本发明属于药物化学领域。申请人设计并合成了一类含环丙胺结构的噻吩并[3,2-d]嘧啶衍生物，具有一定的menin-mll1蛋白-蛋白相互作用抑制活性以及较好的细胞增殖抑制活性，可能用于多种肿瘤的治疗。
技术背景
menin-mll1蛋白-蛋白相互作用抑制剂是潜在的肿瘤治疗化合物，虽然文献【1)he,s.；senter,t.j.；pollock,j.；han,c.；upadhyay,s.k.；purohit,t.；gogliotti,r.d.；lindsley,c.w.；cierpicki,t.；stauffer,s.r.；grembecka,j.,journalofmedicinalchemistry2014,57(4),1543-1556.2)shi,a.；murai,m.j.；he,s.；lund,g.；hartley,t.；purohit,t.；reddy,g.；chruszcz,m.；grembecka,j.；cierpicki,t.,blood2012,120(23),4461-4469.3)karatas,h.；townsend,e.c.；cao,f.；chen,y.；bernard,d.；liu,l.；lei,m.；dou,y.；wang,s.,journaloftheamericanchemicalsociety2012,135(2),669-682.】报道其分子活性已达到百nm级别，但其细胞活性较低，限制了其相关的临床药物开发。
技术实现要素：
申请人通过研究发现，将menin-mll1蛋白-蛋白相互作用抑制剂与苯基环丙胺或取代苯基环丙胺结构拼合后，所生成的新结构在生物测试中，特别是细胞水平研究上，显示了较原有menin-mll1蛋白-蛋白相互作用抑制剂更好的抗肿瘤活性。
本发明的目的在于提供一类新型的具有苯基环丙胺或取代苯基环丙胺结构的menin-mll1蛋白-蛋白相互作用抑制剂及其合成方法。
本发明一方面提供了式1所示化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
l为-nh-(ch2)m-或l不存在，m为0～3，m优选为0或1；
n为0～3，n优选为0或1；
r为五至六元亚环烷基或五至六元亚杂环基；所述亚杂环基为环上含有1～3个选自n、o、s的杂原子的环状基团；r优选为
ar为未取代或被卤素取代的苯基，卤素选自氟、氯、溴、碘，优选为氟。
优选地，式1所示化合物选自式2-1所示化合物和式2-2所示化合物：
其中，m、n、ar的定义与前述相同。
优选地，所述式1所示化合物选自下列化合物：
其中，l、n、ar的定义与前述相同。
进一步优选地，式1所示化合物选自如下化合物：
本发明另一方面还提供了式1所示化合物的制备方法，其选自如下方法之一：
方法一：化合物3a-1与化合物4发生还原胺化反应，生成化合物2-1-1，
其中，l和ar的定义与前述相同；
方法二：化合物3a-2与化合物4发生还原胺化反应，生成化合物2-1-2，
其中，l和ar的定义与前述相同；m为1～3，
方法三：化合物10与化合物11a发生缩合反应，生成化合物2-2，
其中，n和ar的定义与前述相同。
方法一和方法二所述还原胺化反应可以在还原剂的存在下进行。所述还原剂选自硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠等。
方法一和方法二所述还原胺化反应可以在溶剂的存在下进行。所述溶剂选自二氯甲烷，异丙醇、乙醇、1,2-二氯乙烷、三氯甲烷、甲苯、水等。
方法一和方法二所述还原胺化反应在适当的ph下进行。所述ph范围为3-8之间。使用醋酸、三氟乙酸、盐酸、磷酸等调节ph至所述范围。
方法一和方法二所述还原胺化反应的反应温度为-10℃～+100℃。
方法三所述缩合反应可以在溶剂的存在下进行。所述溶剂选自二氯甲烷，异丙醇、乙醇、1,2-二氯乙烷、三氯甲烷、甲苯、水等。
方法三所述缩合反应可以在碱的存在下进行。所述碱选自n,n-二异丙基乙胺、三乙胺、二异丙基胺、吡啶等。
方法三所述缩合反应的反应温度为0℃～+120℃。
本发明所述药学上可接受的盐包括与无机酸或有机酸反应形成的无毒盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，磷酸、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；所述有机酸包括苯甲酸、2-羟基乙磺酸、氨基磺酸、苯磺酸、苯乙酸、扁桃酸、丙二酸、丙酸、草酸、对氨基苯磺酸、对甲苯磺酸、多聚半乳糖醛、反丁烯二酸、泛酸、富马酸、谷氨酸、琥珀酸、甲烷磺酸、酒石酸、抗坏血酸、邻苯二甲酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、葡庚糖、葡糖酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、双羟萘酸、水杨酸、辛二酸、亚磷酸、亚乙酸、依地酸、乙醇酸、乙酸、乙烷磺酸、异丁酸、硬脂酸等。
