本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及酯酶estp00714在催化拆分外消旋乙酸芳樟酯得到(s)-芳樟醇中的应用。
背景技术：
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酯酶(ec3.1.1.1)广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中心由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽(gxsxg)序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。通过微生物酯酶的生物转化制备新型药物中间体或者去除药物消旋体的非有效成分，是一种重要的手性技术，有着非常广阔的应用前景，它可以为合成手性药物提供新的平台，为大量制备光学纯化合物提供新的方法。酶法选择性拆分消旋体化合物，具有立体专一性高，副反应少，产率高，产物光学纯度好以及反应条件温和的优点，所以是一种被广泛认可的拆分方法。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种酯酶estp00714在催化拆分外消旋乙酸芳樟酯得到(s)-芳樟醇中的应用。
本发明从一株假单胞菌pseudonocardiaantitumoralishup007中开发得到一种酯酶estp00714(其氨基酸序列如seqidno.2所示)及其编码基因estp00714(其核苷酸序列如seqidno.1所示)，构建了含有酯酶基因estp00714的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶estp00714，其可应用于催化酯类水解反应。
本发明的酯酶estp00714在催化拆分外消旋乙酸芳樟酯得到(s)-芳樟醇中的应用，所述的酯酶estp00714，其氨基酸序列如seqidno.2所示。
优选，所述的催化拆分外消旋乙酸芳樟酯得到(s)-芳樟醇是在有机溶剂和/或表面活性剂存在环境下进行的。
所述的有机溶剂优选为乙醇。
所述的表面活性剂优选为三聚磷酸钠。
所述的催化拆分外消旋乙酸芳樟酯得到(s)-芳樟醇的反应体系优选为：包含20mg/ml酯酶estp00714、50mm底物外消旋乙酸芳樟酯、体积分数10％的乙醇和5g/l三聚磷酸钠，其余为ph6pbs缓冲液。
所述的催化拆分外消旋乙酸芳樟酯得到(s)-芳樟醇的反应温度为30℃，反应时间为2h。
本发明的酯酶基因estp00714来自深假单胞菌pseudonocardiaantitumoralishup007(保存在中国科学院南海海洋研究所)。本发明的酯酶estp00714，其氨基酸序列如seqidno.2所示，其编码基因estp00714核苷酸序列如seqidno.1所示，该酯酶estp00714公开于专利申请号：201610605466.3，发明名称：一种酯酶estp00714及其编码基因和应用的专利申请中，酯酶estp00714的制备方法见于该专利中，由此能够获得酯酶estp00714酶粉(即纯化的酯酶estp00714)。
本发明利用酯酶estp00714作为催化剂，通过优化反应体系和反应条件，得到了对映体过量值96％以上的(s)-芳樟醇，转化率达到55％。本发明与传统的化学拆分相比具有反应条件温和、无污染、对映体过量值高的优点。可用于生物医药、化妆品和精细化工等领域，具有非常大的应用价值。
附图说明：
图1是底物浓度对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响。
图2是酶浓度对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响。
图3是反应时间对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响。
图4是反应前外消旋乙酸芳樟酯气相色谱图；其中，1代表外消旋乙酸芳樟酯。
图5是(±)-芳樟醇气相色谱图；其中，r代表(r)-芳樟醇，s代表(s)-芳樟醇。
图6是反应后外消旋乙酸芳樟酯及产物芳樟醇气相色谱图；其中，r代表(r)-芳樟醇，s代表(s)-芳樟醇，1代表乙酸芳樟酯。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明的酯酶基因estp00714来自深假单胞菌pseudonocardiaantitumoralishup007，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本发明的酯酶estp00714，其氨基酸序列如seqidno.2所示，其编码基因estp00714核苷酸序列如seqidno.1所示，该酯酶estp00714公开于专利申请号：201610605466.3，发明名称：一种酯酶estp00714及其编码基因和应用的专利申请中，酯酶estp00714的制备方法见于该专利中，由此能够获得纯化的酯酶estp00714(即酯酶estp00714酶粉)。
实施例1：酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯
1.1反应ph和温度对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
不同ph反应体系为0.5ml，包含10mg酯酶estp00714酶粉，50mm底物外消旋乙酸芳樟酯，其余为不同ph的反应缓冲液；在不同温度下反应2h。gc测定酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的立体选择性，根据峰面积计算产物对映体过量值(e.e.)和转化率(c)，结果见表1。
公式1：
式中：as和ar分别表示(s)-芳樟醇和(r)-芳樟醇的峰面积，a0和a表示反应前后乙酸芳樟酯的峰面积。
