构建流程为：使用5′端分别含有不同限制性内切酶识别位点的正反引物扩增目的基因，pcr产物加a反应后，采用t-a克隆技术连接至t载体，测序正确后再采用上述两个限制性内切酶酶切重组t载体，回收双酶切后目的基因片段，使用t4连接酶将其连接到同样经双酶切与回收后的表达载体中构建重组表达质粒。而使用本发明所述方法构建的前克隆载体的同源臂序列可以为任意大肠杆菌表达载体的多克隆位点中单一限制性内切酶酶切位点上/下游15-20bp的同源序列_(如图1和图2所示)。因此，采用5′端含有同源臂的引物扩增的pcr产物，可以同时通过同源重组连接到克隆载体和表达载体中，这样节省了2-4天的重组质粒构建时间；
2.为了避免所选取酶切前克隆载体的限制性内切酶在克隆载体其它部位也存在识别位点，本发明所述克隆载体是以南京诺唯赞生物科技有限公司的pum19-tsimple载体为出发载体，pum19-tsimple是在线性化puc19载体的基础上，去除多克隆酶切位点；
3.本发明所述克隆载体的使用是基于无缝克隆技术，利用同源重组原理，其相对传统的t-a克隆技术，无需限制性内切酶和连接酶，不受克隆载体和目的片段的限制性酶切位点限制；
4.本发明所述克隆载体可以以前载体的形式保存于大肠杆菌细胞中，因此可以循环使用，既适用于实验室小规模制备，也适用于商业化大规模生产。
技术效果
本发明所述克隆载体的制备及其试剂盒相对t-a克隆载体具有以下技术效果：
1.简便、快捷：pcr产物无需加a反应，pcr产物可以不做胶回收只进行产物回收，载体只需单酶切线性化，30min即可完成重组载体构建；
2.定向克隆：可通过两端同源臂控制pcr产物插入方向；
3.重组效率高：无需蓝白斑筛选阳性克隆，用本发明所述克隆载体完成了20个以上基因的克隆，最大基因大小约为4kb，结果表明其阳性克隆率达到了90％以上；
4.高通量、批量克隆：可以用8连管，24、48、96孔板做高通量克隆；
5.通过使用本发明的试剂盒，可利用最少的劳动和时间克隆多数已知或未知基因，并且对可通过本发明的试剂盒进行克隆的dna没有特别限定。可以是编码多肽的基因、编码功能性rna(rrna、mirna、lncrna等)的基因或其片段、顺式作用性碱基序列要素(启动子、增强子、沉默子等基因表达控制序列)，还可以将功能不明的核酸序列作为目标序列进行克隆，并进行碱基序列分析。
附图说明
图1.pwmu19-t克隆载体图谱；
图2.构建mek5-pum19-t重组克隆载体的引物设计图谱；
图3.pcr扩增人源mek5基因产物琼脂糖凝胶电泳图谱；m:dl5000marker；lane-1:mek5基因的pcr扩增产物(1347bp)；
图4.采用pum19-t质粒通用鉴定引物扩增mek5-pum19-t/dh5α阳性克隆菌株pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；m:dl5000marker；lane-1-12:pcr扩增mek5-pum19t/dh5α阳性克隆菌株目的基因产物(1624bp)；
图5.kpni单酶切鉴定mek5-pum19-t质粒图谱；m:dl5000marker；lane-1-3:kpni单酶切mek5-pum19t质粒产物；
图6.kpni单酶切鉴定pwmu19-t质粒琼脂糖凝胶电泳图谱；m:dl5000marker；lane-1:kpni单酶切pwmu19-tp质粒产物(2744bp)；
图7.pwmu19-t质粒采用m13-47通用引物测序的峰图。图中下划线部分序列为同源臂与限制性内切酶酶切位点的序列。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1.一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体的制备方法
1.pwmu19-t克隆前载体的构建
1.1pcr扩增人源双特异性促分裂原活化蛋白激酶激酶5(mek5)目的基因
1.1.1pcr扩增mek5基因体系及条件如下：
