本发明涉及一种利用菜籽粕固态发酵制备环脂肽的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
我国是世界上最大的菜籽粕生产国，2011年我国菜籽粕产量为895万吨，占全球菜籽粕总产量的25％。菜籽粕粗蛋白含量为35％～45％，氨基酸组成合理，是一种较为优良而廉价的蛋白质资源。与豆粕相比，菜籽粕含有较高的胆碱、生物素、烟酸、维生素b和丰富的矿物元素。但菜籽粕含有的硫葡萄糖甙(硫甙)、芥子碱、植酸、单宁等抗营养因子，会影响动物的适口性或生长发育，限制了菜籽粕在食品及饲料行业中的应用，造成资源的极大浪费。
利用微生物发酵菜籽粕制备具有一定生理功能的活性肽是有效利用菜籽粕的方法之一。自1968年arima等首次发现枯草芽抱杆菌能够产生抗菌脂肽以来，抗菌脂肽由于高效、广谱、安全无毒、不易产生耐药性、可被生物降解等特性而倍受食品、医药、饲料、化妆品和环境治理等相关行业的关注。抗菌脂肽分子由脂肪酸链和肽链两部分组成并结合成环状，是具有两亲性的生物表面活性剂。因此，将环脂肽添加到食品中可有效改善食品的口感及品质，并能相应地降低食品中化学防腐剂及稳定剂的使用量，促使食品工业健康持续发展。还可将抗菌环脂肽作为饲料添加剂用于饲料生产，降低抗生素的使用量，保障肉制品的食品安全，促使我国的养殖业向着健康方向发展。
利用微生物发酵菜籽粕生产环脂肽具有周期短，生产成本低，且不受季节和气候变化等外在环境影响的特点，可实现工业化生产。另外，将菜籽粕制备成环脂肽，可有效延长油脂加工的产业链，带动地区经济发展，提高国民健康水平。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用菜籽粕固态发酵制备环脂肽的方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种利用菜籽粕固态发酵制备环脂肽的方法，按照下述步骤进行：
(1)将甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)用种子培养基扩大培养，培养基的组成如下：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，nacl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0；按照体积比为2～5％的比例接种活化后的菌种，在25～32℃，180rpm条件下培养10小时制得甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)种子液。
(2)甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)固态发酵菜籽粕：菜籽粕5～25g，分别加入占菜籽粕质量比为5～15％的废糖蜜及占菜籽粕质量比为10％的无机盐溶液，然后加入与菜籽粕质量体积比为1:1的水。按照菜籽粕质量体积比为2～10％(v/w)的比例接入步骤(1)中扩大培养后的种子液，于25～32℃发酵24～48h。
(3)发酵结束后，添加菜籽粕质量的5～15倍的去离子水进行浸泡，并逐步添加6mol/l氢氧化钠，将浸提液ph调节至8.0，离心除去菌体，收集上清液。在上清液中缓慢加入6mol/l盐酸，调节ph至2.0，静置30min后离心，收集沉淀。沉淀用0.1mol/lnano3洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，离心收集沉淀。冷冻干燥，制得环脂肽成品。
其中步骤(2)所述的无机盐溶液组成：mgso40.5g/l，kcl0.77g/l，kh2po41.0g/l，feso40.05mg/l，mnso45.0mg/l，cuso40.16mg/l，ph7.0。
本发明的优点：
1、环脂肽具有良好的起泡性，本发明采用菜籽粕固态发酵制备环脂肽，能够避免液态发酵菜籽粕制备环脂肽过程中产生的泡沫膨胀溢出而造成的发酵产物的损失。
2、本发明采用油脂及蔗糖加工过程中的副产物作为生产环脂肽的原料，降低了环脂肽的生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明并不仅限于以下实施例：
实施例1
甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)购买于中国工业微生物菌种保藏中心(cicc23921)。制作种子培养基并进行菌种扩大培养：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，nacl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0；按照体积比2％接种活化后的甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)，在25℃及180rpm条件下培养10小时。
固态发酵菜籽粕：菜籽粕5g，加入0.25g废糖蜜及0.5g无机盐溶液(mgso40.5g/l，kcl0.77g/l，kh2po41.0g/l，feso40.05mg/l，mnso45.0mg/l，cuso40.16mg/l，ph7.0)，再加入5ml水，搅拌均匀。向混合物中接入0.1ml扩大培养后的甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)种子液，于25℃发酵24h。
