本发明涉及一种界面分子信标传感器及其检测方法。
背景技术:
分子信标(molecularbeacon)是近年发展迅速的一类分析传感设计:通常需要设计发夹构型(hairpin)的核酸分子,在发夹两端分别标记荧光基团和猝灭基团,当发生特异性识别时,将引起发夹结构由关闭到打开,诱导荧光标记基团与猝灭基团的空间距离由相互靠近到远离,引起荧光信号由猝灭到恢复,用以对特异性识别的目标分析物(如核酸、蛋白质、有机小分子、金属离子等)进行检测。
金属纳米材料对靠近的荧光基团具有独特的表面等离子体作用:当荧光基团与金属表面充分接近时,将产生荧光猝灭;当荧光基团离开金属表面但仍处于近场范围时,将可观察到荧光增强现象。将分子信标与纳米金属材料结合,通过分子信标识别反应前后的构型变化,可产生标记荧光基团与金属表面的距离变化,构型变化诱导下,荧光团和金属间距离变化的大小,以及由此产生猝灭作用向金属增强作用变化的程度,成为影响传感器灵敏度的关键。基于现有结构的分子信标,需要设计较长碱基序列的分子信标,以保证传感前后有足够大的构型变化来引发金属-荧光团的距离变化,从而产生荧光猝灭到增强的信号变化;而这限制了短序列传感分子在金属荧光增强研究中的应用。另一方面,基于发夹结构的分子信标,需要特殊的序列设计,特别需对茎环(stem-loop)结构进行仔细优化才能用于传感,因而对设计者提出了较高的要求,限制了基于表面等离子体作用的、荧光信号由猝灭到增强的分子信标传感器设计的更广泛的分析传感应用。
综上所述,如何发展通用性强、普适性好、易于实现与推广的传感设计,发展荧光猝灭与荧光增强充分利用的、信背比进一步提升的传感分析方法,是亟待解决的问题。
技术实现要素:
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供了一种界面分子信标传感器及其检测方法,解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供了一种界面分子信标传感器,包括自下而上依次层叠设置的芯片、纳米金属层、非金属电介质层、氧化石墨烯层,还包括设置于氧化石墨烯层上的核酸分子探针;所述核酸分子探针的一端通过末端共价修饰于氧化石墨烯层上,另一端标记荧光基团;所述纳米金属层用于与荧光基团标记的荧光染料产生表面等离子体耦合共振;所述非金属电介质层用于消除金属猝灭作用;所述于氧化石墨烯层用于吸附未发生特异性识别的核酸分子探针并猝灭其荧光基团信号;所述核酸分子探针用于特异性识别目标分析物。
在本发明一较佳实施例中,所述纳米金属层的金属包括金、银、铜。
在本发明一较佳实施例中,所述纳米金属层厚度为20nm~100nm。
在本发明一较佳实施例中,所述非金属电介质层的非金属电介质包括二氧化硅、二氧化钛、聚甲基丙烯酸甲酯。
在本发明一较佳实施例中,所述非金属电介质层厚度为5nm~100nm。
在本发明一较佳实施例中,所述芯片下表面连接有用于收集耦合荧光信号的棱镜。所述棱镜与芯片通过折射油相连,所述折射油的折射率与所用棱镜相适配。
本发明还提供了一种界面分子信标传感器的检测方法,包括如下步骤:
(1)基底制备:以石英芯片为基材,在其上表面溅射出厚度为20nm~100nm的纳米金属层和厚度为5nm~100nm的非金属电介质层,之后放入酸溶液中浸泡25~35min,取出用去离子水充分冲洗,氮气吹干;在非金属电介质层上通过旋转涂布方式,涂覆氧化石墨烯层,得到基底;
(2)传感器制备:将步骤(1)制得的基底在1-芘丁酸的dmf溶液中浸泡1.5~2.5h。洗净后,在含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和n-琥珀酰亚胺的mes缓冲液中活化1~2h;洗净后,滴加两端分别由氨基和texasred染料标记的核酸核酸分子探针溶液静置2.5~3.5h;随后滴加0.1%牛血清白蛋白封闭1h后清洗干净;
(3)检测:将石英芯片的下表面通过折射油与棱镜相连,所述折射油的折射率与所用棱镜相适配,以激发光照射芯片,并于棱镜一侧收集耦合荧光信号,将含目标分子的待测样品孵育在传感器表面,通过待测样品孵育前后的信号变化实现对待测样品变化进行检测。
在本发明一较佳实施例中,步骤(2)中先以80-120r/min、8-10s低速旋转涂布,后以2800~3200r/min、38~42s高速旋转涂布。