95℃,3min；95℃,10sec,56.3℃,10sec,72℃,60sec,35个循环；72℃,10min,4℃保存。
1.1.2dpni消化甲基化的mek5-pcmv5质粒模板
酶切体系及条件如下：
37℃孵育1小时或更长时间。
1.1.3酶切产物的胶回收：
酶切反应后产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的dna片段，以takara公司胶回收试剂盒进行回收。
1.1.3回收产物的加a反应
加a反应体系如下：
72℃,反应10min。
加a反应后以takara公司pcr产物回收试剂盒进行回收，最后以du-800核酸/蛋白分析仪对回收产物定量。
1.2mek5-pum19-tsimple重组克隆载体的构建
按南京诺唯赞生物科技有限公司的pum19-tsimplevector试剂盒说明书进行t载体与mek5目的基因的连接。连接反应体系如下：
16℃，连接过夜。
1.2.1转化
通过冷cacl2法将连接产物转化入e.colidh5α感受态细胞中。
1.2.2菌落pcr鉴定阳性克隆菌株
用接种针挑取上述lb/amp+平板上生长的单菌落少许分别划线接种于一个无菌lb/amp+平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用无菌枪头分别挑取该平板上各小格中生长的菌体少许，混于含50μl无菌水的ep管中，沸水煮10min，12000rpm、离心5min后，取上清9.2μl加入200μlpcr反应管中作为pcr鉴定模板。并取以下体系加入该管中，混匀。
94℃,5min；94℃,30sec,53.3℃,30sec,72℃,1min45sec,25个循环；72℃,10min,4℃保存。取5μlpcr产物以1.0％的agarose凝胶电泳鉴定。
1.2.3测序鉴定阳性克隆菌株
挑选一个经通用鉴定引物鉴定正确的单克隆菌株送至北京六合华大基因科技有限公司测序，测序结果与ncbi上提供的标准参考序列比对。
1.3pwmu19-t克隆前载体的构建
1.3.1mek5-pum19-tsimple质粒的提取：
采用takaraminibestplasmidpurificationkitver.3.0试剂盒小提质粒。
1.3.2mek5-pum19-tsimple质粒的单酶切反应体系如下：
37℃，酶切15min。
1.3.3酶切产物的胶回收：
酶切反应后产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割pum19-t载体片段，以takara公司胶回收试剂盒进行回收。最后以du-800核酸/蛋白分析仪对回收产物定量。
1.3.4回收载体的自连
16℃，连接过夜。
1.3.5转化
通过冷cacl2法将自连产物转化入e.colidh5α感受态细胞中。
1.3.6菌落pcr鉴定阳性克隆菌株
用接种针挑取上述lb/amp+平板上生长的单菌落少许分别划线接种于一个无菌lb/amp+平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用无菌枪头分别挑取该平板上各小格中生长的菌体少许，混于含50μl无菌水的ep管中，沸水煮10min，12000rpm、离心5min后，取上清9.2μl加入200μlpcr反应管中作为pcr鉴定模板。并取以下体系加入该管中，混匀。
94℃,5min；94℃,30sec,53.3℃,30sec,72℃,30sec,25个循环；72℃,10min,4℃保存。取5μlpcr产物以1.0％的agarose凝胶电泳鉴定。
1.3.7测序鉴定阳性克隆菌株
挑选一个经通用鉴定引物鉴定正确的单克隆菌株送至北京六合华大基因科技有限公司测序，并与标准参考序列进行比对。
2.pwmu19-t克隆载体的制备
2.1pwmu19-t克隆前载体的提取：
采用takaraminibestplasmidpurificationkitver.3.0试剂盒小提质粒。
2.2pwmu19-t克隆前载体的单酶切
