本发明属于生物技术领域，涉及一种催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法。
背景技术：
花色是观赏植物的重要的观赏特征，针对花色的改良一直是园艺工作者的重要目标之一。植物的花色不仅在植物的授粉和繁衍后代方面起到重要作用，也为人类提供了五彩斑斓的观赏感受，具有重要的美学价值(grotewold,e.thegeneticsandbiochemistryoffloralpigments[j].annualreviewofplantbiology,2006,57(1):761.)。作为花种重要的观赏植物，现代玫瑰(rosahybrida)已有5000年的栽培历史。至今，人类已培育出2500多个品种，然而这其中却没有真正的蓝色的玫瑰。
市场上现有的蓝色玫瑰，如“蓝色妖姬”实际上是用染料染出的蓝色(holtont.a,tanakay.blueroses:apigmentofourimagination？[j].trendsinbiotechnology：unitedkingdom,1994,12(2):40–42.)。蓝色玫瑰(bluerose)在英语里作为成语，表示不可能实现的奇迹，频繁出现在包括电影、电视、诗歌、小说、戏剧等各种文艺作品中。
植物的花的颜色有很多决定因素，包括类黄酮类的花青素，萜类的胡萝卜素，还有液泡的ph值，金属离子等(tanakay,bruglieraf.flowercolourandcytochromesp450[j].philosophicaltransactionsoftheroyalsocietyoflondon,2013,368(1612):283-291.)。花青素在不同位点和不同程度的羟基化使花具有不同的颜色，其中类黄酮3’5’羟基化酶(f3’5’h)催化形成蓝色的花翠素，这是很多植物开蓝花的原因。由于包括玫瑰等植物在内的很多植物缺少编码f3’5’h的基因，所以这类植物没有蓝色的花(mikanagiy,saiton,yokoim,etal.anthocyaninsinflowersofgenusrosa,sectionscinnamomeae(＝rosa),chinenses,gallicanaeandsomemoderngardenroses[j].biochemicalsystematics&ecology,2000,28(9):887.)。
日本suntory公司利用转基因技术，通过导入包括f3’5’h在内的外源基因，同时抑制其它几个基因的表达来实现让自然界不开蓝色花的植物开出蓝色的花朵。该方法涉及多个基因的改造，所需前体物质复杂，制作成本极高，这一技术在康乃馨和菊花中取得成功，而由于玫瑰的液泡ph值很低(ph约为2.7)，这一技术在玫瑰上应用只得到淡紫色的花，无法展现真正的蓝色(图1)(katsumotoy,fukuchimizutanim,fukuiy,etal.engineeringoftheroseflavonoidbiosyntheticpathwaysuccessfullygeneratedblue-huedflowersaccumulatingdelphinidin.[j].plant&cellphysiology,2007,48(11):1589.)。尽管如此，这种淡紫色的玫瑰，每朵售价22-35美元(staff(20october2009)."bluerosestodebutinjapan".theindependent,houseandhome.retrieved30august2012.)，为suntory公司带来巨大经济效益，目前这种玫瑰只在日本和美洲大陆供应。真正蓝色的玫瑰的获得依然是一个人类还没有能解决的技术难题。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法。
本发明的技术方案概述如下：
催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法，包括如下步骤：
1)选取编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfp基因和编码靛蓝合成酶的bpsa基因，分别克隆在含植物启动子的质粒的植物启动子下游；
2)将步骤1)获得的质粒，在大肠杆菌中扩增，并转入土壤农杆菌；
3)利用土壤农杆菌介导把含sfp和bpsa的dna转入植物中；
所述sfp基因为任何物种来源的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因，或编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶同功酶的基因；
所述bpsa基因为任何物种来源的编码靛蓝合成酶的基因，或编码靛蓝合成酶同功酶的基因；
所述植物启动子为在植物细胞中能驱动下游基因表达的dna序列。
优选地，sfp基因的核苷酸序列为seqidno.1所示。
优选地，sfp基因所编码的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的氨基酸序列为seqidno.2所示。
优选地，bpsa基因的核苷酸序列为seqidno.3所示。
优选地，bpsa基因所编码的靛蓝合成酶的氨基酸序列为seqidno.4所示。
优选地，sfp基因上游的植物启动子chsp的核苷酸序列为seqidno.5所示。
优选地，bpsa基因上游的植物启动子rhagp的核苷酸序列为seqidno.6所示。
含植物启动子的质粒优选：pbi121。
所述花卉为玫瑰、月季、百合、菊花、康乃馨或兰花。
本发明的优点：
