一种基于Cereblon配体诱导BET降解的吡咯并吡啶酮类双功能分子化合物的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及一种基于cereblon配体诱导bet降解的吡咯并吡啶酮类双功能protac分子化合物，及其药学上可接受的盐、水合物、前药和以该化合物为活性成分的药物组合，以及在制备这些化合物和其药用组合物及其用于治疗或预防肿瘤、炎症、代谢等疾病中的应用。
背景技术：
：组蛋白赖氨酸乙酰化为一种重要的基因转录翻译后修饰力式。bet蛋白通过其结构中的溴结构域(bromodomain)识别乙酰赖氨酸(kac)发挥作用，bet功能异常与肿瘤、炎症、代谢等多种疾病有关。抑制bet蛋白与kac的结合，可有效地抑制肿瘤和炎症等多种疾病。bet家族蛋白包括brd2、brd3、brd4以及brdt四种亚型，其中研究最深入的是brd4蛋白，研究表明brd4被募集到靶基因的超增强子区域，促进c-myc，bcl-x1和bcl-6等致癌基因的转录。由于brd4在调节致癌基因转录中的关键作用，使其成为潜在的抗肿瘤靶点。近年来bet抑制剂发展迅速，有十多个抑制剂处于早期临床研究，例如ibet-762，otx-015和abbv-075等。bet抑制剂对中线癌、急性髓性白血病、前列腺癌等多种肿瘤显示出良好疗效。研究发现抑制brd4蛋白往往需要将药物长期维持在较高浓度，高剂量给药会因为负反馈而导致brd4蛋白富集，因而使得对其的抑制效果大大减弱；此外，在bet抑制剂对某些肿瘤的研究中(如三阴乳腺癌)中观察到了明显的耐药现象。针对bet蛋白药物的上述问题，更有效的新型药物有待进一步开发。蛋白水解靶向嵌合体protac(proteolytictargetingchimera)技术，将靶向蛋白的小分子药物，和e3泛素连接酶配体通过连接臂片段连接起来，同时结合于靶蛋白与e3泛素连接酶，使靶蛋白泛素化进而使得蛋白酶体降解靶蛋白。相比传统小分子，protac技术具有可用于难成药蛋白降解、克服给药后蛋白富集现象和耐药性、降解效力强以及在低浓度时即可保持催化降解作用等优势。protac技术已用于多种靶点药物的改造，arvinas公司开发的雄激素受体蛋白降解剂protac(治疗前列腺癌)已进入i期临床研究。运用protac技术进行新药分子研发有很高的优势和可行性，protac分子可能成为下一代极具前途的新型药物。技术实现要素：本发明的目的在于提供一类靶向降解bet蛋白的化合物及其制备与应用，具体为基于cereblone3泛素连接酶配体的吡咯并吡啶酮类双功能protac分子及其制备方法，以及该类化合物作为bet蛋白降解剂在治疗或预防肿瘤、炎症、代谢等疾病中的应用。本发明的目的在于提供一些新的吡咯并吡啶酮类双功能小分于及其药学上可接受的盐、水合物、前药和以该化合物为活性成分的药物组合。这些化合物有诱导bet蛋白降解的功能，可用于制备新型抗肿瘤药物。所述肿瘤可为但不限于多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性粒细胞白血病、慢性白血病、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或胰腺癌。本发明的目的还在于提供一种合成新的吡咯并吡啶酮类双功能小分子的制备方法。本发明的另一目的在于提供一种含有新的吡咯并吡啶酮类双功能小分子的药物制剂。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：如式i所示的吡咯并吡啶酮类双功能分子化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，a-l-bi其中：所述的a是吡咯并吡啶酮类bet蛋白抑制剂或其衍生物；所述的b是e3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白的小分子配体，其选自酰胺类化合物、邻苯二酰亚胺类化合物、沙利度胺、沙利度胺衍生物、来那度胺、来那度胺衍生物、泊马度胺或泊马度胺衍生物；所述的l是连接臂，l选自脂肪链或芳香链；其中，连接臂l通过共价键与a和b相连。其中，所述的l为式ii所示的任意结构之一：其中：n选自1-10之间的整数。其中，所述的b为式iii所示的任意结构之一：其中：w选自ch2、c＝o、so2、nh、n-烷基；x选自o、s；y选自nh、n-烷基、n-芳基、n-杂环、n-环烷基、o、s；z选自-烷基、-环烷基、-cl、-f、-h；g、g′选自-h、烷基、-oh、-ch2-杂环；r1选自-h、-d、-f、-cl、-br、-i、-no2、-cn、-nh2、-oh、-ch3、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3、-ch2ch3；本发明优选涉及如通式iv所示的吡咯并吡啶酮类双功能分子化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药：其中：r1、r2、r3、r4相同或不同，分别独立地选自-h、-d、-f、-cl、-br、-i、-no2、-cn、-nh2、-oh、-ch3、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3、-ch2ch3；r5选自c1-c6烷基、-h、-d、-f、-cl、-br、-l、-no2、-cn、-nh2、-oh、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3、-nhso2ch3、-nhso2c2h5、-nhco2ch3、-nhco2c2h5、-nhco2c3h7、-nhco2c4h9、-nhco2ch(ch3)2、-so2ch3、-so2c2h5；m选自未取代、-ch2-、-co-、-c(h)(oh)-、-(ch2)mo-、-(ch2)s(o)n、-(ch2)mn(ra)-，其中m独立地是0或1，n独立地是0、1或2，其中ra选自h、c1-c3烷基、c1-c3卤代