本发明涉及细胞领域，特别涉及由结肠癌细胞制备结肠癌干细胞的方法。
背景技术：
结肠癌作为最常见的恶性肿瘤之一，在全世界男性的肿瘤发病率中排名第3位，病死率中排名第4位，女性的肿瘤发病率中排名第2位，病死率中排名第3位。在过去的30多年里包括中国在内的许多国家或地区结肠癌发病率呈上升的趋势。结肠癌发病的主要原因是高脂肪食谱和纤维素摄入不足，其治疗方法是以手术为主、辅以化疗、免疫治疗、中药以及其他支持治疗的综合方案。但是在临床治疗上，患者接受药物后，起初反应非常好，但几个月后，肿瘤复发，并且对原先的治疗药物出现耐药性。
随着大量研究的深入，肿瘤干细胞的理论获得越来越多研究结果的支持，结肠癌细胞中存在的结肠癌干细胞具有很高的自我更新能力，并具有外排化疗药物的特性，常规的化疗药物仅可杀死结肠癌细胞，而无法杀死结肠癌干细胞，从而导致癌症无法根治且易复发。如何彻底的杀死结肠癌干细胞是治疗结肠癌的关键，也是目前研究该疾病的主要趋势。
肿瘤干细胞在临床上有广阔的应用前景，如为肿瘤药物提供筛选平台。肿瘤干细胞会高表达一些特异性的表面分子，根据这些表面分子结合分选技术和富集可得到目的细胞。
cd133是最为普遍的用于筛选结肠癌干细胞的细胞表面分子,并且cd133的阳性表达可以用来判断结肠癌的转移和预后,所以cd133被认为是一个理想的细胞表面分子。然而，shmelkov(shemelkovetalcd133expressionisnotrestrictedtostemcells,andbothcd133+andcd133–metastaticcoloncancercellsinitiatetumors.jclininvest.2008；118(6):2111-2120)等证明在转移性的结肠癌中cd133阴性的细胞同样能够在动物模型中成瘤,说明仅以cd133作为转移性的结肠癌细胞引发肿瘤生成的标志性表面分子是不够的，需要更具标志性的表面分子同时作为结肠癌肿瘤干细胞的判定依据。。a.l.cavalieri等研究表明lgr5也许是结肠癌干细胞的一个标记，可望作为治疗结肠癌的靶点并针对其开发相关药物(cavalieri,a.l.,etal.,attosecondspectroscopyincondensedmatter.nature,2007.449(7165):p.1029-32)。除了此以外，可以用来筛选结肠癌干细胞的细胞表面分子还有cd166，cd44，cd29等。
目前有许多关于结肠癌干细胞表面标志物的研究，研究显示不同肿瘤之间，肿瘤干细胞表面分子不尽相同，并且在同一个肿瘤里也存在不同的肿瘤干细胞亚群。因此，如何找到一个结肠癌干细胞特异性的标志物，进而获得更有利于临床前研究的结肠癌干细胞，对靶向治疗结肠癌提供理论依据具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供获得有利于临床前研究的人结肠癌干细胞的重编程方法，所述方法采用cd26作为结肠癌干细胞的分选标志，以获取cd26及cd133双细胞表位的丰度均较高的结肠癌干细胞。
上述方法具体包括如下步骤：
步骤1、取人结肠癌细胞sw480培养，再以表达oct4，sox2和klf4三种转录因子的慢病毒感染细胞；
步骤2、以增殖培养基培养；
步骤3、再以诱导培养基培养，待充分重编程后，传代纯化细胞；
步骤4、继续扩大培养并进行细胞分选即得到目的icsc，所述细胞分选以cd26为分选标志。
优选的，所述获得人结肠癌干细胞的方法，包括如下步骤：
1、取sw480细胞培养，待细胞长满后，消化细胞并计数，以表达klf4、oct4和sox2的慢病毒以感染复数为20的比例感染细胞，接种到新的培养皿中；以增殖培养基培养；
2、24h后更换新鲜的诱导培养基，继续培养10-15天，每2天换液；
