本发明属于植物病害预防技术领域，具体涉及一种水稻纹枯病菌粗毒素鉴定方法。
背景技术：
立枯丝核菌是水稻纹枯病的主要真菌病原体，在世界上所有稻米产区都可造成重大产量损失。无性态为立枯丝核菌rhizoctoniasolanikühn属半知菌，产生菌丝和菌核。病菌的菌丝比较粗壮，开始培养时无色，成熟时呈淡褐色，生长温度为10-30℃，适温29℃。立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)是一种不产生任何无性孢子，并经常以菌丝或菌核的形态存在于自然界的生活在土壤里的病原菌，且其中大部分病原菌是重要的植物病原菌。
近年来，随着学者们对纹枯病的研究更加深入，发现从病菌中提取的毒素是引起纹枯病菌的主要致病因子，毒素会导致植物产生纹枯病的症状。从立枯丝核菌提取的毒素被认为是对植物组织有损害作用的化合物。aoki等从甜菜中分离到2个立枯丝核菌菌株，然后用马铃薯蔗糖液体培养基或改良的richard培养液对分离到的菌株进行离体培养，从它们的代谢物共分离和鉴定出了苯乙酸(phenylaceticacid)、间羟基苯乙酸(m-hydroxyphenylaceticacid)、β-呋喃甲酸(β-furoicacid)、丁二酸(succinicacid)、乳酸(lacticacid)5种成分。其中间羟基苯乙酸(m-hydroxyphenylaceticacid)在0.025％以上的浓度下能抑制甜菜根的生长，0.1％以上的浓度能产生坏死斑。合成的邻羟基苯乙酸(o-hydroxyphenylaceticacid)经测定可以产生与间羟基苯乙酸(m-hydroxyphenylaceticacid)相同的作用。他们同时从侵染的甜菜根部组织中分离这几种酸，分别为苯乙酸(phenylaceticacid)、vanillicacid(香草酸)、呋喃甲酸(furoicacid)，但未分离出间羟基苯乙酸(m-hydroxyphenylaceticacid)。因此，他们认为，立枯丝核菌先产生苯乙酸(phenylaceticacid)，接着通过代谢作用形成羟基衍生物，而这些化合物对立枯丝核菌致病过程中有共同作用。此外，mandava等从大豆上分离出了ag-iv融合群的立枯丝核菌菌株，并用这个菌株进行液体培养，分离出一种化合物，鉴定为间羟基间甲氧基苯乙酸(m-hydroxy-andm-methoxyphenylaceticacid)。这种毒素和其他苯乙酸衍生物与生长调控有关，他们通过实验证明这种间羟基苯乙酸(m-hydroxyphenylaceticacid)具有寄主专化性，只在侵染大豆的ag-iv融合群的菌株中有活性。此外，他们还首创了高效液相色谱法来检测苯乙酸及其衍生物数量的一种方法。vidhyasekaran等从水稻纹枯病菌中分离出了一种寄主专化性毒素，纯化并分析为含有葡萄糖、甘露糖、n-乙酰半乳糖胺和n-乙酰基葡萄糖的碳水化合物。
目前对于水稻纹枯病菌粗毒素的成分鉴定研究还处于初始阶段，各种组分结构并不统一。本发明即针对此疑难问题，首次使用乙醚溶解样品对水稻纹枯病菌粗毒素的成分进行了气相色谱分析，从而为进一步深入研究和鉴定水稻纹枯病菌粗毒素提供了有益的探索和翔实的数据，为今后水稻纹枯病抗病遗传育种打下了坚实的基础。
技术实现要素：
本发明提供了一种水稻纹枯病菌粗毒素鉴定方法。
技术问题本发明的目的是针对目前对于水稻纹枯病菌粗毒素的研究处于初始阶段，各种组分结构并不统一的现状，提供一种水稻纹枯病菌粗毒素鉴定方法。
技术方案本发明所提供的一种水稻纹枯病菌粗毒素鉴定方法是通过以下步骤完成：
1)菌种的转接及培养
把保存于pda固体斜面培养基上的水稻纹枯病菌转接到pda固体培养基上，并置于设置温度为28℃恒温培养箱中培养72h。把转接好的水稻纹枯病菌挑2块菌丝接种到20ml液体pda培养液中，置于摇床上振荡培养约4-7d，温度为28℃，直至长出大量菌丝又不产生褐色菌核。
2)粗毒素的提取
