本发明属于蛋白药物生产领域，具体涉及一种重组乙肝表面抗原的生产方法。
背景技术：
据世界卫生组织报道，全球约20亿人感染hbv，每年约有65万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。20亿感染者中，约2.4亿人为慢性hbv感染，中国约占1/3(引自《世界卫生组织乙肝预防治疗指南》2015年版)。目前尚无特效药物用于治疗乙肝和hbv携带者，研制并应用乙肝疫苗来预防乙肝和治疗hbv携带者及乙肝病人有着重大意义。由于存在携带hiv等病毒及产量有限等问题，第一代血源性乙肝疫苗采用无症状乙肝病毒携带者血浆为原料，已经被世界卫生组织取缔，取而代之的是重组乙肝疫苗。目前在国内外流通的重组乙肝疫苗主要由中华地鼠卵巢细胞(cho)、酿酒酵母菌、毕赤酵母菌及汉逊酵母菌作为生产宿主细胞生产。由于酵母菌来源的细胞具有高表达量、低成本等优势，目前在疫苗市场上已取得主导地位。
与酿酒酵母菌相比，甲醇营养型的汉逊酵母表现出更高的表达量，没有过度糖基化的现象，并且能够耐受高温，最佳生长温度为37℃-43℃(reindersetal.1999)。外源基因的整合多为非同源重组整合(约占50％～80％)，但在质粒载体转化汉逊酵母菌的早期，质粒载体以附加体(episome)的形式存在，且拷贝数较低(gellissenetal.2000)。必要的加压筛选步骤既能够增加拷贝数，又能增加质粒载体整合进入基因组的稳定性，更容易筛选到高拷贝、高蛋白表达菌株，且遗传稳定性更高。
在汉逊酵母发酵过程中，甲醇代谢第一步的酶为甲醇氧化酶(methanoloxidase)，其编码基因为mox，该基因的缺失会造成甲醇氧化酶减少，甲醇利用率下降。目前，表达载体中的mox启动子和终止子序列多来源于汉逊酵母，序列相似度较高时容易造成同源重组替换掉mox基因，从而抑制了菌体生长和外源蛋白表达。
汉逊酵母能够用廉价的培养基进行高密度发酵，因此适于大规模发酵生产目的蛋白，能以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，甲醇代谢途径的关键酶mox、fmd和dhas的表达受阻遏/解阻遏机制的调控(gellissenetal.2000)。高浓度的葡萄糖和甘油阻遏能够阻遏基因表达，甲醇、低浓度的甘油(0.3％)和葡萄糖(0.1％)能解阻遏。但过高的甲醇浓度也会导致反馈抑制，抑制外源蛋白的表达，发酵过程中的甲醇浓度准确控制，既能够增加外源蛋白的表达，同时能够增加工业生产过程中的批次间稳定性。
现有的各种酵母来源的重组乙肝表面抗原均属于胞内表达，生产厂家的纯化工艺各有不同，主流纯化工艺中包括疏水层析等步骤，其主要原理是利用乙肝表面抗原富含脂质，疏水性质强的特点，但抗原在与层析填料吸附/解吸附的过程中可能会造成一定程度的vlp结构改变，导致纯化工艺不稳定，收率偏低。
技术实现要素：
本发明的一个目的是克服现有技术中已知的重组乙肝表面抗原的生产缺陷，提供一种高密度发酵重组乙肝表面抗原的方法，该方法包括如下步骤：
i)筛选乙肝表面抗原高拷贝、高蛋白表达的重组汉逊酵母菌株，包括以下步骤：
1)构建用于表达重组乙肝表面抗原的载体，表面抗原氨基酸序列如seqidno:1所示；优选地，表面抗原的编码核酸序列如seqidno:2所示；
2)将步骤1)构建的载体转化入ura3营养缺陷型汉逊酵母菌株中，并在质粒转化的早期使用ura3基因突变互补和g418抗生素进行双向加压筛选，能够提高外源基因拷贝数和基因组整合稳定性，更容易筛选到高拷贝、高蛋白表达菌株，且遗传稳定性更更高；
ii)高密度发酵生产重组乙肝表面抗原，包括如下步骤：
1)甘油流加阶段，控制甘油流加速率在2g/min～10g/min，保持较低的甘油浓度既能满足菌体生物量的增长，也能够解阻遏mox启动子，使得代谢相关的酶类得到表达；
2)甲醇诱导阶段，通过甲醇电极将甲醇浓度维持在5.0±0.5g/l～8.0±0.5g/l范围内波动，能够防止甲醇过量导致的反馈抑制，同时防止甲醇浓度不足导致的蛋白表达量过低；
3)甲醇诱导时间控制在40-60小时，既能增加抗原表达量，同时减少多聚体的产生，增加抗原的稳定性。
其中，所述载体的外源基因表达框使用的mox启动子序列、aox1终止子序列、ars(自主复制序列)在宿主表达细胞中(atcc26012)无完全相同序列，表达载体上的“mox启动子-外源基因-aox终止子”表达框能有效降低对宿主细胞当中的“mox启动子-mox基因-mox终止子”进行同源替换的可能性，从而降低mox基因被外源基因插入破坏的概率。