本发明还提供了式1所示化合物或其药学上可接受的盐在制备menin-mll1蛋白-蛋白相互作用和lsd1双靶点抑制剂中的用途。
本发明还提供了式1所示化合物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤治疗药物中的用途。
本发明还提供了一种组合物，其包含有式1所示化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述式1所示化合物或其药学上可接受的盐或药物组合物。
本发明的有益效果：
本发明所设计并合成的menin-mll1蛋白-蛋白相互作用和lsd1双靶点抑制剂显示了良好的细胞增殖抑制活性，可能用于多种肿瘤的治疗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
下述制备例中，1h-nmr用varianmercuryamx300型仪、varianmercury-300highperformancedigitalft-nmr型仪、brukerultrashield500nmr型仪、varianmercury-400highperformancedigitalft-nmr型仪、agilent1260prospekt2brukerascend600nmr型仪测定，氘代氯仿(cdcl3)、氘代甲醇(meod-d4)为溶剂，四甲基硅烷(tms)为内标。质谱用thermofinniganmat-95型仪、watersq-tofultimaglobalspectrometer型仪测定。熔点在sgwx-4熔点仪上测定。
下述制备例中，沸程为60～90℃的石油醚，乙醇，乙酸乙酯等试剂均为分析纯，为由国药集团化学试剂有限公司提供，所用试剂和溶剂除特别说明外，均未经特别处理。所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得。除说明外，所有反应均是在氮气保护下进行并用tlc跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸镁干燥过程。产品的纯化除说明外均使用硅胶(200-300目)的柱色谱法，所使用的硅胶包括200-300目，gf254为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。除特别说明外，一般试剂购自上海毕得医药科技有限公司、上海书亚医药科技有限公司、上海泰坦科技股份有限公司、安耐吉化学或国药集团化学试剂有限公司。
所有温度以℃(摄氏度)表示，室温是指20～25℃。
旋光度(+/-)通过日本表面化学株式会社(jasco)制造的or-2090手性检测器(hg-xe灯，150w)测量。
高效液相色谱(hplc)测定条件：agilent1260分析型高效液相色谱系统(安捷伦公司)和lc3000制备型高效液相色谱系统(北京创新通恒科技有限公司)。
手性od或oj柱购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司，柱尺寸2cmфx25cm。
分析型高效液相色谱条件：c18柱(5μm,4.6x250mm)，紫外检测波段为214和280nm，洗脱条件0-90％乙腈(含0.1％v/vtfa)梯度洗30分钟。制备高效液相色谱条件：c18柱(5μm,19x250mm)，紫外检测波段为214和280nm，洗脱条件0-90％乙腈(含0.1％v/vtfa)梯度洗30分钟。
在上述讨论和下述实施例中，下列缩写具有如下含义。如果某一缩写没有定义，则它具有通常被接受的含义。
tlc为薄层色谱；
dmf为n，n-二甲基甲酰胺；
etoac为乙酸乙酯；
thf为四氢呋喃；
dmso为二甲基亚砜；
dce为1,2-二氯乙烷
dcm为二氯甲烷；
et3n为三乙胺；
tbme为叔丁基甲基醚；
boc2o为二碳酸二叔丁酯；
cbz2o为苄氧甲酸酐；
cbzcl为氯甲酸苄酯；
tmsotf为三氟甲磺酸三甲基硅酯；
stab为三乙酰氧基硼氢化钠；
hoac为乙酸；
dipea为n,n-二异丙基乙胺；
ddq为二氯二氰基苯醌。
制备实施例1化合物3a
取化合物11a(6.0g,23.75mmol,根据文献方法制备：nat.chem.biol.2012,8,277)与化合物15a(7.1g,47.50mmol)溶于异丙醇与水的混合溶剂(50ml，1:1，v/v)中，取dipea(15.7ml,95.00mmol)加入上述反应液中，60℃下搅拌过夜。点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，硅胶柱(dcm:ch3oh，v:v＝40：1)分离纯化，得淡黄色粉末状固体3a(5.3g,16.06mmol)，产率：68％。
