本申请要求于2017年3月5日提交的美国临时专利申请第62/470,211号以及于2018年2月22日提交的美国专利申请第15/901,900号的权益，所述临时专利申请的内容以参考的方式并入本文中。
本发明涉及用于检测靶核酸或靶细胞的方法和装置，具体涉及采用实时数字pcr以检测靶核酸和靶细胞的方法和装置。
背景技术：
聚合酶链式反应(pcr)是一种使用dna聚合酶和dna聚合反应以使特定核苷酸产生数以千万计的拷贝数的方法。通常它经历不同温度下的热循环使之可重复地进行双链dna变性、靶dna序列引物退火、以及延伸引物以生成靶序列的拷贝。pcr是分子生物学中不可或缺的技术，其广泛应用于检测、鉴定、获得和定量目的dna/rna序列。
定量pcr，也称之为实时qpcr，是一种在pcr扩增循环中通过监测靶序列的生成来量化靶序列的量的技术。通过非特异性荧光染料或者通过序列特异性dna探针实时地监测靶序列的生产量，其中该非特异性荧光染料因嵌入双链dnas上而产生荧光，而该序列特异性dna探针一旦杂化至互补序列上就会发出可检测的荧光信号。在qpcr过程中，该基于dna的荧光值可以在pcr循环中的任意时间测量。靶序列的量通过计算ct值来确定，ct是当被检测到的荧光水平超过阈值(显著高于背景噪音水平)时的循环数阈值。通过比较来自于靶序列的rna/dna的ct与来自相同样品的管家参考基因的rna/dna的ct，可以确定基因表达的相对量。绝对量是很难获得的，通常是与已知的dna稀释法构建的标准曲线相比对而得到。诸如pcr扩增效率的变化和非指数扩增这些因素可以影响定量结果的准确性，并且限制了其辨别基因数量小倍数差异的能力。
数字pcr(dpcr)是pcr技术的改进，实现了对核酸链的绝对定量。该dpcr通过将一种pcr反应分成许多更小的pcr反应(每个小的反应平均包括不超过一个靶核酸分子)来改进传统的pcr。每个小的反应都大约包括1或0个靶核酸分子，并且在pcr扩增结束时给出阳性或阴性二进制读数。确定阳性读数的比例后，可以根据泊松统计模型计算靶基因的绝对比例。dpcr通过计算实际的靶分子数确定靶基因的绝对量，而不是用指数扩增循环数和通过与参考基因的比较来确定相对初始量。通过使用大数量划分的方法，dpcr可以用于检测比qpcr更精细的倍数差异。
由于dpcr仅涉及每个反应的阳性或阴性读数，所以，经常通过检测终点反应产物来进行该dpcr。但是，监测dpcr实时扩增可以提供有价值的信息以评估真的和假阳性，并且使用同样的荧光探针能够检测多个靶序列。本发明提供了一种具有多个独立控制的微型pcr反应器的实时数字pcr装置，其可以进行多个独立的并实时监测的dpcr扩增。
技术实现要素：
本发明提供了一种可以进行多个独立的数字pcr并具有实时监测能力的装置。所述装置包括多个与其自身的温度控制元件热耦合的pcr微型反应器、检测单元、以及用于容纳和移动所述pcr微型反应器的电动平台。所述实时数字pcr装置可以同时进行多个dpcr，生成单个pcr进程的扩增曲线，基于所述扩增曲线评估二进制读数，并且基于所述扩增曲线识别不同的靶序列。
本发明提供了一种用于进行实时数字pcr的装置，所述装置包括：a)至少一个pcr微型反应器，其中所述pcr微型反应器包括热耦合至温度控制元件的pcr微芯片，其中每个pcr微型反应器的热循环都通过其各自的温度控制元件独立地控制；b)检测单元，其中所述检测单元可以被编程以规定的时间间隔拍摄图像；c)电动平台，其用于容纳多于一个的pcr微型反应器，所述电动平台可以被编程以将所述pcr微型反应器中的一个移动到合适的位置，从而供所述检测单元拍摄图像；以及d)计算单元，其被连接到所述检测单元、电动平台和pcr微反应器中的温度控制元件。