烷基、(c2-c3业烷基)-oh或未取代的环丙基；r6选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基烷基、rb或-(c1-c6亚烷基)-rb，其中每一rb独立地选自芳基、杂环、环烷基或环烯基，并且每一rb独立地选自未取代或被1-5个rc取代，其中rc独立地选自c1-c6烷基、c1-c6卤代烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷氧基烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、-f、-c1、-br、-i、-no2、-cn、-nh2、-cooh、-co-取代单环芳基、-co-取代单环杂环基、-取代单环芳基、-取代单环杂环基；r7选自-h、c1-c6烷基；l为式v中的任意一种：n选自1-10之间的整数。本发明更优选涉及如通式vi所示的双功能小分子或其药学上可接受的盐、水合物或前药：其中：r1、r2、r3、r4相同或不同，分别独立地选自-h、-f、-cl、-br、-ch3、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3；r7选自-h、-ch3、-ch2ch3；l为式vii中的任意一种：n选自1-6之间的整数。本发明的优选化合物包括，但不限于：通式vi所示的化合物可以含有不对称或手性中心，因此可以以不同立体异构形式存在。本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及他们的混合物，如外消旋物，均包括在本发明的范围内。通式vi所示的化合物还可以以不同互变异构形式存在，所有这些形式均包括在本发明范围内。属于“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能垒相互转化的不同能量的结构异构体。根据本发明，药学上可接受的盐包括与下列酸形成的加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸、琥珀酸以及类似的已知可以接受的酸成盐。此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。本发明衍生物的前药是通式vi的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。其中，所述的吡咯开吡啶酮类双功能分子化合物是由中间体viii或ix制备得到，其中，r2、r3、r4相同或不同，分别独立地选自-h、-f、-cl、-br、-ch3、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3；r7选自-h、-ch3、-ch2ch3。其中，所述的吡咯并吡啶酮类双功能分子化合物的制备方法如下：其中，步骤a为化合物①与对甲苯磺酰氯反应得到化合物②；步骤b为化合物②与替氮钠反应得到化合物③；步骤c为化合物③与溴乙酸叔丁酯反应得到化合物④；步骤d为化合物④与三氟乙酸反应得到化合物⑤；步骤e为化合物⑤与二氯亚砜反应得到化合物⑥；步骤f为化合物⑥与cereblon蛋白的小分子配体反应得到化合物⑦；步骤g为化合物⑧与cereblon蛋自的小分子配体反应得到化合物⑨；步骤h为化合物⑨与三氟乙酸反应得到化合物⑩；步骤j为化合物viii与化合物⑦反应得到通式via表示的化合物；步骤k为化合物ix与化合物⑩反应得到通式vib表示的化合物；其中，via和vib为通式vi的两个部分；其中：r1、r2、r3、r4相同或不同，分别独立地选自-h、-f、-cl、-br、-ch3、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3；r7选自-h、-ch3、-ch2ch3；n选自1-6之间的整数。其中，具体的步骤如下：步骤a：将化合物①溶于适量吡啶中，分批加入对甲苯磺酰氯，室温搅拌一段时间后，加入适量的盐酸水溶液，经乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，洗脱得到化合物②。步骤b：将化合物②利叠氮化钠溶于适量丙酮和水的混合溶液中，加热回流后，加入适量水，经乙酸乙酯萃取，饱和碳酸钠水溶液洗，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到化合物③。步骤c：将化合物③和溴乙酸叔丁酯溶于适量四氢呋喃中，在冰水浴中搅拌一段时间，分批加入氢化钠，继续在冰水浴中反应一段时间后，然后再室温反应一段时间，加适量甲醇淬灭，加入适量水，经乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，洗脱得到化合物④。步骤d：将化合物④溶于适量三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温反应一段时间后，减压浓缩，得到化合物⑤。步骤e：将化合物⑤溶于适量二氯甲烷中，加入适量的二氯亚砜，再滴加n，n-二甲基甲酰胺催化，加热回流后，减压浓缩，得到化合物⑥。步骤f：将cereblon蛋白的小分子配体溶于适量n-甲基吡咯烷酮中，加入化合物⑥，室温反应一段时间后，加入适量水，有固体析出，抽滤，干燥得粗品，通过硅胶柱色谱层析纯化，洗脱得到化合物⑦。步骤g：将cereblon蛋白的小分子配体，化合物⑧和吡啶溶于适量乙腈中，缓慢滴加三氯氧磷的乙腈溶液，滴加完后室温反应一段时间后，减压浓缩，加入适量水，经乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，洗脱得到化合物⑨。步骤h：将化合物⑨溶于适量三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温反应一段时间后，减压浓缩，得到化合物⑩。