1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.51(s,1h),7.08(s,1h),5.02(d,j＝5.9hz,1h),4.69(ddq,j＝14.7,7.4,3.8hz,1h),3.65(q,j＝10.0hz,2h),2.64–2.54(m,2h),2.53–2.43(m,4h),1.87–1.76(m,2h).
制备实施例2化合物trans-2-1-1a和cis-2-1-1a
取化合物3a(500.0mg,1.52mmol)与化合物4a(462.0mg,1.52μmol)，溶于甲醇(10ml)中，向其中加入hoac(400.0μl,6.07mmol)，氰基硼氢化钠(199.9mg,3.04mmol)。冰浴条件下搅拌2.5小时，点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，硅胶柱(pe:ea，v:v＝1:1)分离纯化，获得trans-2-1-1a和cis-2-1-1a的游离碱，并将其分别以dcm(5ml)溶解，分别滴加2m氯化氢乙醚溶液(3ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得trans-2-1-1a的盐酸盐(白色粉末状固体，40.0mg,0.08mmol)，产率：5％；以及cis-2-1-1a的盐酸盐(白色粉末状固体，410.0mg,0.79mmol)，产率：52％。
trans-2-1-1a：1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.61(s,1h),7.98(s,1h),7.35–7.19(m,5h),4.50–4.40(m,1h),4.02(q,2h),3.59–3.52(m,1h),3.01(dt,j＝7.9,4.0hz,1h),2.63–2.56(m,1h),2.21–2.09(m,4h),2.07–1.91(m,4h),1.64–1.60(m,1h),1.45(q,j＝6.5hz,1h).
cis-2-1-1a：1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.66(s,1h),7.83(d,j＝14.3hz,1h),7.39–7.13(m,5h),4.45–4.20(m,1h),4.01(q,j＝11.1hz,2h),3.56–3.35(m,1h),3.09–2.91(m,1h),2.59–2.44(m,1h),2.41–2.17(m,4h),1.83–1.62(m,4h),1.61–1.50(m,1h),1.49–1.41(m,1h).
制备实施例3化合物trans-2-1-1b和cis-2-1-1b
取化合物3a(20.0mg,60.70μmol)与化合物4b(19.60mg,61.00μmol)溶于dce(2ml)中，加入hoac(36μl)，4a分子筛(30mg)，stab(77.0mg,364.24μmol)。室温搅拌3小时，点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，以饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，通过硅胶制备型薄层色谱分离纯化，获得trans-2-1-1b和cis-2-1-1b的游离碱，并将其分别以dcm(5ml)溶解，分别滴加2m氯化氢乙醚溶液(1ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得淡黄色粉末状固体trans-2-1-1b的盐酸盐(18.3mg,33.00μmol)，产率：54％；以及cis-2-1-1b的盐酸盐(白色粉末状固体，11.4mg,20.60μmol)，产率：34％。
trans-2-1-1b:1hnmr(600mhz,甲醇-d4)δ8.68(s,1h),8.09(s,1h),7.21–7.14(m,2h),7.05(s,1h),4.47(s,1h),4.02(q,j＝10.4hz,2h),3.55(s,1h),3.04–3.01(m,1h),2.66–2.62(m,1h),2.14(s,4h),2.05(d,j＝9.1hz,2h),1.99–1.93(m,2h),1.68–1.64(m,1h),1.45–1.41(m,1h),
cis-2-1-1b:1hnmr(600mhz,甲醇-d4)δ8.67(s,1h),7.92(s,1h),7.27–7.05(m,3h),4.35(s,1h),4.04(q,j＝10.4hz,2h),3.46(s,1h),3.05(s,1h),2.65–2.58(m,1h),2.43–2.19(m,4h),1.77(s,4h),1.65(s,1h),1.45(d,j＝6.5hz,1h).
