本发明涉及一种磷光铱配合物及有机无机杂化纳米硅球，具体涉及一种磷光铱配合物及有机无机杂化纳米硅球的制备方法与应用。
背景技术：
过氧亚硝酸盐由一氧化氮和超氧阴离子自由基反应生成，是一种重要的氮氧活性氧化合物，具有很高的反应活性和不稳定性。它能与许多生物分子，如酯类、蛋白质糖类发生化学反应并与许多疾病，如炎症、败血症、动脉硬化和神经再生性失调等的发病机理有关。
因此，对其致病机理及其含量的检测非常重要，由于它在生理条件下很快分解，因此很难进行准确测定。
目前所报导的检测过氧亚硝酸盐的方法大多为小分子荧光探针。探针能够实现对过氧亚硝酸盐的检测，是通过检测前后化合物的结构、电子云密度及发光性质的改变来实现的；但是大多数荧光探针存在着，量子效率低、水溶性差等问题，无法实现有效的对过氧亚硝酸盐的特异性检测。
磷光过渡金属配合物，如pt(ii)-、ru(ii)-、re(i)-、ir(iii)-、cu(i)-、au(i)-以及os(ii)-配合物，在活细胞成像领域的应用逐渐引起了人们的关注。而具有d6族电子结构的铱配合物，不但具有优异的光物理性质，如长发射寿命、颜色可调、可见光激发等，而且其配位化合物非常稳定，研究中未发现对细胞有明显毒性，使其在细胞生物学成像方面应用有较大潜力。
目前所报导的用于检测过氧亚硝酸盐的探针大多为小分子荧光探针，寿命短，量子效率低，而大多数报道的生物成像重金属配合物水溶性差，虽然生物成像成功在混合溶剂的基础上地实现了，但有机溶剂能破坏细胞膜，对细胞具有毒性。
因此，发展新的完全水溶的重金属配合物活细胞磷光生物探针意义重大。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够用于比率法检测过氧亚硝酸盐的磷光铱配合物及有机无机杂化纳米硅球的制备方法与应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种磷光铱配合物，结构通式为：
其中，c^n配体为下列中的任一个：
一种磷光铱配合物的制备方法，包括以下步骤：
s1、一定量的1与2及硫酸镁，在乙醚溶液中反应一段时间，过滤后，得到的油状液体3，在aibn的催化下，加入nbs在四氯化碳溶液中反应，得到油状液体4；反应过程如下：
s2、5和铱二氯桥、碳酸钾，在惰气保护下于乙二醇乙醚溶液中反应一段时间后，抽滤，用二氯甲烷萃取后，过滤干燥得到的固体6(ir(n)*配合物)，和4混合再加入碳酸钾，在惰气保护下于dmf溶液中反应得到7(ir(n)配合物)；反应过程如下：
上述步骤s1中，各组分量分别为：1(1eq)、2(1.1eq)、硫酸镁(2eq)、aibn(0.05eq)、nbs(0.6eq)；在乙醚溶液中常温反应1-3h；在四氯化碳溶液中80-100℃回流反应8-12h；
上述步骤s2中，各组分量分别为：5(2eq)、铱二氯桥(1eq)、碳酸钾(各5eq)、4(2eq)；在乙二醇乙醚溶液中90-110℃回流反应10-16h，在dmf溶液中40-60℃反应10-16h。
一种有机无机杂化纳米硅球，制备方法基于一种磷光铱配合物，包括以下步骤：
a1、分别以fppy(1)和thq(3)为配体，重复步骤s1和s2，制备ir1配合物和ir3*配合物；
a2、取一定量的ir3*配合物，加入异氰酸丙基三乙氧基硅烷，在惰气保护下反应后冷却，加入正己烷，混合离心后，用thf完全溶解，制成配合物m；
a3、于反应瓶中，混合一定量的catc和h2o，搅拌并保持一定温度；
取一定量的dea溶于乙醇后，加入至反应瓶中，再加入h2o，搅拌；
a4、取一定量的teos和mpts，与上述配合物m混合后，加入反应瓶中反应，用乙醇溶液清洗离心后的反应液，制得msn-ir3*；
a5、将msn-ir3*加入乙醇和盐酸的混合液，搅拌反应后，用乙醇溶液清洗离心后的反应液，制得去膜msn-ir3*；
a6、将上述去膜msn-ir3*溶解于乙醇中，与ir1配合物混合搅拌反应后，用乙醇溶液清洗离心后的反应液，制得msn-onoo；反应过程如下：