在ph6.0-10.0之间转化率(c)随ph的增大而增大，但e.e.随ph的增大而逐渐减小。在ph6.0时得到最高的e.e.92％。因此，酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的最适ph为6.0。
c随着温度升高先增加后减少，在25-35℃之间，e.e.降低不明显。当温度高于35℃时c显著降低，这与高温影响酶的活性有关。在30℃时取得最大转化率55％，e.e.达到94％。因此，酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的最适温度为30℃。
表1反应ph与温度对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
a表示pbs缓冲液，b表示tris/hcl缓冲液
1.2有机溶剂对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
反应体系为0.5ml，包含10mg酯酶estp00714酶粉，50mm底物外消旋乙酸芳樟酯，体积分数10％、30％的有机溶剂，其余为ph6.0pbs缓冲液；以未加有机溶剂为对照；在30℃下反应2h，用气相色谱手性柱检测，结果见表2。
表2有机溶剂对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
从表2中可看出大部分有机溶剂存在的情况下酯酶estp00714的立体选择性都略有提高，但烷类不同程度的降低转化率。虽然在体积分数10％的异辛烷、正己烷和甲苯存在的情况下，e.e.达到98％，但其c相对降低比较明显。在体积分数10％的乙醇中，e.e.和c都有提高，分别达97％和52％。因此在后续实验中采用乙醇为助溶剂。
1.3表面活性剂对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
在优化条件下(30℃，ph6.0pbs缓冲液)，反应体系为0.5ml，包含10mg酯酶estp00714酶粉，50mm底物外消旋乙酸芳樟酯，终浓度为体积分数10％的乙醇，1g/l、5g/l、10g/l的表面活性剂(三聚磷酸钠、tween-20、tween-80、tritonx-100)，其余为ph6.0pbs缓冲液；以未加表面活性剂为对照，在30℃下反应2h后，样品用于gc检测，结果见表3。从表3中可看出，与对照相比，4种表面活性剂对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的e.e.无明显影响，5g/l三聚磷酸钠可以提高转化率到54％，因此在后续实验中加入5g/l的三聚磷酸钠。
表3表面活性剂对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
1.4底物浓度对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
在优化条件下(30℃，ph6.0pbs缓冲液)，反应体系为0.5ml，包含10mg酯酶estp00714酶粉，10-100mm底物外消旋乙酸芳樟酯，体积分数10％的乙醇，5g/l三聚磷酸钠，其余为ph6.0pbs缓冲液；在30℃下反应2h后，样品用于gc检测，结果见图1。从图1中可看出，随着底物浓度增加，e.e.缓慢增加，转化率c逐渐下降。说明较高浓度的底物会抑制酶的反应，使转化率下降。底物浓度>50mm时，e.e.基本不变，因此，酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的最适底物浓度为50mm，e.e.和c分别为96％和50％。
1.5酶浓度对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
在优化条件下(30℃，ph6.0pbs缓冲液)，反应体系为0.5ml，包含5-35mg酯酶estp00714酶粉，50mm底物外消旋乙酸芳樟酯，体积分数10％的乙醇，5g/l三聚磷酸钠，其余为ph6.0pbs缓冲液；在30℃下反应2h后gc检测，结果见图2。从图2中可以看出，随酶浓度的增加，e.e.和转化率变化不是很大。酶浓度为20mg/ml时，e.e.和转化率分别为96％和53％。
1.6反应时间对酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的影响
在优化条件下(30℃，ph6.0pbs缓冲液)，反应体系为0.5ml，包含10mg酯酶estp00714酶粉，50mm底物外消旋乙酸芳樟酯，体积分数10％的乙醇，5g/l三聚磷酸钠，其余为ph6.0pbs缓冲液；在30℃下反应，每间隔1h取出500μl，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠除水，加入l-乳酸甲酯作为内标，用气相色谱手性柱检测。不同反应时间酯酶estp00714拆分外消旋乙酸芳樟酯的结果见图3。
从图3中可看出，随着时间的延长，c逐渐升高，经过2h反应，e.e.和转化率基本达到最高，分别达到96％和55％。2h之后，转化率和e.e.变化都不明显。图4、5、6分别是反应前外消旋乙酸芳樟酯、(±)-芳樟醇气相色谱图及反应后乙酸芳樟酯和芳樟醇气相色谱图。
序列表
<110>中国科学院南海海洋研究所
<120>酯酶estp00714在催化拆分外消旋乙酸芳樟酯得到(s)-芳樟醇中的应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1146
<212>dna
<213>假单胞菌hup007(pseudonocardiaantitumoralishup007)
<400>1
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<213>假单胞菌hup007(pseudonocardiaantitumoralishup007)
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