制备实施例4化合物6a
取化合物11a(10.0g,39.58mmol)与化合物5a(13.1g,79.16mmol)于反应瓶中，向其中加入异丙醇与水的混合溶液(80ml，1:1，v/v)，另滴加n,n-二异丙基乙胺(40.0ml,237.00mmol)于反应液中，将上述体系置于60℃下搅拌过夜。点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液(30ml)、饱和食盐水溶液(30ml)洗涤反应液，收集有机相以无水硫酸钠干燥，将有机相浓缩至干，硅胶柱(dcm:meoh，v:v＝40:1)分离纯化得6a(黄色粉末状固体，9.9g,28.67mmol)，产率：72％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.30(s,1h),7.54(s,1h),4.12(tt,j＝11.3,3.9hz,1h),3.86(q,j＝10.8hz,2h),3.43(d,j＝6.4hz,2h),2.17–2.06(m,2h),1.99–1.88(m,2h),1.56–1.49(m,1h),1.48–1.38(m,2h),1.17(qd,j＝13.8,13.4,3.8hz,2h),
制备实施例5化合物7a
取化合物6a(5.0g,14.50mmol)溶于dcm(50ml)，向其中加入dess-martin试剂(7.7g,17.40mmol)，室温搅拌4小时，点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，依次以饱和硫代硫酸钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤反应液，收集有机相，滤过无水硫酸钠，将有机相浓缩至干，硅胶柱(pe:ea，v:v＝1:1)分离纯化得7a(浅黄色油状物，2.2g,6.40mmol)，产率：44％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ9.71–9.58(m,1h),8.31(d,j＝6.4hz,1h),7.53(s,1h),4.18–4.02(m,1h),3.87(q,j＝10.4hz,2h),2.37–2.08(m,4h),2.04–1.90(m,1h),1.53–1.34(m,4h).
制备实施例6化合物2-1-2a
取化合物7a(800.0mg,2.33mmol)与化合物4a(660.0mg,58.00,2.33mmol)溶于dce(5ml)中，向其中加入hoac(400μl)，4a分子筛(80mg)，stab(3.46g,16.31mmol)。室温搅拌3小时，点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，以饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，通过硅胶制备型薄层色谱分离纯化，获得2-1-2a的游离碱，并将其用dcm(5ml)溶解，滴加2m氯化氢乙醚溶液(3ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得2-1-2a的盐酸盐(淡黄色粉末状固体，259.1mg,0.48mmol)，产率：21％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.64(s,1h),7.83(s,1h),7.36–7.20(m,5h),4.36–4.23(m,1h),4.03(q,j＝10.7hz,2h),3.16(d,j＝7.1hz,2h),3.06–3.00(m,1h),2.62–2.54(m,1h),2.19(ddd,j＝13.4,5.0,3.1hz,2h),2.07–2.01(m,2h),1.94–1.85(m,1h),1.67–1.60(m,2h),1.60–1.55(m,1h),1.46–1.40(m,1h),1.37–1.34(m,2h).
