一种耐有机溶剂高效半乳糖苷酶及其应用的制作方法

本发明涉及生物制药
技术领域：
，具体涉及一种耐有机溶剂高效半乳糖苷酶及其在非水相反应合成新型红景天苷类似物应用。
背景技术：
：红景天苷是一种天然的糖苷化合物，是植物红景天(Rhodiolarosea)的有效成分之一，具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗衰老、抗疲劳、耐缺氧、抗辐射等多方面药理作用。对于高辐射环境工作人员、脑力劳动者、中老年人具有积极的滋补保健作用；是宇航员、飞行员、登山运动员、潜水员提高在恶劣环境中生存能力的保健药品，同时是高原地区重要的抗缺氧药品，是一种极具有开发应用前景的环境适应药物。近年来，由于其独特的抗衰老作用，在化妆品领域应用日趋广泛。糖苷类化合物结构中糖基的类型对糖苷类药物的生物活性有较大影响，当受体分子中连接不同类型的糖分子，其生物活性也表现出较大的差异。在酪醇的分子上连接不同的糖分子，获得的多种红景天苷衍生物的生物活性有着显著差异，酪醇的半乳糖苷衍生物的作用效果相对较强。酪醇-β-D-半乳糖苷具有清除DPPH自由基和羟基自由基的作用，半乳糖苷是酪醇所有羟基取代中最强的，其抗氧化活性比红景天苷（酪醇-β-D-葡萄糖苷）有着30%左右的差异，并且在生物体内有更多的受体，有更高的生物利用度，是一种潜在的具有高生物活性的新型红景天苷新型衍生物（石力夫，蔡溱，姚斌.红景天苷衍生物及其制备方法和用途[P].中国专利，CN1475492A.）。在心脏保护方面，酪醇-β-D-半乳糖苷能增加心肌SOD活力，减轻氧化应激反应程度，降低细胞膜脂质过氧化产物MDA的含量以及减少NO合成，使NO对细胞的毒性作用降低，从而减少缺血心肌细胞死亡，降低心肌损伤（PatelVC,YellonDM,SinghKJ,etal.Inhibitionofnitricoxidelimitsinfarctsizeintheinsiturabbitheart[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,1993,194(1):234-238.）。其作用强于红景天苷，能有效地减少活性氧簇对细胞的损伤。在脑、神经细胞保护方面，红景天苷及其类似物酪醇-β-D-半乳糖苷能预防大脑缺血性损伤，在大鼠实验中能有效地减少氧化损伤，这一作用是通过减少Bax的表达和修复促凋亡、抗凋亡蛋白的平衡实现的（ShiTY,FengSF,XingJH,etal.NeuroprotectiveeffectsofSalidrosideanditsanaloguetyrosolgalactosideagainstfocalcerebralischemiainvivoandH2O2-inducedneurotoxicityinvitro[J].NeurotoxicityResearch,2012,21(4):358-367.）。缺血/再灌注(I/R)损伤是中风、颅脑外伤以及心、脑外科手术等引起不可逆损伤的共同病理生理过程。研究发现，红景天苷及其类似物酪醇-β-D-半乳糖苷可以保护细胞免受超氧阴离子自由基(O2)和过氧化氢(H2O2)的损伤，具有治疗I/R损伤的作用，并且酪醇-β-D-半乳糖苷效果更强。红景天苷及其类似物酪醇-β-D-半乳糖苷可以增高脑I/R后脑组织中乙酰胆碱的含量，抑制脑I/R损伤后脑内白细胞介素1β的表达，可减轻大鼠脑I/R后脑水肿程度，缓解海马区自由基代谢异常，改善认知功能，可以易化脑I/R损伤后中枢神经系统神经再生和修复的可塑性，抑制APE/Ref21降低（刘晓梅,王淑英,刘斌.红景天苷对脑缺血再灌注大鼠脑神经元APE/Ref-1的影响[J].中国老年学,2009,29(5):518-520.）。目前，红景天苷主要通过提取法、化学合成法、植物细胞培养和酶法合成等技术获得，这些技术存在各自不同的优缺点。红景天是提取红景天苷的主要植物，但是红景天是高寒地带植物，野生资源匮乏，且人工栽培技术尚不成熟，因此难以保证红景天原料的大量供应。又加之红景天苷的提取工艺复杂，过中需要用到的试剂较多，虽有多次完善，但从天然植物中获得的红景天苷依然很少，不能满足市场的需求。虽然在1969年俄国化学家Troshchenko等利用化学法合成了红景天苷，并且经我国学者不断地优化改良，但是化学合成过程依然需要多步保护和去保护措施，过程复杂且成本较高，副产物多，难以分离。并且要使用价格昂贵的糖基供体和各种重金属催化剂、有机试剂，对环境危害较大，至今仍未投入生产使用。植物细胞培养法因设备昂贵、技术难度大，产物提纯成本高，数代培养后细胞退化不产产物等缺点未能应用到实际生产之中。酶催化合成红景天苷的方法具有反应条件温和，具有很好的位置选择性和立体专一性，与传统的化学法合成糖苷类化合物相比，本发明开发的生物技术方法生产糖苷类化合物，产物的构型明确，不存在α，β两种构型的糖苷混合物，产物结构单一，纯度高，是开发成为药物使用的重要安全保证。当前用于红景天苷合成的酶主要有糖基转移酶和糖苷酶。