在一个实施例中，所述pcr微芯片是一种具有多于100、1000、10000、100000个腔室的微流板。
在一个实施例中，所述pcr微芯片包括可以使微滴形成单层结构的微流通道。所述pcr微芯片进一步地连接至微滴生成器，所述微滴生成器可以将微滴注射入所述pcr微芯片的微滴通道。
在一个实施例中，所述温度控制元件包括加热元件、温度传感器和温度控制电路。所述温度控制元件连接到计算机上。
在一个实施例中，所述检测单元包括光源、滤光器、荧光显微镜和相机。所述荧光显微镜是高分辨率宽域显微镜。
在一个实施例中，本发明提供了一种使用本文描述的实时数字pcr装置检测样品中的多个靶序列的方法，所述方法包括：a)在实时数字pcr装置的pcr微芯片内，将样品和pcr试剂的混合物划分成许多个更小的独立反应空间，使多于50％的所述反应空间包含不超过一个靶序列，其中所述混合物包括引物对和序列特异性报告探针，所述引物对用于靶序列的扩增，所述序列特异性报告探针用于检测靶序列；b)进行多路复用实时定量pcr，以在每个反应空间中扩增多个靶序列；c)使用所述装置的所述检测单元在pcr扩增期间为每个反应空间记录扩增曲线；以及d)基于所述反应空间的所述扩增曲线确定每个反应空间中的个别靶序列的存在。
在一个实施例中，所述序列特异性报告探针偶联的荧光基团是相同的，对于每个靶序列来说，所述引物和所述序列特异性报告探针的浓度是不同的，这导致每个靶序列具有不同的平台荧光强度，并且具体的靶序列的检测是基于所述平台荧光强度。
在一个实施例中，所述不同靶序列的pcr扩增具有不同的阈值循环数(ct)，并且对具体的靶序列的检测是基于所述ct。
在某一个实施例中，对靶序列的检测是基于所述平台荧光强度和所述靶序列的扩增曲线的ct。
在某一个实施例中，所述样品和pcr试剂的混合物被划分成许多个更小的反应空间，从而使多于50％的反应空间包括不超过一个核苷酸序列。
在一个实施例中，本发明提供了一种使用本文描述的装置在细胞样品中为循环肿瘤细胞进行计数的方法，其中该循环肿瘤细胞表达肿瘤特异性基因或具有肿瘤特异性基因组序列，所述方法包括：a)将rt-pcr试剂和富含循环肿瘤细胞的细胞样品的混合物在所述pcr微芯片中划分成许多个更小的独立反应空间，从而使多于50％的反应空间包括不超过一个循环肿瘤细胞，其中所述混合物包括用于多个肿瘤特异性序列扩增的引物和用于多个肿瘤特异性序列检测的多个序列特异性报告探针；b)进行多路复用实时定量的rt-pcr以在每个反应空间中都扩增所述多个肿瘤特异性序列；c)在pcr扩增期间为每个反应空间记录扩增曲线；d)基于所述反应空间的扩增曲线用阳性荧光信号为反应空间的数量进行计数；以及e)基于具有阳性荧光信号的反应空间分数，确定细胞样品中循环肿瘤细胞的分数。具有阳性荧光信号的反应空间被识别为具有循环肿瘤细胞的反应空间。
在某一个实施例中，对于每个肿瘤特异性序列，所述引物和序列特异性报告探针的浓度是不同的，这导致每个肿瘤特异性序列都有不同的平台荧光强度，并且对具有具体的肿瘤特异性序列的循环肿瘤细胞的检测是基于所述平台荧光强度。
在某一个实施例中，每个肿瘤特异性序列的所述pcr扩增具有不同的ct，并且对具有具体的肿瘤特异性序列的循环肿瘤细胞的检测是基于所述ct。
在某一个实施例中，对具有具体的肿瘤特异性序列的循环肿瘤细胞的检测是基于所述平台荧光强度和所述ct。
在某一个实施例中，pcr试剂和所述细胞样品在所述pcr微芯片中被划分成许多个更小的反应空间，从而使多于50％的反应空间包括不超过一个单细胞。