步骤j：将化合物viii，化合物⑦和五水合硫酸铜溶于适量的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液中，室温搅拌一段时间，加入抗坏血酸钠，室温反应一段时间后，加入适量水，经二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，尤水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，洗脱得到化合物via。步骤k：将化合物ix，化合物⑩，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和三乙胺溶于适量无水四氢呋喃中，室温反应一段时间后，减压浓缩，加入适量水，经乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，得到化合物vib。其中：r1、r2、r3、r4相同或不同，分别独立地选自-h、-f、-cl、-br、-ch3、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3；r7选自-h、-ch3、-ch2ch3；n选自1-6之间的整数。一种药物组合物含有治疗有效量的上述化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、水合物、前药以及药学上可接受的载体、稀释剂、辅剂、媒介物，或它们的组合。其中，所述的剂型为注射剂、片剂和胶囊剂中的任意一种。上述的化合物及其药学上可接受的盐或上述的组合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。其中，所述肿瘤可为但不限于多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性髓细胞性白血病、慢性白血病、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、胰腺癌。附图说明图1是单浓度给药条件下本发明实施例化合物1、2、9和10在mv-4-11细胞系中对bet蛋白的降解作用和c-myc的表达抑制示意图。图2是浓度梯度给药条件下本发明实施例化合物1和2在mv-4-11细胞系中对bet蛋白的降解作用与c-myc的表达抑制示意图。图3是浓度梯度给药条件下本发明实施例化合物9和10在mv-4-11细胞系中对bet蚩白的降解作用与c-myc的表达抑制示意图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。化合物的结构通过核磁共振(1h-nmr)和/或质谱(ms)来确定。nmr测定是用acf-300bruk型或avanceneo400mhz核磁共振仪，测定溶剂为氘代氯仿(cdcl3)或氘代二甲亚砜(dmso-d6)，tms为内标。ms的测定用hp1100型质谱仪。柱层析采用200-300目硅胶(青岛海洋化工厂生产)。实施例1：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-((1-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)-1h-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(1)，其结构式如下：步骤1：制备2-羟基乙基-4-甲基苯磺酸酯(1a)将乙二醇(3.91g，62.95mmol)浴于5ml吡啶中，分批加入对甲苯磺酰氯(6g，31.47mmol)，室温搅拌4小时后，加入6mol/l盐酸(40ml)，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，尤水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝20/1-10/1)洗脱得到无色液体，重2g，收率29.39％。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ(ppm)：7.81(d，j＝8.3hz，2h)，7.36(d，j＝8.0hz，2h)，4.16-4.12(m，2h)，3.85-3.78(m，2h)，2.45(s，3h)，2.01(d，j＝19.0hz，1h).步骤2：制备2-羟基乙基叠氮(1b)将1a(1.2g，5.55mmol)和叠氮化钠(0.72g，11.1mmol)溶于5ml丙酮和5ml水混合液中，加热回流16小时，加入20ml水，用乙酸乙酯萃取，饱和碳酸钠水溶液洗，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，得到无色液体，重0.41g，收率84.85％。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ(ppm)：3.82-3.74(m，2h)，3.49-3.39(m，2h)，2.01(s，1h).步骤3：制备2-叠氮乙氧基乙酸叔丁酯(1c)将1b(0.41g，4.71mmo1)和溴乙酸叔丁酯(1.1g，5.65mmol)溶于15ml四氢呋喃中，在冰水浴中搅拌10分钟，分批加入氢化钠(0.38g，9.42mmol)，继续在冰水浴中反应0.5小时后，室温反应3小时，加适量甲醇淬灭，加入30ml水，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝30/1-20/1)洗脱得到无色液体，重0.41g，收率43.28％。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ(ppm)：4.06-4.00(m，2h)，3.76-3.70(m，2h)，3.48-3.41(m，2h)，1.49(d，j＝5.8hz，9h).步骤4：制备2-叠氮乙氧基乙酸(1d)将1c(0.41g，2.04mmol)溶于4ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸，室温反应3小时后，减压蒸去有机溶剂，得到棕色液体，重0.29g。