其中，在所述甘油流加阶段之前还包甘油初培养阶段，所述甘油初培养阶段使用bsm无机盐培养基，调整ph至5.0，温度37℃，通气量15.0～35.0l/min，控制溶氧在40％以上，罐压保持在0.5bar左右；所述bsm无机盐包含:0.90g/lcaso4.2h2o、11.67g/lmgso4.7h2o、14.67g/lk2so4、9.00g/l(nh4)2so4、50g/l甘油和25.05g/l六偏磷酸钠。
其中，在所述甘油初培养阶段之前还包括将所述重组汉逊酵母菌株制成种子液的步骤。
其中，在所述甘油流加阶段中，当溶氧快速上升时，表明发酵液中的碳源耗尽，开始补加甘油，甘油流加速率为2.0g/min～10.0g/min，当湿菌重升至250～300g/l，停止甘油流加，待溶氧再次快速上升时，饥饿半小时后，开始甲醇诱导。
其中，在所述甲醇诱导阶段中，调整ph至5.0，温度30℃，通气量15.0～35.0l/min，控制溶氧在20％以上，罐压保持在0.5bar左右，甲醇浓度控制在5.0±0.5g/l～8.0±0.5g/l，优选地，甲醇浓度控制在4.5-8.3g/l，更优选地，甲醇浓度控制在4.6-5.8g/l；最优选地，甲醇浓度控制在5.0-6.5g/l。
本发明的另一目的是提供一种用于分离纯化重组乙肝表面抗原的方法，该方法包括如下步骤：
1)菌体破碎：取发酵得到的含有重组乙肝表面抗原的汉逊酵母菌体，用25～100mm，ph8.0的磷酸盐缓冲液重悬，向悬液中加入终浓度2～5mm的edta、0.3～0.7％的tween20及2～5mm的苯甲基磺酰氟(pmsf)，使用高压匀浆机破碎细胞，得匀浆液；
2)澄清：向所述匀浆液中加入终浓度为0.1～0.5m的nacl及终浓度3～7％的聚乙二醇6000(peg6000)进行澄清，得澄清后的上清液；
3)硅胶吸附/解吸附：将所述上清液经硅胶吸附/解吸附以去除大部分宿主杂质；
4)离子交换层析：将经硅胶吸附/解吸附所得的洗脱液经离子交换层析后得以进一步去除宿主核酸和杂蛋白,所述离子交换层析为sepharosedeaeff、sepharoseqff或captoq；
5)超滤浓缩：将经离子交换层析的洗脱液进行超滤浓缩，得浓缩液；
6)超速离心：将经超滤浓缩获得的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心，得到颗粒密度更加均一的抗原成分，并获得离心液；
7)分子筛层析：将经超速离心获得的离心液进行分子筛层析，所述分子筛层析树脂为sepharose4ff，所得洗脱液即为抗原原液。
其中，在所述硅胶吸附/解吸附步骤中，用25mm，ph7.2的磷酸盐缓冲液洗涤硅胶沉淀至3次，最终用50mm，ph10.8的碳酸盐缓冲液进行洗脱。
其中，在所述离子交换层析步骤中，洗脱液为含有500mmnacl，ph为8.0的缓冲液。
其中，在所述超滤步骤中，超滤系统进端压力保持在10～30psi，回流段压力保持在2～7psi，跨膜压(transmembranepressure，tmp)控制在5～15psi。
其中，在所述超速离心步骤中，所用介质为溴化钾，密度范围为1.05g/ml到1.30g/ml，离心转速控制在20000rpm-30000rpm，离心时间控制在15-25h，离心温度控制在4-25℃。
其中，在所述分子筛层析步骤中，样品进样体积为柱体积的2％～5％，洗脱液为含有150mmnacl，ph为7.2的磷酸盐缓冲液，收集色谱峰中对应的病毒样颗粒(virus-likeparticles，vlp)组分即为原液。
对最终样品进行sds-page高效分子排阻色谱(hplc-sec，tskg5000pw色谱柱，300mm×7.8mm)分析。实验结果如图5所示，本发明表达和纯化后的产品杂蛋白含量极低，重组乙肝表面抗原纯度达到99％以上。结果显示，上述最终产品能够形成结构稳定、均一的vlp，结构如图6-7所示。
使用本发明的汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原的生产方法获得的菌株拷贝数高、遗传稳定；高密度发酵后酵母细胞仅需要破碎、澄清、硅胶吸附/解吸附、离子交换、超滤浓缩、超速离心和分子筛层析，即可获得高纯度、高回收率的重组乙肝表面抗原，且工艺周期短、抗原纯度高、颗粒均一，质量稳定。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中的表达载体pmaur(s.c)kars1图谱；
图2为实施例1中的重组乙肝表面抗原表达载体pmaur(s.c)kars1-hbsag图谱；
图3为实施例3中的发酵诱导不同时间抗原表达量及多聚体产生情况分析；
图4为实施例4纯化后抗原的sds-page图谱；