制备实施例7化合物2-1-2b
取化合物7a(30.0mg,86.80μmol)与化合物4b(28.0mg,86.80μmol)溶于dce(2ml)中，向其中加入hoac(72μl)，4a分子筛(30mg)，stab(110.0mg,519.00μmol)，室温搅拌2小时，点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，以饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，通过硅胶制备型薄层色谱分离纯化，获得2-1-2b的游离碱，并将其用dcm(5ml)溶解，滴加2m氯化氢乙醚溶液(1ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得2-1-2b的盐酸盐(白色粉末状固体，39mg,68.49μmol)，产率：79％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.66(s,1h),7.85(s,1h),7.27–7.03(m,3h),4.29(s,1h),4.03(q,j＝10.8hz,2h),3.16(d,j＝6.1hz,2h),3.07–2.99(m,1h),2.65–2.56(m,1h),2.23–2.17(m,2h),2.04(dd,j＝12.2,3.8hz,2h),1.95–1.87(m,1h),1.71–1.65(m,1h),1.64–1.58(m,2h),1.46–1.40(m,1h),1.37–1.34(m,2h).
制备实施例8化合物2-2-1a
取化合物10a的盐酸盐(1.0g,根据ortegamunoz,a.；fyfe,m.c.t.；martinellpedemonte,m.；estiartemartinez,m.d.l.a.；vallsvidal,n.；kurz,g.；castropalominolaria,j.c.wo2013057320a1,2013的方法制备)与化合物11a(874.0mg,3.46mmol)溶于异丙醇与水的混合溶剂(50ml，1:1，v/v)中，向反应液中加入dipea(3.0ml,18.18mmol)，常温搅拌两小时。点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，硅胶柱(dcm:meoh，v:v＝50:1)分离纯化得2-2-1a的游离碱，并将其用dcm(5ml)溶解，滴加2m氯化氢乙醚溶液(5ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得2-2-1a的盐酸盐(淡黄色粉末状固体，1.5g,2.97mmol)，产率：86％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.66(s,1h),7.82(s,1h),7.30(t,j＝7.3hz,2h),7.24–7.16(m,3h),5.00(d,j＝12.6hz,2h),4.02(q,j＝10.7hz,2h),3.86–3.78(m,1h),3.56–3.48(m,2h),3.03(dt,j＝8.0,4.2hz,1h),2.53(td,j＝6.6,4.6hz,1h),2.47–2.37(m,2h),1.94–1.82(m,2h),1.59–1.54(m,1h),1.47–1.42(m,1h).
制备实施例9化合物9b
取化合物4b(2.9g,8.87mmol)与化合物8a(1.8g,8.87mmol)溶于dce(20ml)中，另取stab(5.6g,26.60mmol)、hoac(522.0μl,8.87mmol)加入反应液中，室温下搅拌5小时。点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，硅胶柱(dcm:meoh，v:v＝20:1)分离纯化得9b(淡黄色油状物，2.4g,6.90μmol)，产率：78％。
1hnmr(500mhz,甲醇-d4)δ7.13(dt,j＝10.6,8.5hz,1h),6.96(ddd,j＝12.0,7.6,2.2hz,1h),6.89(ddt,j＝8.0,3.7,1.7hz,1h),4.05(d,j＝13.3hz,2h),2.83(ddq,j＝10.7,7.9,3.9hz,3h),2.33(ddd,j＝7.7,4.5,3.4hz,1h),1.91(ddd,j＝8.9,5.7,3.2hz,3h),1.47(s,9h),1.32–1.26(m,2h),1.11(dt,j＝9.5,5.1hz,1h),1.04(dt,j＝7.4,5.7hz,1h).
制备实施例10化合物10b
取化合物9b(1.2g,3.81mmol)溶于dcm(5ml)，向其中加入4m盐酸二氧六环溶液(12ml)，室温下搅拌0.5小时。点板确认原料反应完全，旋干反应液，得固体10b的盐酸盐(棕黄色粉末状，1.0g,3.46mmol)，产率：91％。
1hnmr(600mhz,甲醇-d4)δ7.25–7.17(m,2h),7.09–7.04(m,1h),3.77–3.70(m,1h),3.61–3.54(m,2h),3.23–3.10(m,2h),3.07(dt,j＝8.1,3.9hz,1h),2.63(ddd,j＝10.2,6.6,3.2hz,1h),2.43(t,j＝16.0hz,2h),2.12–1.97(m,2h),1.66(ddd,j＝10.6,6.8,4.2hz,1h),1.46(q,j＝7.1hz,1h).