发酵结束后，添加25ml去离子水浸泡半小时，并逐步添加6mol/l氢氧化钠，将浸提液ph调节至8.0，离心除去菌体，收集上清液。在上清液中缓慢加入6mol/l盐酸，调节ph至2.0，静置30min后离心，收集沉淀。沉淀用0.1mol/lnano3洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，离心收集沉淀。冷冻干燥，制得环脂肽产品。
产品经过hplc(agilent1100)分析检测，色谱柱：zorbax-c18柱(4.6×150mm，5μm)；柱温：35℃；检测波长：210nm；进样量：20μl；溶剂：a：乙腈(含0.1％三氟乙酸)和b：水(含0.1％三氟乙酸)。流动相梯度变化条件为：0～10min，a60％～93％，b40％～7％；11～20min，a93％，b7％。流速：0.8ml/min。与环脂肽标准品进行对比，本方法制得的环脂肽主要为表面活性素，在冷冻干燥样品中该环脂肽的含量达到87％。
实施例2
甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)购买于中国工业微生物菌种保藏中心。
制作种子培养基并进行菌种扩大培养：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，nacl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0；按照体积比5％接种活化后的甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)，在32℃及180rpm条件下培养10小时。
甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)固态发酵菜籽粕：菜籽粕25g，加入3.75g废糖蜜及2.5g无机盐溶液(mgso40.5g/l，kcl0.77g/l，kh2po41.0g/l，feso40.05mg/l，mnso45.0mg/l，cuso40.16mg/l，ph7.0)，再加入25ml水，搅拌均匀。向混合物中接入2.5ml扩大培养后的种子液，于32℃发酵48h。
发酵结束后，添加375ml去离子水浸泡半小时，并逐步添加6mol/l氢氧化钠，将浸提液ph调节至8.0，离心除去菌体，收集上液。在上清液中缓慢加入6mol/l盐酸，调节ph至2.0，静置30min后离心，收集沉淀。沉淀用0.1mol/lnano3洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，离心收集沉淀。冷冻干燥，制得环脂肽成品。
产品经过hplc(agilent1100)分析检测，色谱柱：zorbax-c18柱(4.6×150mm，5μm)；柱温：35℃；检测波长：210nm；进样量：20μl；溶剂：a：乙腈(含0.1％三氟乙酸)和b：水(含0.1％三氟乙酸)。流动相梯度变化条件为：0～10min，a60％～93％，b40％～7％；11～20min，a93％，b7％。流速：0.8ml/min。与环脂肽标准品进行对比，本方法制得的环脂肽主要为表面活性素，在冷冻干燥样品中该环脂肽的含量达到82％。
实施例3
甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)购买于中国工业微生物菌种保藏中心。
制作种子培养基并进行菌种扩大培养：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，nacl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0；按照体积比3％接种活化后的甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)，在28℃及180rpm条件下培养10小时。
甲基营养型芽胞杆菌(bacillusmethylotrophicus)固态发酵菜籽粕：菜籽粕15g，加入1.5g废糖蜜及1.5g无机盐溶液(mgso40.5g/l，kcl0.77g/l，kh2po41.0g/l，feso40.05mg/l，mnso45.0mg/l，cuso40.16mg/l，ph7.0)，再加入15ml水，搅拌均匀。向混合物中接入0.9ml扩大培养后的种子液，于28℃发酵36h。
发酵结束后，添加150ml去离子水浸泡半小时，并逐步添加6mol/l氢氧化钠，将浸提液ph调节至8.0，离心除去菌体，收集上液。在上清液中缓慢加入6mol/l盐酸，调节ph至2.0，静置30min后离心，收集沉淀。沉淀用0.1mol/lnano3洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，离心收集沉淀。冷冻干燥，制得环脂肽成品。
产品经过hplc(agilent1100)分析检测，色谱柱：zorbax-c18柱(4.6×150mm，5μm)；柱温：35℃；检测波长：210nm；进样量：20μl；溶剂：a：乙腈(含0.1％三氟乙酸)和b：水(含0.1％三氟乙酸)。流动相梯度变化条件为：0～10min，a60％～93％，b40％～7％；11～20min，a93％，b7％。流速：0.8ml/min。与环脂肽标准品进行对比，本方法制得的环脂肽主要为表面活性素，在冷冻干燥样品中该环脂肽的含量达到85％。