图5为实施例4纯化后抗原的sec-hplc图谱；
图6为实施例4纯化后抗原的透射电镜图谱；
图7为实施例4纯化后抗原dls样品检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1表达载体pmaur(s.c)kars1的构建
载体构建过程中涉及引物序列如下：
1)pcr扩增获取甲醇氧化酶基因mox启动子序列
使用酵母基因组提取试剂盒提取汉逊酵母(atcc14754)基因组dna，以此基因组dna为模板，用引物1和引物2进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物1，1.5μl引物2，1μl模板，33μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约1500bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blunt-moxpromoter并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
2)pcr扩增获取ptfe1+pem7启动子序列
以ppic6a载体为模板，用引物3和引物4进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物3，1.5μl引物4，1μl模板，33μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约480bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blunt-ptfe1-pem7并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
3)pcr扩增获取kanamycin抗性基因序列
以ppic9k载体为模板，用引物5和引物6进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物5，1.5μl引物6，1μl模板，33μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约820bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blunt-kanamycin并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
4)pcr扩增获取ptfe1+pem7+kanamycin序列
以上述步骤2)和3)的测序正确质粒为模板，用引物3和引物6进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物3，1.5μl引物6，两种模板各1μl，32μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约1300bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blunt-ptfe1-pem7-kanamycin并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
5)pcr扩增获取cyc1tt+pucori序列
以ppic6a载体为模板，用引物7和引物8进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物7，1.5μl引物8，1μl模板，33μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约1000bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blunt-cyc1tt-pucori并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
6)pcr扩增获取ars序列
使用酵母基因组提取试剂盒提取汉逊酵母(atcc34438)基因组dna，以此基因组dna为模板，用引物9和引物10进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物9，1.5μl引物10，1μl模板，33μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约500bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blunt-ars并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