UDP-葡萄糖基转移酶的糖基供体UDP-糖苷价格昂贵，且对糖基受体具有高度专一性，使得合成缺乏灵活性。而糖苷酶催化糖和醇类直接成苷属于逆水解反应，受热力学控制，由于反应平衡的限制，最终产率过低。受反应热力学平衡的影响，该反应需要严格控制反应体系的水含量。但是在有机溶剂中，酶又容易失活，不利于反应的进行，因而需要筛选对亲水有机溶剂高耐受性的糖苷酶进行反应。技术实现要素：针对半乳糖苷酶受热力学平衡限制产率过低、糖苷酶在有机相中易失活等问题，本发明提供了一种有机溶剂耐受性高、稳定性好、合成效率高的半乳糖苷酶，含有编码该半乳糖苷酶基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及利用该酶采用添加亲水有机溶剂的非水相反应体系进行新型红景天苷类似物的合成。本发明目的之一，在于提供一种耐有机溶剂高效半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明另一目的在于提供编码上述半乳糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。该基因序列从沙雷氏菌属菌株（Serratiamarcescens）MH6的总DNA中提取，命名为gal，全长1386bp。编码序列从第一个碱基起至第1386个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。本发明另一目的在于提供含有所述耐有机溶剂高效半乳糖苷酶编码基因的重组载体。所述重组表达载体是将基因插入载体连接后获得重组表达载体；将重组表达载体转化到宿主菌株获得重组表达转化体。本发明还提供了该酶其在非水相反应合成新型红景天苷类似物的应用。培养前述的重组表达转化体，获得重组表达的耐有机溶剂高效半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基为LB/Kana培养基。将培养获得的重组转化体离心收集细胞，并经生理盐水洗涤2次后获得静息细胞。用pH7.5-8.5的PBS缓冲重悬细胞，经超声破碎后离心收集粗酶液，并经镍柱纯化获取纯化后的耐有机溶剂高效半乳糖苷酶。所述的非水相体系为0%~30%（v/v）有机溶剂体系，醇类浓度为10g·L-1-60g·L-1，乳糖浓度为100~250g·L-1，反应温度为20~65℃，反应pH为5~11，反应时间15小时。本发明应用的产物红景天苷类似物具有清除DPPH自由基和羟基自由基的作用，保护细胞免受超氧阴离子自由基(O2)和过氧化氢(H2O2)的损伤。对于心肌细胞，它能增加心肌SOD活力，减轻氧化应激反应程度。在脑、神经细胞保护方面，红景天苷及其类似物酪醇-β-D-半乳糖苷能预防大脑缺血性损伤，能通过减少Bax的表达和修复促凋亡、抗凋亡蛋白的平衡有效地减少氧化损伤。相对于其他糖基衍生物，其在生物体内有更多的受体，有更高的生物利用度。本发明开发的生物技术方法生产糖苷类化合物，产物的构型明确，不存在α，β两种构型的糖苷混合物，产物结构单一，副产物少，纯度高，是开发成为药物使用的重要安全保证。本发明选择添加有机溶剂的非水相体系进行催化，可以克服水相体系高水活度和有机体系糖溶解度较低的问题，与其它生物法制备糖苷类化合物相比具有产量高、时空产率高等优势。该糖苷酶以廉价寡糖为糖基供体，显著降低了糖苷产物的生产成本，反应体系中使用DMSO、DMF和叔丁醇等绿色无毒性溶剂，也有利于环境保护。多种半乳糖苷产物的高产量制备获得，对于进一步研究开发新型高选择性靶向性药物具有重要的积极意义。附图说明图1是gal基因的PCR扩增电泳图；其中M：DNAMarker；1，2：gal基因的PCR扩增产物；图2是为半乳糖苷酶的聚丙烯酰胺电泳图；其中：(1)空质粒宿主菌E.coliBL21/pET28a(+)的破碎上清对照；(2)重组菌E-pET-gal诱导表达的破碎上清；(3)纯化后的重组半乳糖苷酶；图3是实施例4转化液HPLC图谱，N为酪醇，N1为酪醇半乳糖苷，N2为酪醇双糖基化产物；图4是实施例4质谱分析图谱；图5是实施例4的13C-NMR图谱；图6是实施例4的1H-NMR图谱；图7是实施例4半乳糖苷酶催化酪醇的转糖基化反应的进程曲线；图8是半乳糖苷酶催化酪醇的转糖基化反应在不同pH下的转化率；图9是半乳糖苷酶催化酪醇的转糖基化反应在不同温度下的转化率。具体实施方式实施例1本实施例说明本发明的耐有机溶剂高效半乳糖苷酶gal编码基因的分离克隆程序，本发明的半乳糖苷酶gal编码基因从沙雷氏菌属菌株（Serratiamarcescens）MH6的总DNA中提取，所述MH6菌株保藏编号为CCTCCNO：M208205，已在申请人在先申请CN101586086B中公开。采用酚-氯仿法抽提菌体总DNA。通过对全基因组序列分析，VectorNTI软件分析比对，确定保守区域，获得一个编码半乳糖苷酶的基因，根据该基因核苷酸序列设计引物SF和SR。