本发明克服了现有技术如染料染色、以及转基因方法的不足，染料对花进行染色具有更明显的人工痕迹，容易脱色，使用的有机染料通常还有毒；花通常为干花，不具花的香味，如果是鲜花染色则不宜保存，很快凋敝。本发明的方法生产的蓝色花，具有天然花的各种特征：新鲜，有花香，不脱色，无毒。
本发明所用方法转基因编码的酶不在液泡中，产生的靛蓝也不在液泡中，不受植物液泡低ph的影响，因而可以形成纯正的蓝色(royalblue)。产生蓝色物质的前体物，即酶的底物为植物体内富含的简单氨基酸，谷氨酰胺，涉及的酶促反应仅有一步，不需要复杂的前体物质，可以从自然界中有的白花出发进行基因改造。
用转基因的方法培育出蓝色的花卉，如百合、月季、菊花、康乃馨、兰花等，特别是蓝色的玫瑰的获得。
附图说明
图1日本suntory公司蓝色玫瑰改造策略。其中，图1-1为suntory公司利用花翠素的生物合成获得淡紫色玫瑰花的基因改造路线图；图1-2为suntory最终获得的淡紫色玫瑰花照片。
图2磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp与靛蓝合成酶bpsa的信息图。包括，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的反应过程示意图(图2-1)，编码的靛蓝合成酶的bpsa的结构和反应机理示意图(图2-2)，靛蓝合成酶bpsa的sds-page电泳图(图2-3)和蓝色化合物靛蓝的光吸收图谱(图2-4)。
图3表达质粒pbi121-genes2构建示意图。其中：orit：转移起始区，基因转移元件；oriv：质粒复制起始区；is1：基因转座元件；kanr：卡那霉素抗性基因；lb/rb：nopalinec58t-dna来源的重复序列，基因转座元件；mast/nost：终止子；chsp：chalconesynthase基因启动子；rhagp：agamous-likeprotein基因启动子。
图4土壤农杆菌介导的bpsa基因瞬时转染玫瑰显示蓝色花瓣图。图4-1显示转化后的蓝色花瓣；图4-2左边的花为没有乙酰丁香酮的负对照，右边的花为添加乙酰丁香酮并瞬时转染转化后的蓝色玫瑰花瓣；箭头标示的是瞬时转化位置，虚线圆圈显示蓝色色斑区域。
具体实施方式
本发明利用一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活化靛蓝合成酶，活化后的该酶催化谷氨酰胺合成蓝色化合物靛蓝，从而使白色玫瑰花呈现蓝色。
本发明用现代玫瑰(rosahybrida)作为例子，但使用这一方法获得的蓝色花卉不限于现代玫瑰，实验证明，用本发明的方法获得蓝色的玫瑰、月季、百合、菊花、康乃馨或兰花。
本发明的具体实施例中，植物细胞转化方法可以为将人工改造的基因序列经物理或化学或生物手段导入植物细胞中的过程。本发明中采用的是生物手段，利用土壤农杆菌介导的植物细胞转基因方法。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明
实施例1基因选择
磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyltransferases)活化非核糖体多肽合成酶的巯基化结构域t，其反应机制见示意图2-1，活化后的t结构域行使固定底物的功能，该功能是非核糖体多肽合成酶发挥催化功能所必须的。
本发明中所使用的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因sfp来源于bacillussubtilisatcc21332(ncbi编号：als83446)，我们针对蔷薇科植物基因密码子偏好性对基因密码子调整优化，获得核苷酸序列seqidno.1。sfp基因编码的氨基酸序列见seqidno.2。sfp基因的选择不应该限制本发明中对磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的保护范围，使用任何其他物种来源的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因，或编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶同功酶的基因，且与靛蓝合成酶共同作用从而获得蓝色花卉的方法均应得到本发明的保护。
靛蓝合成酶(indigoidinesynthetase)属于非核糖体多肽合成酶，其含两个氨基酸特异性识别结构域a，一个含黄素(fmn)的氧化结构域ox，一个thiolation结构域t，和一个负责产物解离的结构域te。靛蓝合成酶具有催化两分子的谷氨酰胺合成蓝色化合物靛蓝的功能，机制如图2-2所示。所形成的靛蓝(indigoidine)分子式如图2-2中所示，光吸收图谱如图2-4所示，与其他染料相比，具有非常好的水溶性，和蓝色光泽，且未发现对植物细胞有明显的伤害作用。
本发明选择的编码靛蓝合成酶基因bpsa来源于链霉菌streptomyceslavendulaeatcc11924，bpsa编码的氨基酸序列见seqidno.4(ncbi编号：wp_030237949)，我们针对蔷薇科植物基因密码子偏好性对基因密码子调整优化，获得核苷酸序列seqidno.3。bpsa基因编码的靛蓝合成酶基因全长3846个碱基，编码的蛋白1282个氨基酸，大约140kd，表达纯化的蛋白在sds聚丙烯酰胺(sds-page)蛋白胶上如图2-3。bpsa基因的选择不应该限制本发明对靛蓝合成酶的保护范围，使用任何其他物种来源的编码靛蓝合成酶的基因，或编码靛蓝合成酶同功酶的基因，且与磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶共同表达从而获得蓝色花卉的方法均应得到本发明的保护。
玫瑰(rosahybrida)来源的植物启动子chsp启动子和rhagp启动子序列分别见seqidno.5(ncbi编号：fw556946)和seqidno.6(ncbi编号：u43372)。