7)pcr扩增获取cyc1tt+pucori+ars序列
以上述步骤5)和6)中测序正确的质粒为模板，用引物7和引物10进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物7，1.5μl引物10，两种模板各1μl，32μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约500bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blunt-cyc1tt-pucori-ars并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
8)ura3orf序列的pcr扩增
以yep24质粒为模板，用引物11和引物12进行pcr反应，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物11，1.5μl引物12，模板各1μl，33μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃1.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约1200bp，回收后产物连接peasy-blunt载体，获得载体peasy-blun-ura3并转化top10感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆并进行测序，经测序正确的克隆，提取质粒以备后续实验使用。
9)从ppic6a载体出发，用draiii和bamhi分步酶切，回收载体骨架片段约2500bp。将上述步骤4)中测序正确的载体同时用draiii和bamhi分布酶切，在t4-dna连接酶的作用下，将步骤4)获得的ptef1+pem7+kanamycin序列与载体骨架进行连接，获得载体ppic6a-kana并转化top10感受态细胞，涂含有kana抗性的lb平板，对阳性克隆进行菌落pcr鉴定，并提取质粒备用。
10)将上述步骤9)获得的载体ppic6a-kana用bglii和draiii分别酶切，回收载体骨架片段约2700bp。将上述步骤7)中测序正确的载体peasy-blunt-cyc1tt-pucori-ars同时用bglii和draiii分别酶切，在t4-dna连接酶的作用下，将cyctt-pucori-ars序列与载体骨架进行连接，获得载体ppic6akars1并转化top10感受态细胞，涂含有kana抗性的lb平板，对阳性克隆进行菌落pcr鉴定，并提取质粒备用。
11)将上述步骤10)获得的载体ppic6akars1用bglii和ecori酶切，回收载体骨架片段。将上述步骤1)中测序正确的载体peasy-blunt-moxpromoter同时用bglii和ecori酶切，在t4-dna连接酶的作用下，将mox启动子序列与载体骨架进行连接，获得载体pmoxkars1并转化top10感受态细胞，涂含有kana抗性的lb平板，对阳性克隆进行菌落pcr鉴定，并提取质粒备用。
12)将上述步骤11)获得的载体pmoxkars1用bamhi酶切，并用caip去磷酸化，回收载体骨架片段。将上述步骤8中测序正确的载体同时用bamhi和bglii酶切，在t4-dna连接酶的作用下，将ura3orf序列与载体骨架进行连接，获得载体pmaur(s.c)kars1(图1)并转化top10感受态细胞，涂含有kana抗性的lb平板，对阳性克隆进行菌落pcr鉴定，并提取质粒备用，至此pmaur(s.c)kars1构建完成。
13)重组表达乙肝表面载体的构建
从genbank上调取乙肝表面抗原(hbsag)氨基酸序列seqidno:1，按照汉逊酵母密码子偏好性，由苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成，得到序列其编码基因序列：seqidno:2。
引物13：5’-gaattcgacatggagaacatcacct-3’(seqidno:15)
引物14：5’-gcggccgcttagatgtacacccacaggcaga-3’(seqidno:16)
