本发明属于萃取物安全性检测技术领域，特别是涉及一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法。
背景技术：
化妆品是指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。化妆品种主要是由一些添加剂组成；而现有的一些添加剂对皮肤都有一定的损害作用；2010年后，零负担产品开始诞生，一批零负担产品，将主导减少没必要的化学成分，增加纯净护肤成分为主题，给用过频繁化妆品的女性朋友带了全新的变革，“零负担”产品的主要特点在于，产品激烈减少了很多无用成分，护肤成分，例如玻尿酸、胶原蛋白等均为活性使用，直接肌肤吸收，产品性能极其温和，哪怕再脆弱的肌肤只要使用妥当，一般也没有问题，因此，这就可以最大限度的化妆不破坏皮肤。
目前市场上未有开发兰花生长点萃取物之化妆品；因此针对以兰花萃取液作为化妆品的添加剂制造兰花系列的化妆品之前需对兰花对皮肤细胞的损伤进行测定，本发明一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，通过细胞存活度试验；细胞周期试验；保护因紫外线及氧化伤害而造成的dna损伤试验；修护因紫外线及氧化伤害而造成的皮肤细胞损伤试验对兰花萃取物的安全性进行评价，解决了现有兰花系列化妆品空缺的问题。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，包括如下过程：
ss01、检测细胞存活度：
具体包括评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞是否具细胞毒性，评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞型态变化，评估皮肤细胞周期；
ss02、评估兰花生长点萃取物之保护因紫外线及氧化伤害而造成的dna损伤：
具体包括兰花生长点萃取物保护环状dna效应评估、兰花生长点萃取物保护片段化dna效应评估；
ss03、评估兰花生长点萃取物修护因紫外线造成皮肤细胞损伤：
具体包括评估萃取物修护皮肤细胞经紫外线作用后细胞存活度、评估侦测dna损伤之环丁嘧啶二聚体生成量。
进一步地，所述ss01中检测细胞存活度中评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞是否具细胞毒性的过程如下步骤：
s011、皮肤细胞培养：取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％co2培养箱中培养至少24小时；
s012、萃取液配置：取冷藏备用的兰花生长点萃取物并配置成不同浓度梯度的萃取液；
s013、细胞毒性评估：向s011中的96孔培养板加入s012配置的不同浓度的萃取液，反应后移除培养液，并用无菌pbs清洗一次后重新加入培养液以及10ul的mtt溶液反应，在37℃以及5％co2培养箱中培养反应4小时后移除培养液，加入100μl的dmso溶解甲臢沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值。
进一步地，所述ss01中检测细胞存活度中评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞型态变化的过程如下步骤：
s014取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％co2培养箱中培养至少24小时；
s015向s014中的96孔培养板加入1μl的萃取物，在不同时间梯度反应后，于显微镜下观察细胞形态并拍照记录。
进一步地，所述ss01中检测细胞存活度中评估皮肤细胞周期的过程如下步骤：
s021、取人类皮肤角质株化细胞培养在24孔培养板中培养至少24小时；
s022、加入10μl兰花生长点萃取物，于培养箱中反应；
s023、反应后取出上清液和细胞，并放入离心管中以1200rpm离心5分钟；移除上清液，加入300μl的pbs，缓慢震荡并逐滴加入700μl酒精固定细胞后移至微量离心管中，置于4℃冰箱储存；