在某一个实施例中，所述被识别为具有循环肿瘤细胞的反应空间可以被检索到并且用于进一步的分析。例如，所述具有阳性荧光信号的微滴被识别为具有循环肿瘤细胞的微滴，并且所述具有循环肿瘤细胞的微滴可以通过微滴分类器分类。
附图说明
图1：一种实时数字pcr装置的组件。pcr微型反应器(101)、检测单元(104)、电动平台(105)和计算单元(106)。
图2：pcr微型反应器的组件。pcr微芯片(102)、温度控制元件(103)、透明盖板(107)、以及与温度控制元件集成的底板(108)。
图3：用于微滴的pcr微芯片实例。a，具有扁平通道的pcr微芯片；b，具有u形通道的pcr微芯片。
图4：具有不同平台的四个基因的dpcr扩增曲线。
图5：具有不同ct值的四个基因的dpcr扩增曲线。
具体实施方式
定义：除非另外定义，本文所用的所有技术术语和科学术语都与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
用来描述本发明的词语“一(a)”和“一(an)”以及“所述(the)”应当被理解为覆盖单数和复数，除非明确指出或与上下文明显矛盾。类似地，用于描述本发明的复数形式的术语，例如，核酸(nucleicacids)、核苷酸(nucleotides)和dna(dnas)，也应当被理解为覆盖复数和单数，除非另有说明或与上下文明显矛盾。
如本文所用，术语“数字pcr”或"dpcr”是指使用多个pcr扩增的二进制输出以进行绝对量化的聚合酶链反应技术。dpcr通过将样本划分成许多个更小的隔室来开始，使每个隔室平均包含不超过一个靶元素，然后执行扩增反应以确定每个隔室中的靶元素的存在或不存在。基于泊松统计模型，所述具有靶元素(p)的隔室的分数被用来计算样本(τ)中靶元素的实际分数，其中，τ＝-ln(1-p)。所述靶元素可以是目标rna/dna序列或或特定的细胞类型(例如，循环肿瘤细胞、或病毒感染的细胞)。通过对于特定细胞类型具有特异性的标记核苷酸序列的存在来识别特定细胞类型。对于特定细胞类型的检测，在每个隔室中可以存在多于一个拷贝的标记序列。在某一个实施例中，在隔室中检测标记序列的存在为所述隔室提供了正读数。在另一个实施例中，检测高于所述平均背景水平的隔室内标记序列的表达水平为所述隔室提供了正读数。
如本文所用，术语“实时数字pcr”是指在pcr扩增循环期间监测pcr产物生成的数字pcr。在实时数字pcr中，每个隔室中pcr过程的时态数据可用于评估不同靶元素的二进制输出和辨别。
如本文所用，术语“循环肿瘤细胞”是指，从原发肿瘤解离的肿瘤细胞，进入血管系统或淋巴系统，通过循环被携带至机体四周。这些细胞携带肿瘤细胞特异性表达概况和肿瘤特异性基因型，可以成为发展为转移肿瘤的种子细胞。所述循环肿瘤细胞可通过肿瘤特异性基因的表达和血细胞特异性标记诸如cd45不表达来识别。
如本文所用，术语“肿瘤特异性序列”是指，与正常细胞相比较，特别是与正常的血细胞或淋巴细胞相比较，包括在癌细胞中具有较高表达的rna或dna序列的核苷酸序列。肿瘤特异性rna序列可以是在一种或多种类型的癌细胞中表达的rna转录体，但在正常血细胞或淋巴细胞中表达水平极低的或无表达。仅在肿瘤细胞中表达且在正常血细胞或淋巴细胞中没有能检测的表达的肿瘤特异性基因称为“癌症唯一标记基因”。肿瘤特异性dna序列是在癌细胞中过表达的dna序列，例如，与癌症相关的基因融合序列或具有拷贝数倍增的基因序列。所述肿瘤特异性序列可以在特定的癌症类型或许多不同的癌症类型中进行超表达。与特定的癌症类型(例如乳腺癌)相关的肿瘤特异性序列可以被选为癌症类型特异性组，并用于检测与特定癌症类型相关的肿瘤细胞。在许多不同的癌症类型中表达的肿瘤特异性序列可用作检测癌症发生的泛癌标记物。