以金唯智合成乙肝表面抗原(hbsag)基因序列为模板，用引物13和引物14进行pcr反应，划线部分分别为ecori和noti酶切位点，具体反应条件为：50μl反应体系，包含1μl的kod-plus聚合酶，5μl10×buffer，5μldntp，2μl25mmmgso4，1.5μl引物13，1.5μl引物14，1μl模板，33μlddh2o。用bio-rad的pcr仪进行反应，反应条件为：94℃2分钟，循环1次；94℃15秒，55℃1分钟，68℃0.5分钟，共35个循环；68℃1分钟，循环1次。将pcr产物回收并纯化，目的片段约700bp，回收后产物用ecori和noti双酶切，将表达载体pmaur(s.c)kars1用ecori和noti双酶切。回收载体骨架片段和pcr产物片段。在t4-dna连接酶的作用下，将hbsag序列与载体骨架进行连接，并转化top10感受态细胞，涂含有kana抗性的lb平板，对阳性克隆进行菌落pcr鉴定、测序正确的阳性克隆命名为pmaur(s.c)kars1-hbsag，并用qiagen质粒大量提取试剂盒提取质粒备用，构建完成的载体图谱见图2。
实施例2重组乙肝表面抗原汉逊酵母高表达菌株筛选
1)重组表达乙肝表面载体的转化与筛选
感受态细胞制备：挑ura3营养缺陷型汉逊酵母菌株单克隆于10mlypd培养基中37℃培养过夜。取2ml培养物，接种至含100mlypd培养基的摇瓶，37℃培养至od600＝1.3～1.5。4℃，3000g离心10min收集细胞，用0.2倍体积预冷的50mm磷酸盐缓冲液悬浮细胞，37℃孵育15min。如上离心，用1倍体积预冷的stm缓冲液悬浮清洗细胞。如上离心，用0.5倍体积的预冷的stm缓冲液悬浮清洗细胞。如上离心，用0.005倍体积的预冷的stm缓冲液悬浮细胞，至终体积约0.4ml。
电转化条件设置：取100μl上述细胞与10-20μg线性化pmaur(s.c)kars1-hbsag质粒混合，转入预冷的2mm电转杯中。同时设置阴性对照组：只取100μl上述细胞转入预冷的2mm电转杯中。在冰上放置5min。设置电极参数：1.5kv，50uf，150ω，进行电转。电转后立即加入1ml预冷的ypd至电转杯中，将悬浮液转移至灭菌离心管中。于37℃培养箱中静置培养1小时。取菌悬液涂布md平板，于37℃倒置培养3-5天；选取在md平板上生长较大的克隆进行混库，用灭菌蒸馏水重悬后涂布md+g418(g418浓度为0.5～2.0mg/ml)平板，于37℃倒置培养3-5天，进行加压筛选，挑选阳性菌落进行pcr鉴定。利用ura3基因突变互补和g418抗生素进行双向加压筛选，提高外源基因拷贝数和基因组整合稳定性，更容易筛选到高拷贝、高蛋白表达菌株，且遗传稳定性更高；
2)重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原高表达菌株筛选
重组蛋白表达量与往往与外源基因拷贝数存在正相关性，拷贝数越高，外源蛋白的产量也越高，从而提高下游工艺的产量，降低生产成本。在通过菌落pcr获得电转化阳性克隆之后，采用斑点杂交的方法对不同批次电转化阳性克隆的hbsag外源基因拷贝数作了检测，以hbsag高拷贝作为克隆初筛条件。
实施例3汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原50l生物反应器发酵
1)一级种子液制备：取一支上述重组汉逊酵母甘油菌液(1.5ml/管)接种至200mlypg培养基，所述ypg培养基包含：20.00g/l甘油、10.00g/l酵母提取物、20.00g/l大豆胨。调整转速至220rpm、37℃培养12小时；待od600达到10～15小时，将其作为一级种子液；
2)二级种子液制备：将上述一级种子液接种于2.0lbsm无机盐培养基中，所述bsm无机盐包含:0.90g/lcaso4.2h2o、11.67g/lmgso4.7h2o、14.67g/lk2so4、9.00g/l(nh4)2so4、50g/l甘油和25.05g/l六偏磷酸钠。每升bsm中添加2mlptm1微量元素，ptm1配方包含：6.00g/lcuso4.5h2o、3.00g/lmnso4.h2o、0.02g/lh3bo3、20.00g/lzncl2、0.80g/lki、0.20g/lna2mno4.2h2o、0.27g/lcocl2.6h2o、35.37g/lfeso4.7h2o、10ml/lh2so4、0.50g/lcaso4.2h2o、3.50g/lmgso4.7h2o、0.20g/lbiotin。调整培养基至ph5.0，温度为37℃，通气量4.0l/min，培养时间8～12小时，待od600达到10～15时，将其作为二级种子液；
3)甘油初培养阶段：将上述培养液转接于20lbsm无机盐培养基的50l生物反应器中，所述bsm培养基成分同上，调整ph至5.0，温度37℃，通气量15.0～35.0l/min。通过调节转速、通气量或者氧气比例的方式控制溶氧在40％以上，罐压保持在0.5bar左右；