3、将细胞消化，并通过0.05％胰酶将克隆球先消化下来，再消化成单细胞，接种到新的培养皿中，用诱导培养基培养，每2-3天换液；
4、待其长满后，利用流式细胞术分选目的细胞。
优选的，步骤1中感染后细胞的接种密度为2×103个/cm2。
优选的，步骤3中的消化方法为在0.05％的胰酶中消化2-3分钟，即将克隆吹打下来，再沉降。
更优选的，上述流式细胞术分选目的细胞的方法，包括如下步骤：
(a)将细胞充分消化成单细胞，将cd26单抗与细胞共孵育30分钟；
(b)利用流式细胞仪分选细胞；
(c)分选后的细胞在增殖培养基中培养，即可得到所需的目的细胞。
优选的，上述步骤(a)中所用的抗体是抗人cd26。
优选的，所述增殖培养基为含有15％(v/v)fbs、100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和2mm的l-谷氨酰胺的dmem培养基。更优选的，所述fbs为胚胎干细胞级别的fbs。
所述的诱导培养基为含有10％(v/v)fbs,2μg/mldox的dmem培养基。
采用上述培养方法得到的结肠癌干细胞具有更强的耐药性和体内成瘤能力，符合肿瘤干细胞的鉴定标准，可作为靶细胞用于药物体外药效的筛选。
附图说明
图1：重编程之后的肿瘤干细胞形态
图2：流式分选之后的肿瘤干细胞形态
图3：重编程之后的肿瘤干细胞荧光染色鉴定，图a为光镜视野下肿瘤干细胞的生长图片，图b为荧光视野下肿瘤干细胞的生长图片。
图4：免疫荧光染色法鉴定肿瘤干细胞的cdx2和ck20的表达情况
图5：流式细胞术检测肿瘤干细胞的侧群细胞(sp)比例。
图6：肿瘤干细胞对5-fu的耐药性检测。
图7：肿瘤干细胞与sw480细胞在裸鼠体内的成瘤能力检测。
图8：肿瘤干细胞用于药物的体外药效评价，图a-d分别为抗体浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的条件下，pbmc诱导的lenticsc细胞发生坏死。
具体实施方式
实施例1：sw480细胞的重编程
1.方法：
1.1病毒包装：将表达oct4，sox2和klf4的转录因子的慢病毒质粒分别与pvsvg和pcmv-dr8.91(来自于上海斯丹赛生物技术有限公司)载体共转染293t细胞，48h后包装产生分别表达oct4，sox2和klf4三种转录子的病毒，收集各病毒留用。
1.2待sw480细胞(购于中国科学院上海生命科学院)生长至第80-90％汇合度时，利用包装好的oct4，sox2和klf4三种转录子的慢病毒，分别以感染复数为20的比例感染细胞，并接种到新的明胶预先包被的培养皿中；以增殖培养基(含有15％(v/v)fbs、100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和2mm的l-谷氨酰胺的dmem培养基)培养。
1.324h后，弃去病毒液，更换为新鲜的诱导培养基(含有10％(v/v)fbs,2μg/mldox的dmem培养基)诱导10-15天。每两天换新鲜的诱导培养基。
1.4用0.05％的胰酶消化2min后，用力将克隆球拍打至脱离皿底，收集到离心管中自然沉降5min后，弃去上清，重复一次，再用胰酶消化3min至单细胞状态，接种到新的培养皿中，(实验结果如图1所示)用诱导培养基培养，每2-3天换液；待其长满后，利用accuric6流式细胞仪分选目的细胞。
2.结果：细胞纯化传代后，能够得到大量增殖迅速，形态均一的克隆状细胞(图1)，符合干细胞的特性。
实施例2：肿瘤干细胞的流式分选
1.方法:
消化重编程之后的肿瘤干细胞(icsc)为单细胞，用冷的dpbs洗涤2遍。在ep管中用100μl冷dpbs将细胞重悬。加cd26单抗冰箱中避光孵育30min，对照组不加抗体。冷的dpbs洗涤2遍，利用流式细胞仪分选目的细胞，收集细胞在含15％fbs，2mml-谷氨酰胺的dmem培养基中培养(实验结果如图2所示)。