如本文所用，术语“肿瘤特异性引物”是指设计成聚合酶链式反应中扩增肿瘤特异性序列的pcr引物。设计所述肿瘤特异性引物，由此它们特异性地扩增相应的肿瘤特异性序列，而不是扩增在正常细胞中存在的其它序列。例如，设计用于扩增肿瘤特异性rna转录体的肿瘤特异性引物以产生跨越多个外显子的扩增子，使它们不会扩增相对应基因的基因组序列。用于扩增基因融合序列的肿瘤特异性引物被设计成在融合区域上产生扩增子，因此待扩增的基因序列仅存在于癌细胞中。
大多数市售数字pcr仪器在pcr扩增完成后测量终点pcr产物。然而，可以为分析dpcr读数提供有价值信息的pcr循环的时态数据在这些终点数字pcr中是不可用的。本发明提供了一种可以进行多个独立的数字pcr并具有实时监控能力的装置。所述装置包括多个与其自身的温度控制元件连接的pcr微型反应器、检测单元、以及用于容纳和移动所述pcr微型反应器的电动平台。所述实时数字pcr装置可以同时进行多个数字pcr，生成数以千万计的单独pcr过程的扩增曲线，基于所述扩增曲线评估二进制读数，并且基于所述扩增曲线识别不同的靶序列。
本发明提供了一种用于进行实时数字pcr的装置，包括：a)至少一个pcr微型反应器(101)，其中所述pcr微型反应器包括热耦合至温度控制元件(103)的pcr微芯片(102)，其中每个pcr微型反应器的热循环都独立地由其各自的温度控制元件控制；b)检测单元(104)，其中所述检测单元可以被编程以规定的时间间隔拍摄图像；c)电动平台(105)，用于容纳多于一个的可以被编程的以将所述pcr微型反应器中的一个移动到合适的位置，从而供所述检测单元拍摄图像；以及d)计算单元(106)，其被连接到所检测单元、电动平台和pcr微反应器中的温度控制元件。
在一个实施例中，所述pcr微芯片是具有多于100、1000、10000、100000个腔室的微流板。所述微流板可以由硅或玻璃基板制成。聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(pdms)，聚碳酸酯(pc)和聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)也可用作可选基材。合适的基材应当具有较低的热传导性，并且能够经受与pcr相关联的持续高温。应使用试剂将腔室的内表面处理成亲水性的，所述试剂，例如sio2、牛血清白蛋白(bsa)、聚乙二醇(peg)、或硅烷化试剂(例如，3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷、
在一个实施例中，所述pcr微芯片包括可使微滴形成单层结构的微流通道，其适用于在pcr扩增过程中拍摄微滴的图像。例如，微流通道的内高度为微滴平均直径的1.2至1.8倍，从而在在微流通道内仅可以形成单独的一层微滴。所述微流通道的内部可以是扁平开放空间(图3a)或u形管(图3b)。所述pcr微芯片分别具有用于加载和提取微滴的入口和出口。所述pcr微芯片可以连接到微滴发生器，所述微滴发生器可以将样品和pcr试剂包封成数以千万计的微滴中，并将所述微滴注入到pcr微芯片的微流通道中。所述pcr微芯片的至少一侧由透明材料制成，由此可以在所述pcr过程中获取所述微滴的实时图像。