s024、将微量离心管以1200rpm离心5分钟，移除上清液，依序加入445μl的pbs，5μl浓度为10mg/ml的核糖核酸酶a以及50μl浓度为10％的聚乙二醇辛基苯基醚，于37℃反应30分钟将人类皮肤角质株化细胞的rna破坏分解后，以1200rpm离心5分钟并移除上清液后，加入400μl的pbs混合均匀后再加入5μl浓度为5mg/ml的聚酰亚胺溶液于4℃的温度下避光反应5分钟，以过滤膜过滤；
s025、使用流式细胞分析仪并配合winmdi软件分析细胞周期分布比例。
进一步地，所述人类皮肤角质株化细胞在96孔培养板中的细胞密度为1×104/well。
进一步地，所述评估ss02中兰花生长点萃取物保护环状dna效应的过程如下步骤：
s0311、将puc119dna质粒以1:8比例用pbs稀释；
s0312、取s0311中的稀释液分别设立控制组、紫外线和双氧水作用组、紫外线和双氧水作用+萃取物组；
s0313、各取2μl经s0312步骤处理的puc119dna质粒稀释液置于微量离心管中，观察判断萃取物是否具保护皮肤组织抗紫外线及氧化伤害效能；
其中，所述紫外线和双氧水作用+萃取物组中的萃取物采用兰花生长点萃取物配成的不同浓度梯度的萃取液，于37℃作用1小时，加入加载染料混合后，于0.8％浓度的琼脂糖溶液中进行电泳，30分钟后一电泳胶片影像撷取系统分析，分析s型dna和l型dna的百分比例。
进一步地，所述评估ss02中兰花生长点萃取物保护片段化dna效应的过程如下步骤：
s0321、将稀释的2μl标准分子量的dna片段加入微量管中；
s0322、分别设立控制组，紫外线和双氧水作用组、紫外线和双氧水作用+萃取物组；
s0323、取不同浓度梯度的兰花生长点萃取液，于37℃作用1小时，加入加载染料混合后，于0.8％浓度的琼脂糖溶液中进行电泳，30分钟后一电泳胶片影像撷取系统分析，分析s型dna和l型dna的百分比例。
进一步地，所述ss03中评估萃取物修护皮肤细胞经紫外线作用后细胞存活度的过程如下步骤：
s0411、取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％co2培养箱中培养至少24小时；
s0412、分别设立控制组，紫外线照射组，紫外线照射+萃取物处理组；s0413、反应结束后，移除培养液，用pbs清洗并重新加入新的培养液以及10ul的mtt溶液反应，在37℃以及5％co2培养箱中培养反应4小时后移除培养液，加入100μl的dmso溶解甲臢沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值，对各组中的细胞存活度分析。
进一步地，所述ss03中评估侦测dna损伤之环丁嘧啶二聚体生成量的过程如下步骤：
s0421、取细胞密度为1×105/well的人类皮肤角质株化细胞培养在24孔培养板中培养至少24小时；
s0422、分别设立控制组，紫外线照射组，紫外线照射+萃取物处理组；
s0423、将处理后的细胞加入无血清新鲜培养液中继续培养4小时，移除移除培养液，用pbs清洗并加入冰甲醇固定细胞，再以聚乙二醇辛基苯基醚作用，加入浓度为2mol/l的盐酸作用1小时后再以1％的牛血清白蛋白填补细胞间隙，再加入cpd一级抗体在37℃条件下摇晃反应1小时，取出cpd一级抗体，再加入cpd二级抗体避光反应30分钟，用pbs清洗，在波长为504-524nm的条件下侦测荧光表现；再加入荧光染料进行细胞核染色，再以用pbs清洗后在波长为355-460nm的条件下侦测荧光表现，并于荧光显微镜下观察拍照；
s0424、对各组中细胞在波长为504-524nm的条件下侦测荧光表现，在波长为355-460nm的条件下侦测荧光表现以及显微镜下的照片进行对比分析。
进一步地，所述控制组为移除细胞上清液，更换血清新鲜培养液，培养4小时后，用pbs清洗后再置入无血清新鲜培养液中继续培养4小时；
其中，所述紫外线照射组为移除细胞上清液，更换血清新鲜培养液，培养4小时后，移除上清液后用pbs清洗并抽干，分别进行紫外线照射后，立即加入无血清新鲜培养液中继续培养4小时；