4)甘油流加阶段：当溶氧快速上升时，表明发酵液中的碳源耗尽，开始补加甘油，甘油流加速率为2.0g/min～10.0g/min，当湿菌重升至250～300g/l，停止甘油流加，待溶氧再次快速上升时，饥饿半小时后，开始甲醇诱导；
5)甲醇诱导阶段：调整ph至5.0，温度30℃，通气量15.0～35.0l/min。通过调节转速、通气量或者氧气比例的方式控制溶氧在20％以上，罐压保持在0.5bar左右；甲醇作为碳源和诱导剂，其含量直接决定着外源蛋白表达量，过量甲醇会直接导致反馈抑制，而甲醇浓度不足导致的蛋白表达量过低，通过电极在线监测，分析一系列甲醇浓度下重组乙肝表面抗原表达量，考虑到工艺稳定性，确定甲醇浓度调控范围控制在5.0±0.5g/l～8.0±0.5g/l，优选在4.5-8.3g/l范围内波动，更优选在4.6-5.8g/l范围内波动，最优选在5.0-6.5g/l范围内波动时抗原表达量最高，各条件下抗原蛋白表达量见表2。
表2：汉逊酵母hbsag表达量与甲醇浓度的关系
6)诱导时间：前期研究发现发酵过程中重组乙肝表面抗原会形成多聚体，该部分抗原稳定性较差，工艺过程在需要对多聚体加以控制和去除。甲醇诱导后每隔一定时间取样，通过分析抗原表达量和多聚体产生情况(图3)，确定诱导40～60小时停止培养，收集酵母细胞；
表达量测定：采用elisa方法测定乙肝表面抗原表达量(elisa试剂盒，上海科华生物)，详细操作步骤参见厂家说明书，50l生物反应器发酵三批数据见表3。
表3：50l生物反应器发酵三批数据
由表3可见，通过控制甲醇浓度范围，fs20170602、fs20170806和fs20171109这三批50l发酵的表达量都比较高，且工艺相对稳定，批次间差异小，易于控制。
实施例4重组乙肝表面抗原(汉逊酵母)的纯化1
1)菌体破碎
取上述发酵后的菌体200g，用50mm，ph8.0的磷酸盐缓冲液重悬，固含量维持在20％，向菌悬液中加入终浓度5mm的edta、0.3％的tween20及2mm的pmsf，使用高压匀浆机1200bar反复破菌5次，至细胞破碎率达到80～90％；
2)澄清
向上述匀浆液中加入终浓度为0.5m的nacl及终浓度5％的peg6000，充分搅拌后于2-8℃静置16小时；7,500g离心30min去除沉淀。
3)硅胶吸附
将上述离心上清液加入到膨胀后的硅胶当中，2～8℃搅拌6小时，然后7500g，离心5min去除上清液。用25mm，ph7.2的磷酸盐缓冲液洗涤硅胶沉淀至3次。最终用50mm，ph10.8的碳酸盐缓冲液进行洗脱。
4)离子交换层析
用盐酸将上述洗脱液ph调至8.0，经0.22μm滤器过滤后进行sepharosedeaeff离子交换层析，按照树脂生产厂家推荐的平衡、进样、淋洗、洗脱和再生步骤完成离子交换过程，其洗脱液为含有500mmnacl，ph为8.0的缓冲液。
5)超滤浓缩
将上述洗脱液用截留分子量为300kda膜包进行浓缩，膜包材质为聚醚砜或再生纤维素。超滤系统进端压力保持在10～30psi，回流段压力保持在2～7psi，tmp控制在5～15psi，获得浓缩液。
6)超速离心
将上述经过浓缩的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心，密度范围为1.05g/ml到1.30g/ml，离心转速为28000rpm，离心温度为25℃，离心时间20h，获得离心液。
7)分子筛层析
将上述经过超速离心的离心液进行分子筛层析，所述的分子筛层析树脂为sepharose4ff，样品进样体积为柱体积的2％～5％，洗脱液为含有150mmnacl，ph为7.2的磷酸盐缓冲液，收集色谱峰中对应的vlp组分即为原液。
实施例5重组乙肝表面抗原(汉逊酵母)的纯化2
1)菌体破碎
取上述发酵后的菌体200g，用50mm，ph8.0的磷酸盐缓冲液重悬，固含量维持在20％，向菌悬液中加入终浓度5mm的edta、0.5％的tween20及2mm的pmsf，使用高压匀浆机1200bar反复破菌5次，至细胞破碎率达到80～90％。
2)澄清
向上述匀浆液中加入终浓度为0.5m的nacl及终浓度7％的peg6000，充分搅拌后于2-8℃静置16小时；7,500g离心30min去除沉淀。
3)硅胶吸附
将上述离心上清液加入到膨胀后的硅胶当中，2～8℃搅拌6小时，然后7500g，离心5min去除上清液。用25mm，ph7.2的磷酸盐缓冲液洗涤硅胶沉淀至3次。最终用50mm，ph10.8的碳酸盐缓冲液进行洗脱。
4)离子交换层析