在一个实施例中，所述温度控制元件包括加热元件、温度传感器和温度控制电路。所述加热元件和温度传感器应与pcr微芯片紧密热接触。例如，所述加热元件可以是可根据需要进行加热和冷却的薄膜电极加热器或peltier装置。所述温度控制电路使用温度传感器测量pcr微芯片的当前温度，将当前温度与目标温度进行比较，并进行必需的调整以达到目标温度。可用于制备pcr微芯片的温度控制元件的方法在本领域中是已知的(kooc等人《公共科学图书馆-综合(plosone)》2013；8(12):e82704.doi:10.1371/journal.pone.0082704和miralles,v.等人《诊断学(巴塞尔)(diagnostics(basel))》.2013mar；3(1):33-67)。所述温度控制元件可以作为pcr微芯片的集成部分或作为在所述pcr过程中与所述pcr微芯片热耦合的独立部分制造。所述温度控制元件和计算单元相连接(例如计算机)，并且通过计算单元可以控制每个pcr微芯片热循环反应参数。每个pcr微型反应器都具有自身的温控元件，并且可以在其自身热循环下独立进行pcr扩增。该设计增加了装置的灵活性，使得具有不同热循环条件的多个pcr扩增可以同时进行，而且使得多个pcr扩增的实时监测很容易操作。
在一个实施例中，所述检测单元包括光源、滤光器、荧光显微镜和相机。所述荧光显微镜是宽域高分辨率显微镜。例如，用于本发明的相机可以是ccd相机。
在有些实施例中，所述计算单元起着整部dpcr仪器的中央控制作用，其调节所述检测单元、电动平台和微型反应器中的温度控制元件的参数，使之相互配合而成为一个整体。例如，该计算单元可以是一部控制台或是一台计算机。它可用于为pcr微型反应器设置热循环参数，控制电动平台来移动pcr微型反应器的位置，控制检测单元的拍照，以及存储从检测照相机送出的数据。每个微型反应器可以有不同的反应起始时间、热循环温度、以及加热时间，可以设置电动平台移动和拍照的时间参数使之与每个微型反应器的参数相匹配。所述计算单元可以调控操作参数，以协调每个微型反应器的热循环时间、电动平台的移动和检测单元的拍照相互配合，以使拍照是在每个微反应器的热循环反应中的指定时间点进行。
例如，拍摄一张pcr微芯片的图像需花费3秒钟。为了在每个pcr微型反应器的每个pcr循环结束时拍摄图像，可以对pcr微型反应器进行编程，以在启动其pcr循环时相继有3秒钟延迟，并且所述检测单元可被编程以用于在每个pcr循环结束时相继为相应的pcr微型反应器拍摄图像。表1显示了8-微型反应器dpcr仪设置一个pcr循环的时间参数的例子，其中在每个微型反应器的pcr循环结束时进行拍照。更多pcr循环的时间参数也可以类似地进行设置。
表1.8-微型反应器数字pcr仪的时间参数的设置
在一个实施例中，本发明提供了一种使用本文描述的实时数字pcr装置检测在样品中的多个靶序列的方法，所述方法包括：a)在实时数字pcr装置的pcr微芯片内，将样品和pcr试剂的混合物划分成许多个更小的反应空间，使多于50％的反应空间包含不超过一个靶序列，其中所述混合物包括用于每个靶序列扩增的引物对和用于每个靶序列检测的序列特异性报告探针；b)进行多路复用实时定量pcr，以在每个反应空间中扩增多个靶序列；c)利用所述装置的检测单元在pcr扩增期间为每个反应空间记录扩增曲线；以及d)基于反应空间的扩增曲线确定每个反应空间中的个别靶序列的存在。实时数字pcr的一个优点在于，它可以使用扩增曲线的性质来评估阳性荧光信号是真信号还是假信号。本方法可以有效排除非特异性扩增的假阳性信号，提高dpcr的量化精确度。
在某个实施例中，用于不同靶序列的序列特异性报告探针被连接到不同的荧光基团上。基于分区中的荧光类型可以识别具有不同靶序列的分区。然而，有效的荧光基团的数量有限，并且不同的荧光基团通常具有重叠的光谱，使得难以区分不同的荧光信号。在数字pcr检测中使用的最常用的有效的荧光基团仅为两种类型。因此，重要的是开发用于使用相同的荧光基团来区分不同靶的装置。利用扩增曲线的特征来区分不同的靶序列为解决方案之一。