2、结果：分选后的细胞依然保持了分选前细胞的形态和增殖速度(图2)
实施例3：肿瘤干细胞的荧光染色鉴定
1.方法:
将肿瘤干细胞(icsc)消化，制备单细胞悬液，用pbs清洗一次，取1×106个，用100ulpbs重悬，加入10ulanti-human-cd26pe荧光染料，于4℃染色20min，染色结束后，用pbs清洗一次，于荧光显微镜下拍照(100×)。(实验结果如图3所示)
2、结果：有部分肿瘤干细胞(icsc)可被荧光染料染色，在荧光显微镜下可见红色荧光，故这部分细胞可表达cd26。
实施例4肿瘤干细胞的抗原表位鉴定
1.方法：
1.1流式细胞术检测结肠癌干细胞标志性表面分子：分别培养sw480和icsc至80-90％的密度，充分消化为单细胞，用冷的dpbs洗涤2遍。在ep管中用100μl冷dpbs将细胞重悬。分别添加cd26、cd133、lgr5、abcg2单抗以及cd26&cd133单抗在冰箱中避光孵育，对照组不加抗体。用冷的dpbs洗涤2遍，1％的多聚甲醛固定细胞重悬，4℃避光固定30min后，上机检测，结果显示sw480经重编程及定向流式分选成为icsc后，肿瘤干细胞的标志性细胞表位cd133、lgr5、abcg2均有明显的增高，cd26&cd133双细胞表位的丰度也由零提高至高丰度。
1.2免疫荧光染色：待各icsc生长3天后，4％多聚甲醛室温固定放置30min；用pbs洗涤1遍后，用抗体稀释液(0.2％(v/v)bsa和0.1％(v/v)tritonx-100溶于pbs)洗涤两次；加封闭液(含1％(v/v)bsa+4％(v/v)正常血清+0.4％(v/v)tritonx-100的pbs溶液)室温封闭细胞1h后添加一抗，室温孵育2h；再用含0.1％(v/v)tritonx-100的pbs洗涤细胞3次,将二抗加到细胞样品上，室温放置1h；pbs洗涤三次后，在含1μg/mldapi的pbs溶液中室温放置5min；用pbs洗涤两次；镜下观察(实验结果如附图4所示)。
2.结果：流式细胞术检测结果表明，重编程后的细胞其肿瘤干细胞标志性的分子cd26、cd133、lgr5和abcg2均明显上调(，且表达了结肠癌细胞系的标志性分子cdx2和ck20(图4)，说明本发明的重编程技术有利于将结肠癌细胞转变为具有结肠癌干细胞特性的细胞。
实施例5肿瘤干细胞对染料外排效应的检测
1.实验方法：待细胞长满后，胰酶消化sw480和cd26分选后的icsc细胞，待消化充分后计数，将细胞密度调至1×106个/ml，每种细胞分为2组，一组加入终浓度50um的verapamil(购于sigma)组，即刻混匀后立即置于37℃水浴中反应15min，然后加入终浓度为5ug/ml的hoechst33342，即刻混匀，置于37℃水浴中避光孵育90min，每10min颠倒摇匀一次。另一组不添加verapamil，直接添加hoechst33342染色，即刻混匀，置于37℃水浴中避光孵育90min，每10min颠倒摇匀一次染色结束后，将样本立即置于冰浴避光冷却10min，然后将样本转移至流式管中并置于冰浴避光保存。向反应体系中直接加入3ml预冷的含2％fbs和10mmol/lhepes的pbs，洗涤细胞1次，离心，4℃，300g，5min。弃上清后，用500ul预冷的含2％fbs和10mmol/lhepes的pbs重悬细胞，置冰浴避光保存。流式上机前在反应体系中加入终浓度为1ug/ml的pi，冰浴避光10min后即可检测(实验结果如附图5所示)。
2.实验结果：sw480细胞的侧群细胞比率仅为0.8％，而重编程之后的细胞侧群比率为4.8％，显著的提高了6倍，说明重编程之后有更多比率的细胞具有染料外排的效应，符合肿瘤干细胞的特性。