SF(SEQIDNO：3)序列为：CGCCATATGCGAGAAAATTATTATGAACSR(SEQIDNO：4)序列为：GCGAAGCTTTTATTTCATCTCCAAACGAC其中，引物SF下划线部分为NdeⅠ酶切位点，引物SR下划线部分为HindⅢ酶切位点。以沙雷氏菌属菌株（Serratiamarcescens）MH6基因组为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×TaqPlusMasterMix25μL，引物SF和SR各2μL，DNA模板2μL和ddH2O19μL。PCR扩增步骤为：（1）95℃，预变形5min；（2）95℃，变形30S；（3）52℃，退火30S；（4）72℃，延伸2min；步骤（2）～（4）重复30次；（5）72℃彻底延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带（图1）。获得一条完整的半乳糖苷酶基因序列，全长1386bp，命名为糖苷酶gal，其碱基序列如序列表中SEQIDNO:1所示。实施例2本实施例说明重组表达载体和重组表达转化体的制备。将实施例1所得的半乳糖苷酶基因片段在37℃用限制性内切酶HindⅢ和NheⅠ双酶切3h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经HindⅢ和NheⅠ酶切后的质粒pET28a，在16℃下过夜连接得到重组表达质粒pET-gal。将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，菌落PCR验证阳性克隆，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-gal（以下简称E-pET-gal）。实施例3本实施例说明重组半乳糖苷酶gal诱导表达与纯化过程。将重组菌E-pET-gal接种到LB/Kana液体培养基中过夜培养，以2%(v/v)的接种量接种至新鲜培养基中，培养至OD600到0.6-0.8时，加入诱导剂0.5mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，37℃，180r·min-1诱导表达4h。诱导后的发酵液在4℃，8000r·min-1条件下离心10min，菌体细胞用等体积缓冲液(50mM的Na2HPO4-KH2PO4，pH7.0)悬浮，经生理盐水洗涤两遍后用pH7.5-8.5的PBS缓冲重悬细胞，获得静息细胞液在冰浴中超声破碎(300W；超声3s，间歇5s，总时间5min)，4℃，12000r·min-1离心15min去除细胞碎片，得到重组半乳糖苷酶的粗酶液。粗酶液用Ni-NTAAgarose亲和柱（GeneralElectricCompany）层析除去杂蛋白，得到纯化后的半乳糖苷酶。得到的纯化后的重组糖苷酶gal从图2可以看到。实施例4本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在合成酪醇半乳糖苷中的应用催化合成酪醇半乳糖苷的反应条件：在15%(v/v)DMSO体系中，pH7.5磷酸缓冲(50mMKH2PO4-Na2HPO4)，乳糖200g·L-1，酶用量2.4U·mL-1，反应温度50℃。50g·L-1酪醇的条件下可获得约33.1g·L-1的酪醇单半乳糖苷，占总糖苷产物的91%，时空产率约2.07g/L/h。在本优选的条件下，将酪醇转化液经HPLC、LC-MS、13C-NMR和1H-NMR鉴定，确认产物为酪醇半乳糖苷。检测图谱如图3-6所示。该反应的反应进程曲线如图7所示。实施例5本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在合成对羟基苯甲醇半乳糖苷中的应用催化合成对羟基苯甲醇半乳糖苷的反应条件：25%(v/v)DMSO体系中，pH7.5磷酸缓冲(50mMKH2PO4-Na2HPO4)，乳糖200g·L-1，酶用量2.4U·mL-1，反应温度50℃。55g·L-1对羟基苯甲醇的条件下可获得约40.5g·L-1的对羟基苯甲醇单半乳糖苷，占总糖苷产物的相对含量99%，时空产率约2.53g/L/h。实施例6本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在合成对甲氧基苯甲醇半乳糖苷中的应用催化合成甲氧基苯甲醇半乳糖苷的反应条件：10%(v/v)DMSO体系中，pH7.5磷酸缓冲(50mMKH2PO4-Na2HPO4)，乳糖200g·L-1，酶用量2.4U·mL-1，反应温度50℃。30g·L-1甲氧基苯甲醇的条件下可获得约26.2g·L-1的甲氧基苯甲醇半乳糖苷，占总糖苷产物的相对含量95%，时空产率约1.65g/L/h。实施例7本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在合成肉桂醇半乳糖苷中的应用催化合成肉桂醇半乳糖苷的反应条件：10%(v/v)DMSO体系中，pH7.5磷酸缓冲(50mMKH2PO4-Na2HPO4)，乳糖200g·L-1，酶用量2.4U·mL-1，反应温度50℃。