在本发明一较佳实施例中,步骤(3)对待测样品不同链长度核酸、目标分子随浓度变化进行检测。
石英芯片表面蒸镀纳米金属层、纳米电介质层,接着修饰氧化石墨烯和荧光标记核酸分子探针,构成界面分子信标。
标记有荧光染料的核酸分子探针(如dna、rna等)具有与待测目标特异性结合的序列或结构:如待测目标为核酸时,探针应与其有相互配对的序列;如待测目标为蛋白质、有机小分子、金属离子等,探针应与其有特异性结合的序列位点。所选标记荧光染料,应与前述制备纳米金属层产生表面等离子体耦合共振。荧光染料标记的核酸分子探针通过末端共价修饰于前述附着有氧化石墨烯基底上产生荧光猝灭。氧化石墨烯对未发生分子识别的核酸探针有强吸附作用,对进行特异性识别反应的核酸核酸分子探针的吸附作用减弱。
核酸分子探针,吸附在氧化石墨烯表面,导致标记荧光分子信号猝灭。将核酸分子探针与基底结构整体作为“界面分子信标”:基底与核酸探针间的相互作用与分子识别引起的构型变化相关,基底调控荧光信号的猝灭或增强。利用氧化石墨烯与具有目标分析物识别能力的核酸分子探针,组成信号传感单元:没有目标分析物时,核酸紧密吸附在氧化石墨烯表面,造成标记荧光团的有效猝灭;存在目标分析物时,核酸与目标分析物结合,造成核酸与氧化石墨烯的结合能力下降,标记荧光团离开氧化石墨烯表面。由于电介质层的存在,界面分子信标已经处在耦合增强的区域,荧光团与氧化石墨烯分离的微小距离变化,能够通过增强荧光得到检测。如果没有电解质层,距离变化无法抵抗金属猝灭作用的影响,荧光团始终处在猝灭区域,无法得到可检测的信号。
检测时,将芯片通过折射率匹配油与棱镜相连;将待测样品孵育在芯片表面;核酸分子探针与目标分析物的结合,将促使标记的荧光分子离开氧化石墨烯表面;在激发光的激励下,荧光团与金属层表面等离子体产生相互作用,通过棱镜在特定空间角度产生表面等离子体耦合发射荧光,报告目标分析物的检测。
本技术方案与背景技术相比,具有如下优点:
1.在金属增强荧光传感设计中提出“界面分子信标”概念,巧妙地将芯片界面与探针分子融为一体,利用界面辅助传感识别、调控荧光猝灭或荧光增强。充分利用猝灭作用和金属增强作用,提高传感分析的信背比。
2.核酸分子探针可采用短序列,仅修饰有荧光基团,无需另外修饰猝灭基团,摒弃了发夹型探针的固定结构,且无需像传统的分子信标一样进行复杂的核酸空间结构的设计,为利用微小构型或距离变化发展表面等离子耦合增强荧光传感器提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明的检测工作流程示意图。
图2为实施例3中检测不同链长的核酸序列时信背比。
图3为实施例4中检测hiv相关序列时(a)杂交前后表面等离子体耦合荧光光谱与定向发射角度分布情况;(b)为信背比随浓度变化情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体说明本发明的内容:
实施例1
请查阅图1,本实施例的一种界面分子信标传感器,包括自下而上依次层叠设置的芯片4、纳米金属层3、非金属电介质层2、氧化石墨烯层1,还包括设置于氧化石墨烯层1上的核酸分子探针5;所述核酸分子探针5的一端通过末端共价修饰或浸泡吸附于氧化石墨烯层1上,另一端标记有用于特异性识别的荧光基团。所述核酸分子探针5为非发夹构型的短序列,仅修饰有荧光基团,不含有猝灭基团,利用氧化石墨烯层1实现猝灭。
所述纳米金属层3厚度为20nm~100nm,用于与荧光基团标记的荧光染料产生表面等离子体耦合共振,所述金属包括金、银、铜。
所述非金属电介质层2厚度为5nm~100nm,用于消除金属猝灭作用,所述非金属电介质包括二氧化硅、二氧化钛、聚甲基丙烯酸甲酯。
非金属电介质层2的厚度使核酸分子探针5与纳米金属层3达到间隔25nm及以上的距离,根据使用核酸分子探针链长变化调整厚度以获取荧光分子在耦合增强区域中最有利的位置。
所述芯片4下表面连接有用于收集耦合荧光信号的棱镜6。所述棱镜6与芯片4通过折射油相连,所述折射油的折射率与棱镜6相当。
实施例2
请查阅图1~2,本实施例提供了一种界面分子信标传感器的检测方法,包括如下步骤:
(1)基底制备:以石英芯片4为基材,在其上表面依次溅射2nmcr、50nmau和30nm的sio2后,将基底放入热酸中浸泡30min,所述热酸指v(h2so4):v(h2o2)=1:3的piranha热酸(食人鱼洗液),之后取出用去离子水充分冲洗,氮气吹干;随后将其置于匀胶机吸盘中央,取50μl2mg/ml氧化石墨烯于基底表面,设置低速旋转(100r/min)10s后再高速旋转(3000r/min)40s;氧化石墨烯通过旋转涂布方式涂覆,完成基底制备。