实施例2质粒克隆
本发明选择植物双元表达载体pbi121做为出发质粒载体。
在质粒pbi121的限制性酶切位点pmei和saci之间插入人工合成片段(seqidno.7)，组建质粒pbi121-chs-rhag，见图3。seqidno.7包括mannopinesynthase的终止子序列mast、启动子序列chsp和启动子序列rhagp。
以包含seqidno.3序列的质粒为模版，以bpsa-fg(seqidno.8)和bpsa-rg(seqidno.9)为引物，经pcr获得片段bpsa。
以包含seqidno.1序列的质粒为模版，以sfp-fg(seqidno.10)和sfp-rg(seqidno.11)为引物，经pcr获得片段sfp。
质粒pbi121-chs-rhag经限制性内切酶bamhi和spei酶切，经纯化回收后得到片段chs-rhag和质粒pbi121骨架，使用
实施例3：携带目标基因的感受态土壤农杆菌的制备
从大肠杆菌中经质粒抽提获得的质粒pbi121-genes2转化进入土壤农杆菌。土壤农杆菌感受态细胞的制备为通用的方法，具体是：
1.土壤农杆菌(agrobacteriumtumefaciensgv3101)在含10μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的lb琼脂培养基上于28℃培养两天；
2.单克隆菌落接入5ml含相同抗生素的lb液体培养液(10μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素)于28℃的摇床培养过夜，转速150转每分钟。
3.2ml过夜培养的土壤农杆菌培养液稀释到200毫升的lb培养液在28℃的摇床中(转速250转每分钟)培养至细胞密度od600为0.3到0.5。
4.土壤农杆菌培养液装入50ml的离心管中在冰上冷却并经3000×g的转速离心。
5.去除上清后，土壤农杆菌细胞重新悬浮于80ml的冰上预冷的ccmb80缓冲液中，置于冰上冷却20分钟.ccmb80缓冲液的配方是：10mm醋酸钾,80mmcacl2·2h2o,20mmmncl2·4h2o,10mmmgcl2·6h2o,10％甘油,ph6.4。
6.细胞再次离心，去除上清，再悬浮于5ml的预冷的ccmb80缓冲液中。
7.用1.5ml的ep管分装，每管100μl，然后用液氮迅速冷冻后，储存于零下80度的冰箱。
土壤农杆菌转化的实验操作也是同样操作，具体如下
1)在冰上加1μg质粒dna(pbi121-genes2)到100μl上述制备的感受态土壤农杆菌细胞悬浮液中，然后迅速用液氮冷冻。
2)上述包含质粒dna的土壤农杆菌感受态细胞在37℃的水浴锅中融化5min。
3)加入一毫升不含抗生素的lb培养液在28℃摇床150转每分钟震荡培养3小时。
4)低速离心获得细胞。
5)把细胞涂在lb琼脂平板上，把平板放在28℃培养箱中，用抗生素筛选含抗性基因的菌落。lb平板中含10μg/ml利福平、50μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素。
6)两到三天可以看到菌落生长。
实施例4：土壤农杆菌介导bpsa瞬时转染蓝色转基因玫瑰花的获得
1.上述转化成功的土壤农杆菌gv3101菌落单克隆接入5ml含抗生素的lb培养液中(10μg/ml利福平、50μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素)于28℃,200转每分钟震荡培养过夜。
2.1ml上述土壤农杆菌菌液转入100ml含相同抗生素的lb培养液中28℃,200rpm培养直至od600达到1.5。
3.土壤农杆菌细胞3000×g离心10min去除上清后，用10mmmgcl2,10mmmes,ph5.6的缓冲液(负对照)或上述相同缓冲液额外加入150μg/ml乙酰丁香酮(正对照)悬浮细胞至细胞密度为od600在0.5-1.0的范围中，避光在室温下保存3-5小时。
4.取新鲜白色玫瑰花rosahybrida的完整花枝的切花，将花茎浸泡于无菌水中。
5.花瓣上的脉络在花瓣背面标记，避免损伤组织。
6.用1ml的一次性针头注射器将100-150μl步骤3中的包含(正对照)和不含(负对照)乙酰丁香酮的土壤农杆菌细胞悬浮液缓慢从主脉注入，并在22℃避光保存12小时以上。
实验结果如图4所示，箭头标示的是瞬时转染位置，虚线圆圈显示蓝色色斑区域。图4-1显示转化后的蓝色花瓣。图4-2左边的花为不含乙酰丁香酮的同样细胞密度的感受态土壤农杆菌，土壤农杆菌细胞在注射的原位和经花脉转移的附近的地方，图4-2右边的花为在有能刺激基因从土壤农杆菌转化进入植物细胞的乙酰丁香酮存在的情况下，完成了基因转化，使花瓣呈现蓝颜色。
实验结果显示链霉菌来源的bpsa和枯草杆菌sfp基因经土壤农杆菌介导，进入玫瑰花细胞，并且在植物细胞内表达出相应有活性的非核糖体多肽合成酶，并利用植物细胞体内的谷氨酰胺合成了蓝色的靛蓝，从而使玫瑰花瓣呈现蓝色。
序列表
<110>天津大学；中国科学院微生物研究所
<120>催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>675
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)
<400>2
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<210>4
<211>1283
<212>prt
<213>淡紫灰链霉菌(streptomyceslavendulae)
<400>4
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