用盐酸将上述洗脱液ph调至8.0，经0.22μm滤器过滤后进行离子交换层析，所述的离子交换层析树脂为sepharoseqff，按照树脂生产厂家推荐的平衡、进样、淋洗、洗脱和再生步骤完成离子交换过程，其洗脱液为含有500mmnacl，ph为8.0的缓冲液。
5)超滤浓缩
将上述洗脱液用截留分子量为100kda膜包进行浓缩，膜包材质为聚醚砜或再生纤维素。超滤系统进端压力保持在10～30psi，回流段压力保持在2～7psi，tmp控制在5～15psi，获得浓缩液。
6)超速离心
将上述经过浓缩的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心，密度范围为1.05g/ml到1.30g/ml，离心转速为25000rpm，离心温度为25℃，离心时间20h，获得离心液。
7)分子筛层析
将上述经过超速离心的离心液进行分子筛层析，所述的分子筛层析树脂可以为sepharose4ff，样品进样体积为柱体积的2％～5％，洗脱液为含有150mmnacl，ph为7.2的磷酸盐缓冲液，收集色谱峰中对应的vlp组分即为原液。
实施例6重组乙肝表面抗原(汉逊酵母)的纯化3
1)菌体破碎
取上述发酵后的菌体200g，用25mm，ph8.0的磷酸盐缓冲液重悬，固含量维持在20％，向菌悬液中加入终浓度5mm的edta、1.0％的tween20及2mm的pmsf，使用高压匀浆机1200bar反复破菌6次，至细胞破碎率达到80～90％。
2)澄清
向上述匀浆液中加入终浓度为0.5m的nacl及终浓度5％的peg6000，充分搅拌后于2-8℃静置16小时；7,500g离心30min去除沉淀。
3)硅胶吸附
将上述离心上清液加入到膨胀后的硅胶当中，2～8℃搅拌4小时，然后7500g，离心5min去除上清液。用25mm，ph7.2的磷酸盐缓冲液洗涤硅胶沉淀至3次。最终用50mm，ph10.8的碳酸盐缓冲液进行洗脱。
4)离子交换层析
用盐酸将上述洗脱液ph调至8.0，经0.22μm滤器过滤后进行离子交换层析，所述的离子交换层析树脂为captoq，按照树脂生产厂家推荐的平衡、进样、淋洗、洗脱和再生步骤完成离子交换过程，其洗脱液为含有300mmnacl，ph为8.0的缓冲液。
5)超滤浓缩
将上述洗脱液用截留分子量为500kda膜包进行浓缩，膜包材质为聚醚砜或再生纤维素。超滤系统进端压力保持在10～30psi，回流段压力保持在2～7psi，tmp控制在5～15psi，获得浓缩液。
6)超速离心
将上述经过浓缩的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心，密度范围为1.05g/ml到1.30g/ml，离心转速为25000rpm，离心温度为4℃，离心时间25h，获得离心液。
7)分子筛层析
将上述经过超速离心的离心液进行分子筛层析，所述的分子筛层析树脂可以为sepharose4ff，样品进样体积为柱体积的2％～5％，洗脱液为含有150mmnacl，ph为7.2的磷酸盐缓冲液，收集色谱峰中对应的vlp组分即为原液。
实施例7重组乙肝表面抗原(汉逊酵母)的纯度及颗粒性质分析
1)sds-page电泳及sec-hplc检测
对实施例4纯化得到的汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原进行sds-page电泳分析，如图4所示，sds-page电泳灰度分析抗原纯度≥95％。对最终样品进行高效分子排阻色谱(sec-hplc，tskg5000pw色谱柱，300mm×7.8mm)分析，本发明表达和纯化后的产品杂蛋白含量极低，重组乙肝表面抗原纯度达到99％以上(图5)。
2)颗粒性质分析
对实施例4纯化得到的汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原进行tem透射电镜(hitachi,ht7700)分析，如图6所示，乙肝表面抗原能够形成颗粒均一的病毒样颗粒。动态光散射分析(dynamiclightscattering，dls)分析显示重组乙肝表面抗原病毒样颗粒均一(图7)。
序列表
<110>南京赛威信生物医药有限公司
<120>重组乙肝表面抗原的生产方法
<130>dic17110104
<160>16
<170>siposequencelisting1.0
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<213>乙肝病毒(hepatitisbvirus)
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