把获得的菌培养液进行过滤，得到的滤液分别在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，接着再加入等量体积甲醇。静置2h后，以4500r/min在离心机中进行离心去沉淀，然后60℃旋转蒸发去甲醇。将获得的水相加入等体积的乙醚进行萃取，重复3次，合并3次的乙醚萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除乙醚，获得的浆状物加水定容至1ml即为粗毒素。
3)粗毒素的致病性鉴定
取水稻品种为金刚30的水稻叶片，在叶片同一部位剪掉尖端组织和叶基部，保留叶中部(4cm～5cm)的组织，放入铺有三层滤纸(直径90mm)的培养皿中，加入15ml灭菌蒸馏水保湿，在叶片上用牙签刺形成伤口，加5μl粗毒素，以空白培养基为对照，置于光照培养箱中，温度为28℃，设置光照黑暗各12h，每个处理重复3次，7d后观察病斑。
4)粗毒素的组分鉴定
将提取出的粗毒素溶于无水乙醚中，定溶至1ml。提取物用气质联用仪进行结构分析。气相色谱条件：色谱柱为tg-5ms(30mm×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱；载气为高纯氦气(纯度99.999％)；载气流速为1ml/min；采用不分流进样；进样口温度为280℃；程序升温：初始温度32℃保持1min，然后以10℃/min升到280℃，保持3min。
质谱条件：离子源为ei源，传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；电子能量：70ev；扫描范围(m/z)：33-800amu，采用全扫描采集模式。
附图说明
图1为水稻纹枯病菌在pda平板培养基上菌落形态图：
图2为水稻纹枯病菌粗毒素在水稻叶片上的致病性鉴定：
图3为水稻纹枯病菌粗毒素气质联用图。
具体实施方式
1)菌种的转接及培养
把保存于pda固体斜面培养基上的水稻纹枯病菌转接到pda固体培养基上，并置于设置温度为28℃恒温培养箱中培养96h。培养结果如图1。可以观察到病菌先形成白色菌核，后变成深褐色，直至黑褐色，且结构越来越致密。把转接好的水稻纹枯病菌挑2块菌丝接种到20ml液体pda培养液中，置于摇床上振荡培养约7d，温度为31℃，直至长出大量菌丝又不产生褐色菌核。
2)粗毒素的提取
将水稻纹枯病菌的培养液用单层滤纸过滤后，得到的滤液分别在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，接着再加入等量体积甲醇。静置2h后，以4500r/min在离心机中进行离心去沉淀，然后60℃旋转蒸发去甲醇。将获得的水相加入等体积的乙醚进行萃取，重复3次，合并3次的乙醚萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除乙醚，获得的浆状物加水定容至1ml即为粗毒素。
3)粗毒素的致病性鉴定
将上述提取的粗毒素，滴加5μl在金刚30的水稻叶片伤口，4-7d后观察。从图2可以看出，病菌粗毒素对水稻叶片有致病力，叶片接种后均产生暗绿色水浸状边缘和模糊小斑，后渐扩大呈椭圆形或云纹形，边缘褪黄的症状。其致病力较强，在第六天时可产生大量病斑且产生的病斑较大。
4)粗毒素的组分鉴定
将提取出的粗毒素溶于无水乙醚中，定容至1ml。提取物用气质联用仪进行结构分析。获得了样品的总离子图(图3)。通过质谱分析，从质谱图数据库中进行检索，查询比对得到22种成分。样品中主要吸收峰的成分有下列几种，包括醇类，酯类，酸类，醛类，烷烃类和酮类等。有四个较高浓度的组分分别为2-乙氧基-丙烷，顺-2，3-二甲基-环氧乙烷与乙酸，5，9-二甲基-1-癸醇，7，9-二叔丁基-1-氧杂螺(4，5)癸-6，9-二烯-2，8-二酮，该组合成分可作为鉴定水稻纹枯病菌粗毒素特征物质。
本发明用乙醚对水稻纹枯病菌粗毒素进行提取，并首次在气相色谱分析时采用乙醚做溶剂对粗毒素进行了物质组分分析。结果表明，用该方法提取的水稻纹枯病菌粗毒素可引起水稻病斑产生，表明其具有生物活性。其组成成分鉴定结果也为首次报道。这为今后研究水稻纹枯病菌粗毒素提供了较为可靠简便的方法。同时，粗毒素组成成分的鉴定也为进一步研究其致病机理打下了坚实的基础，为今后植物抗病育种的研究提供了理论指导。