制备实施例11化合物2-2-1b
取化合物10b的盐酸盐(420.0mg,1.29mmol)与化合物11a(326.3mg,1.29mmol)溶于异丙醇与水的混合溶液(10ml,1:1,v/v)中，滴加dipea(1.3ml,7.75mmol)，60℃搅拌过夜。点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(50ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液(30ml)、饱和食盐水溶液(30ml)洗涤反应液，收集有机相以无水硫酸钠干燥，将有机相浓缩至干，硅胶柱(dcm:meoh，v:v＝20:1)分离纯化得2-2-1b的游离碱，用dcm(5ml)溶解该产物，滴加2m氯化氢乙醚溶液(3ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得2-2-1b的盐酸盐(黄色粉末状固体，406.1mg,0.75μmol)，产率：58％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.70(s,1h),7.86(s,1h),7.28–7.04(m,3h),5.04(d,j＝15.8hz,2h),4.06(q,j＝10.5hz,2h),3.92–3.78(m,1h),3.63–3.48(m,2h),3.09(dt,j＝8.0,4.0hz,1h),2.60(ddd,j＝10.1,6.7,3.0hz,1h),2.51–2.37(m,2h),2.00–1.86(m,2h),1.67–1.60(m,1h),1.48(q,j＝7.4hz,1h).
制备实施例12化合物2-2-2a
取化合物14a的盐酸盐(170.0mg,根据johnson,n.w.；kasparec,j.；miller,w.h.；rouse,m.b.；suarez,d.；tian,x.wo2012135113a2,2012的方法制备)与化合物11a(141.0mg,0.56mmol)溶于异丙醇与水的混合溶剂(10ml，4:1，v/v)中，加入dipea(0.4ml)，常温搅拌3小时，点板确认原料反应完全，向反应液中加入乙酸乙酯(30ml)，以饱和饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，硅胶柱(pe:ea，v:v＝1:1)分离纯化得2-2-2a的游离碱，用dcm(5ml)溶解该产物，滴加2m氯化氢乙醚溶液(2ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得2-2-2a的盐酸盐(白色粉末状固体，160.0mg,0.31mmol)，产率：55％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.67(s,1h),7.84(s,1h),7.37–7.20(m,5h),4.97(s,2h),4.06(q,j＝10.5hz,2h),3.54(t,j＝12.9hz,2h),3.23(d,j＝7.0hz,2h),3.06(dt,j＝7.9,4.1hz,1h),2.61(ddd,j＝10.3,6.5,3.6hz,1h),2.34(q,j＝8.3,7.7hz,1h),2.14(d,j＝13.2hz,2h),1.63(dd,j＝6.7,4.2hz,1h),1.60–1.50(m,2h),1.46–1.40(m,1h).
制备实施例13化合物13b
取化合物4b(2.3g,7.09mmol)与化合物12a(1.7g,7.80mmol)溶于meoh(20ml)中，向中滴加acoh(1.7ml,28.4mmol)，于冰浴条件下搅拌五分钟；另取氰基硼氢化钠(891.5mg,14.2mmol)，将其等分为质量相当的三份，每间隔十分钟向反应液中投入其中一份；待全部物料投放完毕，冰浴下搅拌两小时。点板确认原料反应完全，向反应液中加入乙酸乙酯(50ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液(30ml)、饱和食盐水溶液(30ml)，洗涤反应液，收集有机相以无水硫酸钠干燥，将有机相浓缩至干，硅胶柱(pe:ea，v:v＝1:1)分离纯化得白色固体13b(1.2g,3.2mmol)，产率：45％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.13(dt,j＝10.6,8.5hz,1h),7.01–6.87(m,2h),4.09(d,j＝14.1hz,2h),2.85–2.68(m,2h),2.62(d,j＝6.6hz,2h),2.37–2.30(m,1h),1.95(ddd,j＝9.1,5.8,3.2hz,1h),1.76(d,j＝14.7hz,2h),1.73–1.64(m,1h),1.47(s,9h),1.15–1.12(m,1h),1.11–1.04(m,2h),1.04–1.00(m,1h).