实施例6分选后细胞对化疗药物的耐药性检测
1.实验方法：待细胞长满后，胰酶消化6cm中的sw480和cd26分选后的icsc细胞，待消化充分后计数，按照5×103cells/孔的密度种至0.1％明胶预先包被的96孔板中，设置3组，即分别为空白组(仅有增殖培养基)、对照组(细胞+增殖培养基)、50ug/ml5-fu组(5-氟尿嘧啶+细胞+增殖培养基)，每组4个复孔，体积为100ul，用增殖培养基培养。96h后，向各孔中加入10μlcck-8(购自碧云天)溶液37℃，co2培养箱中孵育2h，酶标仪检测od450数值(实验结果如附图6所示)。
2.实验结果：经重编程和cd26分选后的细胞细胞存活率是源头细胞sw480的2.2倍(图6)，说明其具有更强的耐药性，具备了肿瘤干细胞对化疗药物具有抗药性的特点。
实施例7肿瘤干细胞的体内成瘤能力
1.实验方法：分别培养sw480和重编程并cd26分选之后的icsc，待其生长至80％的密度时，用0.05％的胰酶消化成单细胞，pbs洗涤2遍后用基质胶重悬，分别以2×105，1×106，5×106细胞/只剂量将细胞接种到各裸鼠中，每只小鼠注射的细胞悬液体积为150ul，21天后取瘤并称重(实验结果如图7所示)。
2.结果：sw480细胞最低的成瘤剂量均为1×106细胞，而经cd26分选之后的细胞其最低成瘤剂量则为2×105细胞；在1×106细胞的剂量时，各细胞株来源的肿瘤重量差异显著，且经cd26分选icsc来源的肿瘤重量显著的高于sw480细胞组(图7)。说明经过重编程和cd26分选后的结肠癌干细胞，具有高致瘤能力，符合肿瘤干细胞的特性。
实施例8肿瘤干细胞用于双特异性抗体的体外药效评价
用胰酶消化重编程并cd26分选之后的icsc细胞，制备单细胞悬液，用10％fbs-1640完全培养基将细胞重悬至6×105个/ml，按照3×104个/孔，即50ul/孔加入u-型96孔板中，将双特异性抗体稀释至100ng/ml，10ng/ml，0.1ng/ml，0ng/ml的浓度，每孔50ul加入到已添加icsc细胞的96孔板中，每个浓度设置12个复孔，37℃孵育30min。孵育结束后，将人pbmc细胞稀释至3×106个/ml，按1.5×105个/孔，即50ul/孔加入到上述各孔中，置37℃继续孵育15h，孵育结束后，按不同抗体浓度分别收集各孔中的细胞样品，按凋亡检测试剂盒说明书操作，将收集的细胞悬液转移到离心管中，1000rpm离心3min，去除上清液，加入pbs，1000rpm离心3min，去除上清液，再重复本操作一遍。用1×annexinvbindingsolution制备细胞终浓度为1×106cells/ml的细胞悬液，取不同浓度抗体处理组的100ul上述细胞悬液，加入到一个新的离心管中，向细胞悬液中加入5ulpi溶液，室温下避光培养15min，加入400ul1×annexinvbindingsolution，用accuric6流式细胞仪进行检测及分析。实验结果如图8所示。
上述双特异性抗体由cd26的重链可变区、轻链可变区和cd3的重链可变区、轻链可变区连接而成，氨基酸序列如seqidno：1所示。以蜂鸟窝(pinemoth)相关蛋白(如seqidno.2所示)作为分泌表达信号肽，并按照哺乳动物细胞cho密码子偏爱性进行优化，得到编码双特异性抗体的基因序列如seqidno：3所示。按照本领域常规技术手段进行表达质粒构建、表达和纯化记得本实施例的双特异性抗体。制备可参见pct申请“双特异性抗体、其制备方法和用途”(申请号：pct/cn2015/093383)。
实验结果证明了在双特异性抗体的作用下，pbmc诱导了靶细胞，即本发明的icsc细胞发生坏死，随着抗体浓度的增高，发生坏死的靶细胞比例增加，呈现一定的剂量依赖，可知本发明的icsc细胞可作为一种靶细胞用于体外药效的筛选。