步骤5：制备2-叠氮乙氧基乙酰氯(1e)将1d(0.29g，2.03mmol)溶于4ml二氯甲烷中，加入1ml二氯亚砜，再加入2滴dmf催化，加热回流4小时后，减压蒸去有机溶剂，得到褐色液体，重0.33g。步骤6：2-(2-叠氮乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(1f)将米那度胺(0.3g，1.16mmol)溶于3mln-甲基吡咯烷酮中，加入1e(0.38g，2.31mmol)，室温反应4小时后，加入20ml水，有固体析出，抽滤，干燥得粗品，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(v/v＝150/1-100/1)洗脱得到黄色固体，重0.26g，收率58.16％。步骤7：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-((1-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氮基)-2-氧代乙氧基)乙基)-1h-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(1)将4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-6-甲基-7-氧代-n-(丙-2-炔-1-基)-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(0.06g，0.111mmol)，1f(0.06g，0.111mmol)和五水合硫酸铜(0.009g，0.044mmol)溶于2ml二氯甲烷，2ml甲醇和2ml水混合液中，室温搅拌10分钟，加入抗坏血酸钠(0.006g，0.022mmol)，室温反应4小时后，加入20ml水，用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(v/v＝100/1-30/1)洗脱得到黄色固体，重0.069g，收率58.70％。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：12.34(s，1h)，11.01(s，1h)，9.76(d，j＝51.5hz，2h)，8.88(s，1h)，8.07(s，1h)，7.74(s，1h)，7.51(d，j＝20.4hz，2h)，7.28(d，j＝48.0hz，4h)，6.97(dd，j＝40.7，23.7hz，4h)，5.14(s，1h)，4.61(s，2h)，4.50(s，2h)，4.38(d，j＝12.0hz，2h)，4.14(s，2h)，3.96(s，2h)，3.53(s，3h)，3.10(s，2h)，2.91(s，1h)，2.58(s，1h)，2.42-2.32(m，1h)，2.02(s，1h)，1.22(s，3h).ms(esi，m/z)：925.00[m-h].实施例2：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-((1-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)-1h-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-6-甲基-7-氧代-6，7--二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(2)，其结构式如下：将实施例1步骤1中的乙二醇换为一缩二乙二醇，合成方法同实施例1。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：12.35(s，1h)，11.01(s，1h)，9.83(s，1h)，9.68(s，1h)，8.87(s，1h)，7.99(s，1h)，7.72(d，j＝7.9hz，1h)，7.54(d，j＝7.0hz，1h)，7.52-7.45(m，1h)，7.34(d，j＝6.6hz，3h)，7.22(d，j＝8.7hz，1h)，7.06(d，j＝6.0hz，1h)，7.00(d，j＝7.8hz，1h)，6.95-6.81(m，2h)，5.13(d，j＝8.5hz，1h)，4.50(d，j＝12.7hz，4h)，4.43-4.30(m，2h)，4.09(s，2h)，3.84(s，2h)，3.62(d，j＝4.5hz，4h)，3.52(s，3h)，3.10(d，j＝7.1hz，2h)，2.89(d，j＝12.6hz，1h)，2.60(s，1h)，2.35(d，j＝13.8hz，1h)，2.00(d，j＝10.0hz，1h)，1.24-1.20(t，3h).ms(esi，m/z)：969.06[m-h]-.实施例3：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-((1-(2-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1h-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(3)，其结构式如下：将实施例1步骤1中的乙二醇换为二缩三乙二醇，合成方法同实施例1。1hnmr(300mhz，dmso)δ(ppm)：12.33(s，1h)，11.00(s，1h)，9.82(s，1h)，9.67(s，1h)，8.86(s，1h)，7.96(s，1h)，7.73(d，j＝7.5hz，1h)，7.52(dt，j＝15.0，7.5hz，2h)，7.40-7.30(m，3h)，7.23(dd，j＝8.8，2.6hz，1h)，7.13-6.97(m，2h)，6.94(d，j＝8.7hz，1h)，6.89(d，j＝2.2hz，1h)，5.14(dd，j＝13.3，5.0hz，1h)，4.48(dd，j＝9.3，4.9hz，4h)，4.37(d，j＝6.7hz，2h)，4.11(s，2h)，3.77(t，j＝5.0hz，2h)，3.64-3.61(m，2h)，3.54(d，j＝4.7hz，2h)，3.53(s，3h)，3.50(s，4h)，3.11(d，j＝7.4hz，2h)，2.96-2.86(m，1h)，2.59(d，j＝17.7hz，1h)，2.36(d，j＝9.1hz，1h)，2.02(s，1h)，1.22(t，j＝5.6hz，3h).ms(esi，m/z)：1013.05[m-h]-.