制备实施例14化合物14b
取化合物13b(979.0mg,2.67mmol)溶于dcm(5ml)，向其中加入4m盐酸二氧六环溶液(20ml)，室温搅拌两小时，点板确认原料反应完全，旋干反应液，得化合物14b的盐酸盐(白色粉末状固体，900.0mg,2.65mmol)，产率：99％。
1hnmr(500mhz,甲醇-d4)δ7.23–7.13(m,2h),7.05(ddt,j＝8.0,3.8,1.7hz,1h),3.48–3.42(m,2h),3.19(d,j＝7.0hz,2h),3.06(dd,j＝12.8,3.2hz,2h),3.04–3.01(m,1h),2.66(ddd,j＝10.3,6.6,3.5hz,1h),2.19(dqd,j＝11.0,7.3,3.5hz,1h),2.08(dq,j＝14.4,2.8hz,2h),1.66(ddd,j＝10.4,6.9,4.5hz,1h),1.63–1.53(m,2h),1.39(dt,j＝7.9,6.8hz,1h).
制备实施例15化合物2-2-2b
取化合物14b的盐酸盐(300.0mg,884.30μmol)与化合物11a(223.4mg,884.30μmol)溶于异丙醇与水的混合溶液(10ml,1:1,v/v)中，向其中滴加dipea(462.1μl,2.65mmol)，60℃下搅拌过夜，点板确认原料反应完全，向反应液中加入dcm(30ml)，依次以饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥有机相，将有机相浓缩至干，硅胶柱(ea:meoh，v:v＝20:1)分离纯化得2-2-2b的游离碱，用dcm(5ml)溶解该产物，滴加2m氯化氢乙醚溶液(2ml)，常温搅拌半小时，旋干反应液，得2-2-2b的盐酸盐(淡黄色粉末状固体，82.0mg,158.13μmol)，产率：18％。
1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.68(s,1h),7.86(s,1h),7.28–7.05(m,3h),4.98(s,2h),4.08(q,j＝10.6hz,2h),3.56(t,j＝12.3hz,2h),3.23(d,j＝6.9hz,2h),3.07(dt,j＝7.8,4.0hz,1h),2.66(ddd,j＝10.7,6.9,3.6hz,1h),2.43–2.30(m,1h),2.20–2.10(m,2h),1.71–1.64(m,1h),1.64–1.52(m,2h),1.44(q,j＝6.7hz,1h).