单酶切反应体系如下：
37℃，酶切35min。
2.3酶切产物的胶回收：
酶切反应后产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割pwmu19-t载体片段，以takara公司胶回收试剂盒进行回收。最后以du-800核酸/蛋白分析仪对回收产物定量，并用elutionbuffer将其终浓度调整为0.02pmol/μl。
3.实验结果：从图3可以看出，pcr扩增的mek5基因大小约为1347bp，与预期结果一致；采用pwmu19-t质粒通用鉴定引物扩增mek5-pum19-t/dh5α阳性克隆菌株pcr产物大小为1624bp，其中采用通用鉴定引物扩增pum19-t空载体的pcr产物大小为277bp，mek5基因大小为1347bp。从图4可以看出，菌落pcr鉴定产物大小与预期结果一致，初步判断mek5-pum19-t质粒构建成功；从图5可以看出，采用kpni单酶切mek5-pum19-t质粒时共有两条酶切产物，大小分别为2744bp(pum19-t)和1347bp(mek5)，与预期结果一致，说明mek5-pum19-t质粒构建成功；从图6可以看出，kpni单酶切鉴定pwmu19-t质粒的产物大小为2744bp，并且结合图7的测序结果，可以说明pwmu19-t质粒构建成功。
实施例2.一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体试剂盒
1.一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体试剂盒说明书
1.1试剂盒简介
本试剂盒通过对常用的ta克隆载体进行改造后构建了pwmu-19t系列载体。该系列克隆载体的使用是基于无缝克隆技术，具有以下特色：前载体可以循环使用，经单酶切制备线性化载体，线性化载体两端含有15-20bp同源臂序列，pcr产物无需加a反应，30min即可完成载体构建，可以高通量构建克隆，无需蓝白斑筛选阳性克隆，阳性克隆率大于90％。
1.2应用范围
克隆pcr产物
1.3pwmu19-t系列载体图谱
如图1所示
1.4引物设计示意图
如图2所示
1.5试剂盒成分
*使用对照dna片段构建t克隆载体，阳性克隆率＞90％
1.6使用步骤说明
1.6.1pcr片段克隆
无缝克隆反应体系及条件如下：
37℃孵育30min，冰上放置5min。
注意事项：无缝克隆反应液如不立即用于转化，可置于-20℃长期保存；如需同时构建多个载体，可以使用八连管或96孔板进行高通量操作。
插入dna片段使用量的计算方法
进行无缝克隆时，载体dna和插入dna的摩尔数比一般为1：2。插入dna使用量的计算方法如下：
插入dna的使用量(ng)×1000＝nmol数×660×插入dna的bp数
1.6.2转化
1.6.2.1将10μl无缝克隆反应液加入到100μldh5感受态细胞中，手指轻弹混匀，冰上孵育30min；
1.6.2.242℃水浴热激90sec，冰上放置2-3min；
1.6.2.3加入900μl于37℃预热的lb液体培养基，37℃、200rpm孵育45min；
1.6.2.44000rpm离心5min，弃掉900μl上清，用剩余培养基重悬菌体，并均匀涂布于相应抗性的lb平板上，37℃倒置培养过夜。
1.6.3阳性克隆的鉴定
采用pwmu19-t系列载体通用鉴定引物鉴定阳性克隆菌株，pwmu19-t空载体pcr产物大小为277bp。
阳性克隆菌株pcr通用鉴定引物:
pwmu19-t正向通用鉴定引物gcaactgttgggaaggg
pwmu19-t反向通用鉴定引物tggaattgtgagcggata
1.6.4测序
挑选两个菌落pcr鉴定正确的阳性克隆菌株进行测序鉴定，测序通用引物名称为m13-f/m13-r。
1.6.5试剂盒保存条件
置于-20℃保存，有效期一年。
对于本领域技术人员而言，可以根据上述实施方案加以改进或变换本发明，而所有这些改进或变换都应属于本发明权利要求的保护范围。