实施例4：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-((1-(14-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉--4-基)氨基)-14-氧代-3，6，9，12-四氧十四烷基)-1h-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-6-甲基-7-氧代-6，7--二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(4)，其结构式如下：将实施例1中步骤1中的乙二醇换为三缩四乙二醇，合成方法同实施例1。1hnmr(300mhz，dmso)δ(ppm)：12.34(s，1h)，11.00(s，1h)，9.82(s，1h)，9.67(s，1h)，8.86(s，1h)，7.95(s，1h)，7.72(d，j＝7.2hz，1h)，7.52(dt，j＝15.1，7.4hz，2h)，7.34(s，3h)，7.23(d，j＝8.9hz，1h)，7.03(dd，j＝17.9，8.3hz，2h)，6.96-6.87(m，2h)，5.14(d，j＝8.6hz，1h)，4.48(s，4h)，4.37(d，j＝6.4hz，2h)，4.12(s，2h)，3.77(s，2h)，3.65(s，2h)，3.54(s，2h)，3.53(s，3h)，3.43(d，j＝11.6hz，8h)，3.10(d，j＝7.4hz，2h)，2.91(t，j＝12.9hz，1h)，2.59(d，j＝17.7hz，1h)，2.34(t，j＝13.6hz，1h)，1.99(d，j＝4.4hz，1h)，1.23-1.21(t，3h).ms(esi，m/z)：1081.20[m+na]+.实施例5：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-(3-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-3-氧代丙基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(5)，其结构式如下：步骤1：制备(3-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异二氢吲哚-4-基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(5a)将3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2，6-二酮(0.3g，1.16mmol)，3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(0.26g，1.39mmol)和吡啶(0.27g，3.47mmol)溶于5ml乙腈中，缓慢滴加三氯氧磷(0.21g，1.39mmol)的乙腈溶液，滴加完后室温反应2小时后，减压蒸去有机溶剂，加入20ml水，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(v/v＝100/1-30/1)洗脱得到黄色固体，重0.28g，收率56.21％。步骤2：制备3-氨基-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)内酰胺(5b)将5a溶于4ml二氯甲烷和1ml三氟乙酸中，室温反应2小时后，减压蒸去溶剂，得到淡黄色固体，为三氟乙酸盐，重0.23g，收率79.57％。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：11.04(s，1h)，10.08(s，1h)，7.83(dd，j＝9.8，8.3hz，4h)，7.52(q，j＝7.4hz，2h)，5.17(dd，j＝13.3，5.1hz，1h)，4.38(d，j＝14.0hz，2h)，3.10(s，2h)，2.99-2.88(m，1h)，2.75(s，2h)，2.62(d，j＝17.4hz，1h)，2.31(qd，j＝13.1，4.3hz，1h)，2.08-1.99(m，1h).ms(esi，m/z)：331[m+h]+.步骤3：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-(3-((2-(2，6-二氧代哌啶-3.-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-3-氧代丙基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(5)将4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-羧酸(0.06g，0.119mmol)，5b(0.6g，0.131mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edci(0.03g，0.143mmol)，1-羟基苯并三唑hobt(0.02g，0.143mmol)和三乙胺(0.02g，0.238mmol)溶于5ml无水四氢呋喃中，室温反应3h，减压蒸去四氢呋喃，加入20ml水，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(v/v＝50/1-20/1)洗脱得到淡黄色固体，重0.05g，收率51.43％。