(2)传感器制备:将步骤(1)制得的基底在1mm1-芘丁酸的dmf溶液(二甲基甲酰胺)中浸泡2h。洗净后,在含有10mm1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10mmn-琥珀酰亚胺的mes(0.1m)缓冲液中活化1h;洗净后,滴加两端分别由氨基和texasred染料标记的核酸核酸分子探针5溶液静置2.5~3.5h;随后滴加0.1%牛血清白蛋白封闭1h后清洗干净;
(3)检测:将石英芯片4的下表面通过折射油与棱镜6相连,所述折射油的折射率与棱镜6收集的耦合荧光信号相匹配,以激发光照射芯片4,并于棱镜6一侧收集耦合荧光信号,将含目标分子的待测样品孵育在传感器表面,通过待测样品孵育前后的信号变化实现对待测样品变化进行检测。
实施例3
利用本发明传感器进行不同链长度核酸检测。
分别选择8、16、24、48个碱基的核酸探针制备传感器,并与对应的目标核酸序列进行杂交测量。
所使用探针与目标分子序列为:
5'-nh2-gttccgtc-texasred-3'(8碱基);
5'-gacggaac-3'(8碱基);
5'-nh2-cggatctcgatgagct-texasred-3'(16碱基);
5'-agctcatcgagatccg-3'(16碱基);
5'-nh2-gttaggaaaaaatcaaacactcgc-texasred-3'(24碱基);
5'-gcgagtgtttgattttttcctaac-3'(24碱基);
5'-nh2-cgctctggaaatgttcaatgaggactatgtgacattccccagggacgc-texasred-3'(48碱基);
5'-gcgtccctggggaatgtcacatagtcctcattgaacatttccagagcg-3'(48碱基)。
结果如图2所示,当所检测到核酸序列由8个碱基改变到48个碱基时,相应于核酸与界面距离变化由2.4nm变化到14.4nm时,都能保持1000倍以上的信背比。表明通过本发明可有效提升提升传感器对微小距离变化的传感识别能力。信背比定义为(fafter-fblank)/(fbefore-fblank),其中,fbefore和fafter为待测目标分子加入前后获得的荧光信号,fblank为仪器自带空白信号。
实施例4
利用本发明传感器对目标分子随浓度变化的检测。
以hiv相关序列为检测分子,以相配对的序列作为核酸分子探针5构建传感器,所使用的探针与目标分子序列为:
5'-nh2-agaagatatttggaataacatgacctggatgca-texasred-3';
5'-tgcatccaggtcatgttattccaaatatcttct-3'。
如图3所示,利用本发明传感器可对目标探针分子进行响应,所获得荧光信号表现出定向发射的特性,表明通过该传感设计成功实现了表面等离子体耦合发射。传感器表现出良好的浓度依赖关系,可用于目标分子识别的灵敏传感分析检测。
本领域技术人员可知,当本发明的技术参数在如下范围内变化时,可以预期得到与上述实施例相同或相近的技术效果:
纳米金属层3可为金、银、铜以及能与荧光染料产生表面等离子体耦合发射的金属纳米材料,层厚度根据纳米材料耦合性能设为20~100nm。
纳米非金属电介质层2可为二氧化硅、二氧化钛、聚甲基丙烯酸甲酯等厚度可控制在5~100nm的非金属材质的纳米层材料,可作为隔绝层消除金属猝灭作用的影响,获取荧光分子在耦合增强区域中最有利的位置。
利用氧化石墨烯层1对接触的荧光染料具有猝灭作用,其对有无发生特异性识别的核酸分子的吸附能力不同。通过匀胶涂布、静电吸附、固相转移或化学键合等方式形成薄膜附着在已制备有纳米金属层3和纳米电介质层的基底上。
以上所述,仅为本发明较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
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厦门大学深圳研究院
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