其中，所述紫外线照射+萃取物处理组为移除细胞上清液，更换血清新鲜培养液，培养4小时后，移除上清液后用pbs清洗并抽干，分别进行紫外线照射后，立即加入含萃取物之无血清新鲜培养液中继续培养4小时。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过细胞存活度试验；细胞周期试验；保护因紫外线及氧化伤害而造成的dna损伤试验；修护因紫外线及氧化伤害而造成的皮肤细胞损伤试验对兰花萃取物的安全性进行评价；本发明对兰花萃取物进行检测试验后，使用兰花萃取液兰花生长点萃取物作为化妆品的添加剂开发新的化妆品系列，提高了兰花产业的附加价值。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，包括如下过程：
ss01、检测细胞存活度：
采用mttassay检测。将人类皮肤角质株化细胞(1×104/well)培养在96-well盘，并在37℃及5％co2培养箱中培养至少24小时。评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞是否具细胞毒性：加入不同浓度的萃取物以及于指定的时间作用，达反应时间，移除旧的培养液，以pbs清洗一次，并换上新的培养液，加入10μl的mtt(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)溶液反应，于37℃、5％co2反应4小时后移除培养液，加入100μl的dmso溶解formazan沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值(biotek,synergytm2,usa)。
评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞是否具细胞毒性的过程如下步骤：
s011、皮肤细胞培养：取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％co2培养箱中培养至少24小时；
s012、萃取液配置：取冷藏备用的兰花生长点萃取物并配置成1-20比例的浓度梯度的萃取液；
s013、细胞毒性评估：向s011中的96孔培养板加入s012配置的不同浓度的萃取液，反应后移除培养液，并用无菌pbs清洗一次后重新加入培养液以及10ul的mtt溶液反应，在37℃以及5％co2培养箱中培养反应4小时后移除培养液，加入100μl的dmso溶解甲臢沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值。
评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞型态变化的过程如下步骤：
利用显微镜观察兰花生长点萃取液是否会改变皮肤细胞之型态。将细胞(1×104/well)培养在96-well盘，并在37℃及5％co2培养箱中培养至少24小时。加入1μl的萃取物以及于指定的时间作用，达反应时间后，于显微镜(nikon,te2000-u,japan)下观察细胞型态，并拍照记录。
s014取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％co2培养箱中培养至少24小时；
s015向s014中的96孔培养板加入1μl的萃取物，在5min、10min、15min、20min、25min的时间梯度反应后，于显微镜下观察细胞形态并拍照记录。
评估皮肤细胞周期的过程如下步骤：
将1×104/well细胞量培养在24well盘中至少24小时，之后加入10μl兰花生长点萃取物，于培养箱中反应。之后收集上清液至15ml离心管，再以trypsin-edta溶液将细胞取下至离心管中，与上清液一并离心1200rpm、5分钟。移除上清液，加入300μlpbs，缓慢震荡，并逐滴加入700μl绝对酒精固定细胞，再移至微量离心管，置于4℃冰箱中储存。流式细胞仪上机前，细胞在4℃下以1200rpm离心5分钟，移除上清液，依序加入445μlpbs，5μlrnase(10mg/ml)，50μl10％tritonx-100，将细胞的rna破坏分解后，于37℃反应30分钟，以1200rpm离心5分钟，移除上清液，加入400μlpbs混合均匀，再加入5μlpi(5mg/ml)，于4℃避光反应5分钟，以过滤膜过滤。利用流式细胞分析仪(flowcytometer,facscan)，配合winmdi计算机软件来分析细胞周期分布比例(％)。