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：12.33(s，1h)，10.96(s，1h)，9.85(d，j＝40.3hz，2h)，8.53(s，1h)，7.82(d，j＝5.5hz，1h)，7.50(d，j＝7.4hz，2h)，7.35(s，3h)，7.24(d，j＝8.1hz，1h)，7.07(d，j＝5.3hz，1h)，7.02-6.89(m，2h)，6.87(s，1h)，5.09(d，j＝8.4hz，1h)，4.34(s，2h)，3.58(s，2h)，3.55(s，3h)，3.11(d，j＝6.9hz，2h)，2.87(d，j＝12.5hz，1h)，2.68(s，2h)，2.56(s，1h)，2.23(dd，j＝27.0，13.4hz，1h)，1.96(dd，j＝15.4，9.6hz，1h)，1.22(t，j＝1.7hz，3h).ms(esi，m/z)：813.85[m-h]-.实施例6：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-(4-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-4-氧代丁基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(6)，其结构式如下：将实施例5步骤1中的3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸换为4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸，合成方法同实施例5。1hnmr(400mhz，dmso)δ12.23(s，1h)，10.98(s，1h)，9.80(s，2h)，8.38(s，1h)，7.80(d，j＝6.6hz，1h)，7.48(d，j＝10.2hz，2h)，7.34(s，3h)，7.23(d，j＝8.5hz，1h)，7.06(d，j＝5.1hz，1h)，7.02-6.92(m，2h)，6.85(s，1h)，5.13(d，j＝12.8hz，1h)，4.37(d，j＝5.2hz，2h)，3.54(s，3h)，3.32(s，2h)，3.11(d，j＝6.9hz，2h)，2.89(d，j＝12.9hz，1h)，2.60(d，j＝17.5hz，1h)，2.44(s，2h)，2.34(d，j＝12.8hz，1h)，2.03(s，1h)，1.86(s，2h)，1.23(s，3h).ms(esi，m/z)：827.90[m-h]-.实施例7：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-(5-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-5-氧代戊基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(7)，其结构式如下：将实施例5步骤1中的3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸换为5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸，合成方法同实施例5。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：12.25(s，1h)，10.98(s，1h)，9.78(d，j＝10.6hz，2h)，8.34(s，1h)，7.83(d，j＝7.0hz，1h)，7.48(dd，j＝11.7，4.6hz，2h)，7.34(s，3h)，7.28-7.19(m，1h)，7.05(dd，j＝9.0，5.7hz，1h)，7.02-6.89(m，2h)，6.84(s，1h)，5.13(dd，j＝13.1，4.7hz，1h)，4.37(q，j＝17.6hz，2h)，3.54(s，3h)，3.34-3.31(m，2h)，3.18-3.05(m，2h)，2.89(d，j＝13.1hz，1h)，2.59(d，j＝18.3hz，1h)，2.46-2.38(m，2h)，2.35(d，j＝13.2hz，1h)，2.03(s，1h)，1.68(s，2h)，1.58(d，j＝5.3hz，2h)，1.23(t，j＝7.3hz，3h).ms(esi，m/z)：841.90[m-h]-.实施例8：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-(6-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-6-氧代己基)-6-甲基.7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(8)，其结构式如下：将实施例5步骤1中的3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸换为6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸，合成方法同实施例5。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：12.24(s，1h)，10.98(s，1h)，9.77(d，j＝25.4hz，2h)，8.31(s，1h)，7.80(d，j＝7.1hz，1h)，7.53-7.42(m，2h)，7.34(s，3h)，7.24(d，j＝8.6hz，1h)，7.10-7.02(m，1h)，6.97(dd，j＝17.8，8.1hz，2h)，6.83(s，1h)，5.21-5.08(m，1h)，4.38(t，j＝12.2hz，2h)，3.54(s，3h)，3.31(s，2h)，3.11(d，j＝7.3hz，2h)，2.89(d，j＝12.4hz，1h)，2.60(d，j＝17.4hz，1h)，2.37(s，2h)，2.34(s，1h)，2.02(s，1h)，1.65(s，2h)，1.56(s，2h)，1.38(s，2h)，1.22(t，j＝7.4hz，3h).ms(esi，m/z)：855.95[m-h]-.