上述步骤a2中，各组分量分别为：ir3*配合物(1eq)、异氰酸丙基三乙氧基硅烷(20eq)；反应温度为70-90℃，反应时间为48-72h；离心转速为8000-11000r/min，离心时间为5-20min；
上述步骤a3中，保持温度为50-70℃；
上述步骤a4中，反应温度为50-70℃，反应时间为2-3h；离心转速为8000-11000r/min，离心时间为5-20min；清洗不少于3次；
上述步骤a5中，反应温度为50-70℃，反应时间为12-24h；离心转速为10000-12500r/mim，离心时间为5-20min；清洗不少于3次；
上述步骤a6中，反应时间不小于24h，离心转速为10000-12500r/mim，离心时间为5-20min；清洗不少于3次。
上述的一种磷光铱配合物和一种有机无机杂化纳米硅球，适用于过氧亚硝酸盐比率法特异性检测。
上述的一种磷光铱配合物和一种有机无机杂化纳米硅球，适用于通过荧光成像或时间分辨成像特异性检测细胞外源性和内源性过氧亚硝酸盐。
上述的一种磷光铱配合物和一种有机无机杂化纳米硅球，适用于细胞成像传感领域。
上述的一种磷光铱配合物和一种有机无机杂化纳米硅球，适用于活体成像传感领域。
上述的一种磷光铱配合物和一种有机无机杂化纳米硅球，适用于建立活体炎症模型。
具有特异性响应的磷光铱配合物的结构及其响应机理如下：
本发明的有益之处在于：
本发明的一种磷光铱配合物及有机无机杂化纳米硅球(msn-onoo)的制备方法与应用，通过共价键将对过氧亚硝酸盐特异性响应的硼酸酯基团接到铱配合物的辅助配体上，通过引入参比配合物实现了比率法的检测，通过制备有机无机杂化纳米硅球，成功解决了配合物水溶性差的缺点，能够检测细胞中过氧亚硝酸盐含量，在细胞成像、过氧亚硝酸盐离子传感等领域有良好的应用前景。
尤其在比率法特异性检测过氧亚硝酸盐(onoo-)方面的应用。msn-onoo中包覆有两种铱配合物材料(ir1和ir3*)，其中ir1能够对过氧亚硝酸盐特异性响应，ir3*作为比率探针对过氧亚硝酸盐没有响应。且ir1磷光强度随过氧亚硝酸盐浓度增大而减弱，磷光寿命随过氧亚硝酸盐浓度增大而减小；能够通过共聚焦成像特异性检测细胞外源性及内源性过氧亚硝酸盐；且通过制备介孔纳米粒子，成功解决了一般荧光/磷光探针水溶性差的缺点。
本发明的磷光铱配合物具有较长的发射寿命，制备的有机无机杂化纳米硅球具有很好的水溶性，能够用于比率法检测细胞内外的过氧亚硝酸盐，提高信噪比，在生物成像与传感方面具有重要的应用前景，具有很强的实用性和广泛的适用性。
附图说明
图1为本发明的msn-ir3*及msn-onoo的tem测试结果。
图2为本发明的msn-ir3*及msn-onoo的dls测试结果。
图3为本发明的ir1、ir2、ir3、ir4及响应性发射光谱测试。
图4为本发明的ir1、ir2、ir3、ir4及ir1*、ir2*、ir3*、ir4*吸收光谱测试。
图5为本发明的msn-onoo滴定发射光谱。
图6为本发明的msn-onoo的离子选择性测试。
图7为本发明的msn-onoo滴定寿命测试。
图8为本发明的msn-onoo细胞共聚焦成像实验。
图9为本发明的msn-onoo内源性细胞共聚焦成像实验。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明中使用的化学试剂皆为市购。
使用的仪器包括：
发射光谱仪：edinburghfl920，edinburgh
紫外光谱仪：uv-3600uv-vis-nir，shimadzu
核磁共振：ultrashieldplus400mhznmr，bruker
透射电镜：jeoljem-2100，jeol
动态光散射仪：，zetasizernanoseries，malvern
共聚焦扫描仪：becker&hicklgmbhdcs-120，becker&hicklgmbh
实施例1
(1)、ir1配合物的制备
将a(0.33mmol)和铱二氯桥(0.16mmol)加入碳酸钾(1.6mmol)，在氮气保护下，于乙二醇乙醚溶液中110℃回流反应12h，反应结束后，抽滤除去碳酸钾，用二氯甲烷反复萃取3次以上，旋干过柱子，得到固体b(ir1*配合物)，和c(0.28mmol)加入碳酸钾(1.4mmol)在氮气保护下dmf溶液中50℃反应12h得到铱配合物ir1。