s021、取人类皮肤角质株化细胞培养在24孔培养板中培养至少24小时；
s022、加入10μl兰花生长点萃取物，于培养箱中反应；
s023、反应后取出上清液和细胞，并放入离心管中以1200rpm离心5分钟；移除上清液，加入300μl的pbs，缓慢震荡并逐滴加入700μl酒精固定细胞后移至微量离心管中，置于4℃冰箱储存；
s024、将微量离心管以1200rpm离心5分钟，移除上清液，依序加入445μl的pbs，5μl浓度为10mg/ml的核糖核酸酶a以及50μl浓度为10％的聚乙二醇辛基苯基醚，于37℃反应30分钟将人类皮肤角质株化细胞的rna破坏分解后，以1200rpm离心5分钟并移除上清液后，加入400μl的pbs混合均匀后再加入5μl浓度为5mg/ml的聚酰亚胺溶液于4℃的温度下避光反应5分钟，以过滤膜过滤；
s025、使用流式细胞分析仪并配合winmdi软件分析细胞周期分布比例。
ss02、评估兰花生长点萃取物之保护因紫外线及氧化伤害而造成的dna损伤：
评估兰花生长点萃取物保护环状dna效应的过程如下步骤：
将puc119dnaplasmid以1:8比例用pbs稀释，进行各别处理─①.control组、②.uv与h2o2作用组、③.uv与h2o2作用+萃取物组。各别取2μl的puc119dnaplasmid于微量离心管后，探讨萃取物是否具保护皮肤细胞抗紫外线及氧化伤害效能组：取不同浓度的萃取物和uv+h2o2，于37℃作用1小时，加入loadingdye混合后，于0.8％agarose进行电泳，30分钟后以电泳胶片影像撷取系统分析，分析s-formdna和l-formdna之百分比例。
s0311、将puc119dna质粒以1:8比例用pbs稀释；
s0312、取s0311中的稀释液分别设立控制组、紫外线和双氧水作用组、紫外线和双氧水作用+萃取物组；
s0313、各取2μl经s0312步骤处理的puc119dna质粒稀释液置于微量离心管中，观察判断萃取物是否具保护皮肤组织抗紫外线及氧化伤害效能；
其中，所述紫外线和双氧水作用+萃取物组中的萃取物采用兰花生长点萃取物配成的不同浓度梯度的萃取液，于37℃作用1小时，加入加载染料混合后，于0.8％浓度的琼脂糖溶液中进行电泳，30分钟后一电泳胶片影像撷取系统分析，分析s型dna和l型dna的百分比例。
评估兰花生长点萃取物保护片段化dna效应的过程如下步骤：
将稀释之2μldnamwstandardmarker加入0.5ml微量管，进行各别处理─①.control组、②.uv与h2o2作用组、③.uv与h2o2作用+萃取物组。取不同浓度的萃取物和uv+h2o2，于37℃作用1小时，加入loadingdye混合，以琼脂胶凝胶核酸电泳分析。
s0321、将稀释的2μl标准分子量的dna片段加入微量管中；
s0322、分别设立控制组，紫外线和双氧水作用组、紫外线和双氧水作用+萃取物组；
s0323、取不同浓度梯度的兰花生长点萃取液，于37℃作用1小时，加入加载染料混合后，于0.8％浓度的琼脂糖溶液中进行电泳，30分钟后一电泳胶片影像撷取系统分析，分析s型dna和l型dna的百分比例。
ss03、评估兰花生长点萃取物修护因紫外线造成皮肤细胞损伤：
由于产品使用最先接触皮肤的角质层，因此本计划选用人类皮肤角质株化细胞进行安全性评估。采用mttassay检测。将皮肤角质细胞(1×104/well)培养在96-well盘，并在37℃及5％co2培养箱中培养至少24小时。
1.control组：移除细胞上清液，更换无血清之新鲜培养液，培养4小时后，以pbs清洗置入无血清之新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析。
2.uv照射组：移除细胞上清液，更换无血清之新鲜培养液，放置细胞培养箱中培养4小时后，移除上清液以pbs清洗并抽干，进行uv照射后，立即加入无血清之新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析。
3.uv照射+萃取物组：移除细胞之上清液，将萃取物，各别混合于无血清之新鲜培养液，培养4小时后，移除上清液以pbs清洗并抽干，各别进行uv照射后，立即加入含萃取物之无血清新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析。