实施例9：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-(7-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-7-氧代庚基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(9)，其结构式如下：将实施例5步骤1中的3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸换为7-((叔丁氧基羰基)氨基)庚酸，合成方法同实施例5。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：12.29(s，1h)，11.02(s，1h)，9.81(d，j＝24.8hz，2h)，8.32(s，1h)，7.81(s，1h)，7.49(s，2h)，7.35(s，3h)，7.22(s，1h)，7.06(s，1h)，7.02-6.89(m，2h)，6.84(s，1h)，5.14(d，j＝10.8hz，1h)，4.36(d，j＝6.9hz，2h)，3.54(s，3h)，3.24(s，2h)，3.10(s，2h)，2.91(s，1h)，2.59(d，j＝15.8hz，1h)，2.36(s，2h)，2.18(s，1h)，2.01(s，1h)，1.62(s，2h)，1.52(s，2h)，1.35(s，4h)，1.23(s，3h).ms(esi，m/z)：869.95[m-h]-.实施例10：制备4-(2-(2，4-二氟苯氧基)-5-(乙基磺酰胺基)苯基)-n-(8-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-8-氧代辛基)-6-甲基-7-氧代-6，7-二氢-1h-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺(10)，其结构式如下：将实施例5步骤1中的3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸换为8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酸，合成方法同实施例5。1hnmr(400mhz，dmso)δ(ppm)：12.29(s，1h)，11.03(s，1h)，9.80(d，j＝29.2hz，2h)，8.31(s，1h)，7.81(s，1h)，7.49(s，2h)，7.34(s，3h)，7.23(d，j＝7.2hz，1h)，7.06(s，1h)，7.02-6.91(m，2h)，6.83(s，1h)，5.14(d，j＝12.6hz，1h)，4.36(q，j＝16.6hz，2h)，3.54(s，3h)，3.23(s，2h)，3.10(s，2h)，2.91(s，1h)，2.60(d，j＝16.8hz，1h)，2.35(s，2h)，2.34-2.26(m，1h)，2.01(s，1h)，1.61(s，2h)，1.50(s，2h)，1.33(s，6h)，1.23(s，3h).ms(esi，m/z)：883.95[m-h]-.实施例11：化合物的蛋白水平活性测定化合物与brd4蛋白n端第一个bromodomain结构域(以下称作brd4(bd1))的结合活性测试采用的是alphascreen检测技术。化合物初筛浓度为0.5μm。配制hepes缓冲液(50mmhepes，100mmnacl，0.1％bsa，0.05％chaps，ph7.5)用于制备brd4(bd1)蛋白、biotin标记的组蛋白h4、待测化合物(dmso0.1％)、donorbeads和acceptorbeads溶液。取384孔板一块，按照布置，板上分待测化合物孔、空白对照孔(min，max)、阳性药对照孔。向待测化合物孔和阳性药孔分别加入不同浓度的化合物溶液5μl，空白加入缓冲液5μl(dmso0.1％)。继续向除空白对照孔(min)外的各孔加入brd4(bd1)蛋白溶液5μl，向空白对照孔(min)加入缓冲液5μl。室温下孵育15分钟后，每孔加入biotin标记的组蛋白h4溶液5μl，继续在室温下孵育1小时后，加入donorbeads和acceptorbeads溶液15μl，避光室温孵育1小时后用enspire检测仪的alphamode(λex＝680，λem＝570)读取荧光数值。数值处理：抑制率＝(max-signal)/(max-min)×100％其中：max：biotin标记的组蛋白h4与蛋白完全结合的值min：biotin标记的组蛋白h4本底值signal：化合物相应浓度下的值以化合物浓度和相应的抑制率做s曲线。得到相应化合物的ic50。化合物的实验结果见表1：表1化合物对brd4(bd1)的抑制活性结果化合物编号抑制率(％)at0.5μmic50(μm)11000.002721000.003431000.003741000.012051000.008461000.002771000.002381000.002191000.0030101000.0030abbv-0751000.0025本发明实施例化合物对bet蛋白brd4(bd1)的抑制作用如下：如表1所示，实施例化合物与abbv-075在0.5μm时对brd4(bd1)的抑制率均达到100％，实施例化合物与abbv-075的ic50相当，均在纳摩尔级别，表明本发明实施例化合物保持了强效的bet蛋白抑制活性。