反应过程如下：
下列为ir1配合物的核磁共振：
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm):8.80(d，j＝5.2hz，1h)，8.27(d，j＝8.0hz，1h)，8.21(d，j＝8.0hz，1h)，7.80-7.69(m，4h)，7.49(d，j＝7.2hz，2h)，7.43-7.34(m，3h)，7.23-7.13(m，2h)，6.98(t，j＝6.4hz，1h)，6.48-6.32(m，2h)，5.77(d，j＝8.0hz，1h)，5.53(d，j＝8.0hz，1h)，5.38(s，2h)，1.33(s，12h).13cnmr(400mhz，cdcl3):δ(ppm):171.19，165.68，165.61，164.76，164.64，164.40，164.32，164.28，164.25，162.62，162.52，162.49，162.39，162.21，162.09，161.86，161.74，160.04，159.94，159.90，159.81，158.64，152.82，152.79，152.75，152.72，148.84，147.96，141.05，140.30，138.58，138.13，135.21，128.82，128.06，128.04，126.19，124.59，123.33，123.13，122.77，122.59，122.50，122.35，114.62，114.42，98.24，97.97，97.83，97.70，97.55，97.29，83.93，71.25，24.89，24.88.maldi-tof-msm/z:927.18.
(2)、ir3*配合物的制备
配置方法同上：ir1配合物制备过程中的b(ir1*配合物)的制备方法，将配体fppy(1)替换为thq(3)。
具体为：
(3)、msn-onoo的制备
称取ir3*配合物(0.03mmol)，加入异氰酸丙基三乙氧基硅烷(0.6mmol)，抽真空，鼓氮气，80℃反应72h；冷却后，加入正己烷(15ml)，10000r/min离心5分钟，倒去上清液，用0.5ml的thf超声至完全溶解，制成配合物m，待用。
称取catc(2.6g)于250ml反应瓶中，加入h2o(10.4ml)，常温下边加边搅拌，转速要慢，避免起泡沫；增加转速，调整后整个过程不能改变转速，升温至60℃。
称取0.2gdea，溶于11.25ml乙醇中，加入反应瓶中，再加入64mlh2o，搅拌30min。
量取7mlteos，0.6mlmpts，加入上述配合物m，混合在一起，2min内滴加入反应瓶中，60℃反应3h；取出反应液，10000r/min转速下离心8min，，然后用乙醇溶液反复洗三次得到msn-ir3*。
去膜：将120ml乙醇和15ml盐酸混合均匀，将msn-ir3*加入其中充分溶解，60℃搅拌24h，反应结束后用12500r/mim转速下离心15min，然后用乙醇溶液反复清洗3次。
将去膜后的msn-ir3*超声充分溶解于乙醇中，加入ir1(0.01mmol)常温搅拌24h，反应结束后12500r/min转速下离心10min，取下层沉淀，加入乙醇反复清洗3次以上得到msn-onoo。
(4)、msn-ir3*及msn-onoo的tem测试
将msn-ir3*和msn-onoo分别溶于乙醇中，msn-ir3*及msn-onoo的tem测试结果如图1所示。
从图中可以看出msn-ir3*及msn-onoo的粒子半径约为50nm，且吸附ir1之后，粒子半径无明显变化。
(5)、msn-ir3*及msn-onoo的dls测试
将msn-ir3*和msn-onoo分别溶于乙醇中，msn-ir3*及msn-onoo的dls测试结果如图2所示。
从图中可以看出msn-ir3*及msn-onoo的粒子半径分别约为87及90nm，吸附ir1之后粒子dls半径有微小变化。