在某一个实施例中，对于每个靶序列来说，所述引物和所述序列特异性报告探针的浓度是不同的，这导致每个靶序列具有不同的平台荧光强度，并且对靶序列的检测是基于平台荧光强度(图4)。所述平台荧光强度与引物和序列特异性报告探针的量是直接相关的。扩增曲线可以用于以比终点测量的分辨率更好的分辨率来计算平台荧光强度，从而提供更好的方法区分来自不同靶序列的信号。
在一个实施例中，针对每个靶序列的pcr扩增都具有不同的阈值周期数(ct)，并且对靶序列的检测是基于所述ct。由于采用不同引物的pcr效率差异，因此不同的靶序列可以具有不同的ct，其可用于区分靶序列(图5)。
在某个实施例中，对靶序列的检测是基于平台荧光强度和靶序列扩增曲线的ct。
在某个实施例中，样品和pcr试剂的混合物被划分成许多个更小的反应空间，从而使多于50％的所述反应空间含有不超过一个核苷酸序列。
在一个实施例中，本发明提供了一种使用本文描述的装置在细胞样品中为循环肿瘤细胞进行计数的方法，其中该肿瘤细胞表达肿瘤特异性基因或具有肿瘤特异性基因组序列，所述方法包括：a)将rt-pcr试剂和富含循环肿瘤细胞的细胞样品的混合物在pcr微芯片中划分成许多个更小的反应空间，从而使多于50％的反应空间内包括不超过一个循环肿瘤细胞，其中所述混合物包括用于多个肿瘤特异性序列扩增的引物和用于多个肿瘤特异性序列检测的多个序列特异性报告探针；b)进行多路复用实时定量的rt-pcr以在每个反应空间中都扩增多个肿瘤特异性序列；c)在pcr扩增期间为每个反应空间记录扩增曲线；d)基于所述反应空间的扩增曲线，对具有阳性荧光信号的反应空间进行计数；以及e)根据具有阳性荧光信号的反应空间的所占比例，确定细胞样品中循环肿瘤细胞的所占比例。
用于检测循环肿瘤细胞的样品通常是血细胞样品。所述血细胞样品可以通过去除红细胞和白细胞，或对于大肿瘤细胞的尺寸选择，而富集循环肿瘤细胞。通过表达肿瘤特异性基因或含有肿瘤特异性基因组序列(例如肿瘤特异性突变)识别所述循环肿瘤细胞。设计所述肿瘤特异性引物，以采用rt-pcr扩增肿瘤特异性rna转录体和采用pcr扩增肿瘤特异性dna序列。优选的肿瘤特异性序列是在正常血细胞中不存在仅在肿瘤细胞或肿瘤特异性dna突变中表达的rna转录体。将具有阳性荧光信号的反应空间识别为含有循环肿瘤细胞的反应空间。
在某个实施例中，将不同浓度的肿瘤特异性引物和序列特异性报告探针用于不同的肿瘤特异性序列，这导致不同肿瘤特异性序列具有不同的平台荧光强度，并且对具有特定肿瘤特异性序列的循环肿瘤细胞的检测是基于所述平台荧光强度。
在某个实施例中，针对不同肿瘤特异性序列的pcr扩增具有不同的ct，并且对具有特定肿瘤特异性序列的循环肿瘤细胞的检测是基于ct。
在某个实施例中，对具有特定的肿瘤特异性序列的循环肿瘤细胞的检测是基于平台荧光强度和ct。
在某个实施例中，在所述pcr微芯片中，pcr试剂和细胞样品的混合物被划分成许多个更小的反应空间，从而使多于50％的反应空间包括不超过一个单细胞。
在某个实施例中，被识别为具有循环肿瘤细胞的反应空间可被检索到，并用于进一步的分析。例如，可以通过液滴分类器对具有荧光信号的微滴进行分类，并且使用具有循环肿瘤细胞的微滴识别出具有荧光信号的微滴。
虽然为了清楚和理解的目的已经详细描述了本发明，本领域技术人员将会意识到，在不背离本发明真实范围的情况下，可以进行形式和细节上的各种变化。在此通过引用合并被用于上文参考的所有附图、表、附录、专利、专利申请和出版物。