实施例12：mtt法测定化合物对肿瘤细胞增殖抑制活性取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，90μl/孔，置恒温co2培养箱中培养24小时。加入受试药物，10μl/孔，培养72小时。将mtt试剂加入96孔板中，10μl/孔，培养箱中反应4小时吸去上清液，加入二甲亚砜，100μl/孔，待结晶溶解后，用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制率。以化合物浓度和相应的抑制率做s曲线。得到相应化合物的ic50。表2化合物对人急性单核细胞白血病细胞mv-4-11，人b淋巴细胞瘤细胞ramos的抗增殖活性表3化合物对人结直肠癌细胞dld-1和hct-116，人非小细胞肺癌a549的抗增殖活性n.d.＝notdetermined，表示未确定。本发明实施例化合物对肿瘤细胞的增殖抑制活性如下：如表2和表3所示，实施例化合物对肿瘤细胞株mv-4-11、ramos、dld-1、hct-116和a549均表现出显著的抗增殖活性，且部分化合物的抗增殖活性显著优于abbv-075。在mv4-11、ramos、dld-1和hct-116细胞株中，实施例化合物与abbv-075的活性相当；在a549细胞株中，相比于abbv-075，部分化合物的抗增殖活性从微摩尔级别提升到纳摩尔级别，其中实施例化合物3对a549的抗增殖活性提高了13倍。综上，本发明实施例化合物抗肿瘤作用显著，相比abbv-075仍保持了强效的肿瘤细胞抗增殖活性。实施例13：western-blot测定化合物对bet蛋白的降解作用与c-myc的表达抑制细胞蛋白样品的制备：人急性单核细胞白血病细胞mv-4-11传代培养后，取生长状态良好的细胞，离心更换新鲜培养液，制成2×106个/ml细胞悬液，接种于6孔板，1ml/孔，于37℃，5％co2细胞孵育箱中培养过夜。加入受试药物后，培养相应时间后收细胞。将处理后的细胞转移至新离心管中，1200rpm离心5min后收集，pbs洗一遍后，每一样品加入100μl的ripa裂解液，冰上裂解30min后，12000rpm离心15min，上清转移至新离心管中，加入5×sds-page蛋白上样缓冲液，混匀后100℃变性5min，-20℃保存或直接用于western-blot检测。蛋白免疫印迹实验(western-blot，wb)具体步骤如下：配制合适浓度的sds-page胶：分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％。根据蛋白定量结果，调整上样体积。蛋白样品在浓缩胶中电压为80v，进入分离胶后电压调至120v。待溴酚蓝完全跑出page胶时停止电泳。安装转膜装置，放入冰水浴中，100v恒压转膜1.5小时。取出pvdf膜，浸没于5％脱脂牛奶的tbst溶液中，置于摇床室温封闭1小时。tbst缓冲液洗涤3次，加入相应稀释比例的一抗，置于4℃孵育过夜。tbst缓冲液洗涤3次，每次10min。加入一定稀释比例的二抗，室温孵育1小时。tbst缓冲液洗涤3次，每次10min。使用li-cor公司的odyssey近红外双色激光成像系统曝光。本发明实施例化合物对bet蛋白的降解作用与c-myc的表达抑制情况如下：如图1所示，当给药浓度均为100nmol/l时，在mv-4-11细胞系中，在westem-blot实验结果中可观察到实施例化合物1、2、9和10对brd4蛋白具有明显的降解作用，abbv-075对brd4蛋白无降解作用；实施例化合物1、2、9和10对c-myc的表达抑制效果优于abbv-075。本发明实施例化合物对bet蛋白的降解与c-myc的表达抑制情况如下：如图1所示，当给药浓度均为100nmol/l时，在mv-4-11细胞系中，在western-blot实验结果中可观察到，相对于空白对照与abbv-075组，实施例化合物1、2、9和10对brd4蛋白具有明显的降解作用且对c-myc具有明显的表达抑制作用，其中实施例化合物9和10可对brd4蛋白达到完全降解，abbv-075对brd4蛋白无降解作用；实施例化合物1、2、9和10对c-myc的表达抑制效果优于abbv-075。如图2所示，当实施例化合物1与2的给药浓度为1、3、10、30、100nm/l时，在mv-4-11细胞系中，在western-blot实验结果中可观察到化合物1与2以对brd4蛋白的降解作用和c-myc的表达抑制呈浓度依赖性。具体表现为当给药浓度为1nmol/l时，化合物1和2对brd4蛋白的降解和c-myc的表达抑制作用较弱，无明显现象，随着给药浓度增加，化合物1和2对brd4蛋白的降解和c-myc的表达抑制作用逐渐增强，并在100nmol/l时达到对brd4蛋白的完全降解和对c-myc表达的完全抑制。如图3所示，当实施例化合物9与10的给药浓度为1、3、10、30、100nm时，在mv-4-11细胞系中，在western-blot实验结果中可观察到化合物9与10以对brd4蛋白的降解作用和c-myc的表达抑制呈浓度依赖性。具体表现随着给药浓度增加，化合物9和10对brd4蛋白的降解和c-myc的表达抑制作用逐渐增强，并在100nmol/l时达到对brd4蛋白的高效降解和对c-myc表达的完全抑制。综上所述，本发明实施例化合物具有显著的bet蛋白降解与细胞增殖抑制作用，且抑制效果优于abbv-075，说明本发明实施例化合物可制备为抗肿瘤药物，用于肿瘤治疗或预防。实施例14：片剂用含有权利要求1中化合物(以实施例1化合物为例)10g，按照药剂学一般压片法加辅料20g混匀后，压制成100片，每片重300mg。实施例15：胶囊剂用含有权利要求1中化合物(以实施例1化合物为例)10g，按照药剂学胶囊剂的要求将辅料20g混匀后，装入空心胶囊，每个胶囊重300mg。实施例16：注射剂用含有权利要求1中化合物(以实施例1化合物为例)10g，按照药剂学常规方法，进行活性炭吸附，经0.65μm微孔滤膜过滤后，填入氮气罐制成水针制剂，每只装2ml，共灌装100瓶。尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。当前第1页12