(6)、msn-onoo滴定发射光谱
msn-onoo滴定吸收光谱，msn-onoo的测试浓度为1mg/ml，测试结果如图5所示。
随着过氧亚硝酸盐的加入，474nm处的发射强度在下降，605nm处的发射强度只有略微下降，i474/i605下降明显。
(7)、msn-onoo的离子选择性测试
msn-onoo的离子选择性实验，采用的光谱测试浓度msn-onoo为1mg/ml，过氧亚硝酸盐级过氧化氢当量为5倍，响应时间为1分钟，其余离子当量在50倍以上，响应时间5分钟。
msn-onoo的离子选择性实验结果如图6所示。
加入过氧亚硝酸盐后，磷光强度比值i474/i605明显降低，而加入其它离子后，磷光强度比值i474/i605变化不大，因此，ir1对于过氧亚硝酸盐具有很好的特异性响应，msn-onoo可以用于特异性检测过氧亚硝酸盐。
(8)、msn-onoo滴定寿命测试
msn-onoo滴定寿命测试，msn-onoo的测试浓度为1mg/ml，过氧亚硝酸盐的当量为0-5倍。msn-onoo滴定寿命测试结果如图7所示。
474nm处寿命变化明显降低，而605nm处寿命几乎没有改变，因此可以通过监测474nm处寿命变化来特异性检测过氧亚硝酸盐。
(9)、msn-onoo细胞共聚焦成像实验
msn-onoo细胞共聚焦成像实验，实验结果如图8所示，采用的msn-onoo的浓度为100ug/ml，具体过程为，在恒温箱中培养巨噬细胞(raw264.7)24小时，加入msn-onoo，培养2小时，共聚焦成像，然后分别加入1mm的sin-1，5倍当量次氯酸钠溶液，5倍当量过氧化氢溶液，0.5小时后共聚焦成像。
实验结果如图8所示，加入sin-1的细胞，绿光磷光强度明显减弱，而红光磷光强度则无明显变化，说明细胞对于外生过氧亚硝酸盐具有特异性选择性，而分别加入次氯酸和过氧化氢的巨噬细胞，绿光和红光磷光强度均无明显变化，说明你msn-onoo对于外生性过氧亚硝酸盐具有特异性响应性且对次氯酸及过氧化氢不响应。
(10)、msn-onoo内源性细胞共聚焦成像及反向清除实验
msn-onoo内源性细胞共聚焦成像实验，实验结果如图9所示，实验过程为在恒温箱中培养巨噬细胞(raw264.7)24小时，加入msn-onoo，培养2小时，共聚焦成像(a)，用lps(1μg/ml)和ifn-γ(50ng/ml)培养细胞12h，然后加入msn-onoo培养2小时，共聚焦成像(b)，(c，d，e)细胞在lps(1μg/ml)和ifn-γ(50ng/ml)培养细胞过程中，分别加入o2·-清除剂tempo(300μm)(c)和nos清除剂ag(5mm)(d)和过氧亚硝酸盐清除剂fetmpyp(50um)(e)，然后加入msn-onoo培养2小时，共聚焦成像。
实验结果如图9所示，b组绿光磷光强度明显减弱，而红光磷光强度则无明显变化，说明ir1对lps和ifn-γ刺激细胞产生的内生性过氧亚硝酸盐有特异性响应，而分别加入了o2·-清除剂tempo和nos清除剂ag和过氧亚硝酸盐清除剂fetmpyp的巨噬细胞，绿光和红光磷光强度均无明显变化，说明msn-onoo可以用来特异性检测细胞内生性过氧亚硝酸酸盐。
实施例2
同上述制备方法，分别以fppy(1)、ppy(2)、thq(3)、btp(4)为配体，制备ir1、ir2、ir3、ir4和ir1*、ir2*、ir3*、ir4*。
(1)、ir1、ir2、ir3、ir4及响应性发射光谱测试
ir1、ir2、ir3、ir4的测试浓度为10μm，测试混有10％的ch3cn，测试结果如图3所示。
ir1检测响应前后磷光强度变化最明显，可以用来特异性检测onoo-。
(2)、ir1、ir2、ir3、ir4及ir1*、ir2*、ir3*、ir4*吸收光谱测试
ir1、ir2、ir3、ir4的测试浓度为10μm，测试混有10％的ch3cn，测试结果如图4所示。
与onoo-特异性响应后，探针吸收光谱无明显变化。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。