4达反应时间，移除旧的培养液，以pbs清洗一次，并换上新的培养液，加入10μl的mtt(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)溶液反应，于37℃、5％co2反应4小时后移除培养液，加入100μl的dmso溶解formazan沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值(biotek,synergytm2,usa)。
过量紫外线照射引起dna损伤的原因在于其能诱发dna同条链内相邻的嘧啶硷基产生环丁嘧啶二聚体(cpd)光产物，使dna空间结构发生变化，从而阻碍dna复制、转录进而影响蛋白质的生物功能。因此，紫外线照射造成dna损伤的修复显得至关重要。将1×105/ml细胞培养于24孔盘至少24小时，进行各别处理─①.control组、②.uv照射组、③.uv照射+萃取物组。萃取物作用4小时后进行uv照射，更换不含血清培养液培养4小时。移除培养液以pbs清洗，以冰甲醇固定细胞，再以tritonx-100作用，加入2mhcl作用1小时，再以1％bsa填补细胞间隙，再以cpd一级抗体于37℃摇晃反应1小时，去除一级抗体后，再加入二级抗体避光反应30分钟，以pbs清洗于ex:504nm；em:524nm侦测荧光表现。再加入hoechst33342(10mg/ml)进行细胞核染色，以pbs清洗后再以ex:355nm；em:460nm侦测荧光表现，并于荧光显微镜下观察拍照。
评估萃取物修护皮肤细胞经紫外线作用后细胞存活度的过程如下步骤：
s0411、取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％co2培养箱中培养至少24小时；
s0412、分别设立控制组，紫外线照射组，紫外线照射+萃取物处理组；s0413、反应结束后，移除培养液，用pbs清洗并重新加入新的培养液以及10ul的mtt溶液反应，在37℃以及5％co2培养箱中培养反应4小时后移除培养液，加入100μl的dmso溶解甲臢沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值，对各组中的细胞存活度分析。
其中，人类皮肤角质株化细胞在96孔培养板中的细胞密度为1×104/well。
其中，ss03中评估侦测dna损伤之环丁嘧啶二聚体生成量的过程如下步骤：
s0421、取细胞密度为1×105/well的人类皮肤角质株化细胞培养在24孔培养板中培养至少24小时；
s0422、分别设立控制组，紫外线照射组，紫外线照射+萃取物处理组；
s0423、将处理后的细胞加入无血清新鲜培养液中继续培养4小时，移除移除培养液，用pbs清洗并加入冰甲醇固定细胞，再以聚乙二醇辛基苯基醚作用，加入浓度为2mol/l的盐酸作用1小时后再以1％的牛血清白蛋白填补细胞间隙，再加入cpd一级抗体在37℃条件下摇晃反应1小时，取出cpd一级抗体，再加入cpd二级抗体避光反应30分钟，用pbs清洗，在波长为504-524nm的条件下侦测荧光表现；再加入荧光染料进行细胞核染色，再以用pbs清洗后在波长为355-460nm的条件下侦测荧光表现，并于荧光显微镜下观察拍照；
s0424、对各组中细胞在波长为504-524nm的条件下侦测荧光表现，在波长为355-460nm的条件下侦测荧光表现以及显微镜下的照片进行对比分析。
其中，控制组为移除细胞上清液，更换血清新鲜培养液，培养4小时后，用pbs清洗后再置入无血清新鲜培养液中继续培养4小时；
其中，所述紫外线照射组为移除细胞上清液，更换血清新鲜培养液，培养4小时后，移除上清液后用pbs清洗并抽干，分别进行紫外线照射后，立即加入无血清新鲜培养液中继续培养4小时；
其中，所述紫外线照射+萃取物处理组为移除细胞上清液，更换血清新鲜培养液，培养4小时后，移除上清液后用pbs清洗并抽干，分别进行紫外线照射后，立即加入含萃取物之无血清新鲜培养液中继续培养4小时。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。