测试例
对本申请的化合物trans-2-1-1a、cis-2-1-1a、trans-2-1-1b、cis-2-1-1b、2-1-2a、2-1-2b、2-2-1a、2-2-1b、2-2-2a、2-2-2b进行活性测试，使用已知的menin-mll1蛋白-蛋白相互作用抑制剂mi-2-2和lsd1双靶点抑制剂ory-1001作为阳性对照。
1.menin-mll1相互作用抑制活性的测量方法：
实验采用人源重组menin全长蛋白与荧光标记的mll1多肽(吉尔生化合成)进行结合实验，通过荧光偏振的方法进行检测。(检测仪器：酶标仪envisiontm(perkinelmer,usa))。
将25μl酶(人源重组menin全长蛋白)、25μl底物(荧光标记的mll1多肽)和1μl不同浓度的待测化合物分别加入384反应板中(384welllowflangeblackflatbottompolystyren,corningincorporated)，酶标仪envisiontm(perkinelmer,usa)检测酶活性。同时设以dmso替代待测化合物的溶剂对照组、以mi-2-2替代待测化合物的阳性对照组和不添加待测化合物的空白对照组，每个样品每个浓度设3个复孔。其数据处理以浓度的对数值对活性百分数作图，然后采用非线性回归算出拟和曲线，利用软件graphpadprism5公式log(inhibitor)vs.response--variableslope计算得到ic50值，结果见表1。
2.lsd1抑制活性的测量方法：
lsd1体外活性实验
筛选方法：赖氨酸特异性去甲基化酶1(lsd1)活性筛选
仪器：酶标仪envisiontm(perkinelmer,usa)。
材料：人源重组lsd1，本实验室利用大肠杆菌表达系统表达并纯化获得的融合gst的lsd1蛋白片断(aa158-end)；
lsd1活性检测试剂盒lanceultralsd1histoneh3-lysine4demethylaseassay，购自perkinelmer公司；
h3多肽底物artk(me1)qtarkstggkaprkqla-gg-k(biotin)-nh2由吉尔生化公司合成。
原理：lsd1能够特异性去除h3多肽底物上k4位赖氨酸上的甲基化修饰，使其变成无甲基化修饰的底物。本方法采用组蛋白h3甲基化多肽(1-24)作为底物，在底物的c段引入生物素标记。当lsd1在fad的参与下，启动反应，能够去除底物h3k4上的甲基化修饰。在eu标记的h3k4本底抗体就能够与底物通过抗原抗体反应而结合在一起，同时链霉亲和素标记的受体通过链霉亲和素与生物素的特异性相互作用而结合在一起。从而使得eu标记的供体能够与链霉亲和素标记的受体相互作用。在荧光共振能量转移中，当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量将被释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体(acceptor)上，发射波长665nm。665nm的发射光仅由供体(donor)引起的fret产生。所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光。通过检测665nm和620nm两个发射波长的荧光信号比值能反应lsd1去甲基化活性。同时设置空白对照来判定酶活性的强弱。实验采用ory-1001作为阳性抑制剂。
样品处理：样品用dmso溶解，低温保存，dmso在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
初筛选择单浓度条件下，例如20μm，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％inhibition大于50，测试活性剂量依赖关系，即ic50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为graphpadprism5，拟合所使用的模型为sigmoidaldose-response(varibleslope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100，结果见表1。
3.mv4-11细胞增殖抑制活性的测量方法：
mv-4-11细胞用imdm加10％胎牛血清培养并收集，按3天，7天和10天的作用时间稀释细胞浓度，在96孔细胞板中每孔加入180ul细胞悬液，使其细胞数分别为8000个，2000个和1500个，同时设置不加细胞，只有imdm加10％胎牛血清培养基的空白组。对照细胞孔加入20ul终浓度为0.2％的dmso，化合物由10mm母液3倍梯度稀释，同样加20ul到化合物细胞孔(dmso终浓度为0.2％)。细胞放入37℃，5％co2培养箱孵育相应时间。按mts试剂盒配制反应液后，每孔加入20μl，37℃，5％co2培养箱孵育3-4小时。用酶标板读取490nm吸收光值，并以690nm吸收光值作为背景值，以od490-od690为最终原始数据。化合物的抑制率计算公式为：
抑制率＝(oddmso-od化合物)/(oddmso-od空白)×100％。化合物的增殖抑制ic50由graphpadprism5.0拟合。实验重复三次，每次用三个平行实验计算计算平均数和标准差，结果见表1。
表1化合物的menin-mll1相互作用抑制活性和mv4-11细胞活性。
a：0-100nm之间；b：100-300nm之间；c：300-1000nm之间；d：1-10μm之间；e：10-60μm之间。
sequencelisting
<110>中国科学院上海药物研究所
<120>一类含环丙胺结构的噻吩并[3,2-d]嘧啶衍生物、其制备方法与用途
<130>di17-8214-xc47
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>24
<212>prt
<213>artificial
<220>
<221>acetylation
<222>(1)..(24)
<223>人工序列
<400>1
alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro
151015
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20