55g·L-1肉桂醇的条件下可获得约9.82g·L-1的肉桂醇半乳糖苷，占总糖苷产物的相对含量90%，时空产率约0.62g/L/h。实施例8本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在合成水杨醇半乳糖苷中的应用催化合成水杨醇半乳糖苷的反应条件：10%(v/v)DMSO体系中，pH7.5磷酸缓冲(50mMKH2PO4-Na2HPO4)，乳糖200g·L-1，酶用量2.4U·mL-1，反应温度50℃。60g·L-1水杨醇的条件下可获得约39.75g·L-1的水杨醇半乳糖苷，占总糖苷产物的相对含量87%，时空产率约2.51g/L/h。实施例9本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在不同pH下合成酪醇半乳糖苷中的应用催化合成酪醇半乳糖苷的反应条件：在15%(v/v)DMSO体系中，pH不同的缓冲溶液中，乳糖100g·L-1，酪醇用量10g·L-1，酶用量2.4U·mL-1，反应温度50℃。结果如附图8所示，最适pH为7.5，产率在26.1%。实施例10本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在不同温度下合成酪醇半乳糖苷中的应用催化合成酪醇半乳糖苷的反应条件：在15%(v/v)DMSO体系中，pH7.5的磷酸缓冲，乳糖100g·L-1，酪醇用量10g•L-1，酶用量2.4U·mL-1，反应温度20~65℃。结果如附图9所示，最适温度为50℃，产率在27%。实施例11本实施例说明本发明半乳糖苷酶gal在不同种类、浓度有机溶剂合成酪醇半乳糖苷中的应用催化合成酪醇半乳糖苷的反应条件：在DMSO、DMF、叔丁醇、丙酮体系中，pH7.5磷酸缓冲(50mMKH2PO4-Na2HPO4)，乳糖250g·L-1，酪醇用量25g•L-1酶用量2.4U·mL-1，反应温度50℃。结果如下表1所示，表1中N1为酪醇半乳糖苷。表1半乳糖苷酶催化酪醇的转糖基化反应在不同浓度不同有机溶剂下的转化率溶剂系统（v/v）产物N1占总糖苷产物的相对含量总转化率水78.40%32.31%5%叔丁醇88.10%32.54%10%叔丁醇90.36%28.92%15%叔丁醇91.23%26.05%20%叔丁醇93.45%24.47%25%叔丁醇100%16.11%5%丙酮85.40%32.06%10%丙酮90.21%27.20%15%丙酮94.57%19.78%20%丙酮98.87%18.70%5%DMSO85.42%33.31%10%DMSO88.73%31.02%15%DMSO91.23%29.63%20%DMSO92.56%24.93%25%DMSO93.70%21.21%30%DMSO95.48%17.93%5%DMF86.05%32.65%10%DMF88.17%29.56%15%DMF93.86%24.87%20%DMF98.03%14.33%序列表<110>南京工业大学<120>一种耐有机溶剂高效半乳糖苷酶及其应用<130>xb18030903<141>2018-03-09<160>4<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>1386<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>CDS<222>(1)..(1386)<400>1atggaatatcaatttgccgacgggttctggtggggcagcgccacctcc48MetGluTyrGlnPheAlaAspGlyPheTrpTrpGlySerAlaThrSer151015gcgccgcagtctgaaggggcggccgcgcgggacggcaagagtcgcaac96AlaProGlnSerGluGlyAlaAlaAlaArgAspGlyLysSerArgAsn202530atcttcgactattggtacgagatcgcgcccgagcgctttcacggacgg144IlePheAspTyrTrpTyrGluIleAlaProGluArgPheHisGlyArg354045gtggggccgactgaggcctcgaccttttatgaccatttccgcaccgat192ValGlyProThrGluAlaSerThrPheTyrAspHisPheArgThrAsp505560atcgggctgctcaaaacgctgggccataatactttcagaacctcgatc240IleGlyLeuLeuLysThrLeuGlyHisAsnThrPheArgThrSerIle65707580tcgtggtcgcggctgatcccggacggcgacggtgaagtgaacccgcag288SerTrpSerArgLeuIleProAspGlyAspGlyGluValAsnProGln859095gcggtggcgttctataacgcgatgatcgacgagctgctggcgcagggc336AlaValAlaPheTyrAsnAlaMetIleAspGluLeuLeuAlaGlnGly100105110atcaccccgtttatcaatctctatcacttcgatatgccgctgtgcatg384IleThrProPheIleAsnLeuTyrHisPheAspMetProLeuCysMet115120125caacagcgcggcggttgggaaagccgggcggtggtcgaagcctatgcg432GlnGlnArgGlyGlyTrpGluSerArgAlaValValGluAlaTyrAla130135140cgttacgccgatacctgtttcggcctgtttggcgatcgggtcacccac480ArgTyrAlaAspThrCysPheGlyLeuPheGlyAspArgValThrHis145150155160tggttcaccttcaacgagccgatcgtgccggtggaagccggttacctg528TrpPheThrPheAsnGluProIleValProValGluAlaGlyTyrLeu165170175aatgacctgcactacccttgcgtggtggacttcaaacgggcggtcacc576AsnAspLeuHisTyrProCysValValAspPheLysArgAlaValThr180185190gtggcgtatcacagcgtgctggcgcacgccatggcggtgcggcgtttc624ValAlaTyrHisSerValLeuAlaHisAlaMetAlaValArgArgPhe195200205agagcgcggaggctgccggggagcatcggcatcattctgaatctgagc672ArgAlaArgArgLeuProGlySerIleGlyIleIleLeuAsnLeuSer210215220ccgacctatccgcgctccgacgcgccggaggatcggcaggccgcacac720ProThrTyrProArgSerAspAlaProGluAspArgGlnAlaAlaHis225230235240gacgccgatctgctgctcaaccgcagtttcctcgacccggtcgccaaa768AspAlaAspLeuLeuLeuAsnArgSerPheLeuAspProValAlaLys245250255gggcgttacccggccgcattgctgcacctgttggagcgacatgggctg816GlyArgTyrProAlaAlaLeuLeuHisLeuLeuGluArgHisGlyLeu260265270atgccctattgcgaaccgcaggacgcgcagctgatcgaaggcggcgtg864MetProTyrCysGluProGlnAspAlaGlnLeuIleGluGlyGlyVal275280285gtggatatccttggcgtcaactattaccagccgcgcagggtgcaggcg912ValAspIleLeuGlyValAsnTyrTyrGlnProArgArgValGlnAla290295300aaagcgggacggcgcgccgaggggccgatcgcatcgccggaggatttg960LysAlaGlyArgArgAlaGluGlyProIleAlaSerProGluAspLeu305310315320ttcagttactatgcaatgccgggccgcaaaatcaatccgcaccgcggc1008PheSerTyrTyrAlaMetProGlyArgLysIleAsnProHisArgGly325330335tgggagatctacgagaaggggctgtacgacatcctgatggatctgaaa1056TrpGluIleTyrGluLysGlyLeuTyrAspIleLeuMetAspLeuLys340345350gagaactacggcaatctgccctgttatatttcggaaaatggcatgggc1104GluAsnTyrGlyAsnLeuProCysTyrIleSerGluAsnGlyMetGly355360365gtcgagggcgaagaggcgtttatcggcgccgatgggcgggtggaggac1152ValGluGlyGluGluAlaPheIleGlyAlaAspGlyArgValGluAsp370375380gattaccgcatcgactttattcgcgagcacctgaagtggctgcaccgc1200AspTyrArgIleAspPheIleArgGluHisLeuL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