PpCER1-2基因、载体及在提高禾本科植物的抗旱性中的应用的制作方法

文档序号:15457451发布日期:2018-09-15 01:30

本发明属于植物育种技术领域,尤其涉及一种PpCER1-2基因、载体及在提高禾本科植物的抗旱性中的应用。



背景技术:

植物在生长发育过程中,常遭受许多非生物逆境如干旱、盐渍、低温等的影响;干旱胁迫是各种环境胁迫中最普遍的逆境因子之一;提高植物的抗旱能力已经成为现代植物育种工作急需解决的关键问题之一。在长期的进化过程中,高等植物逐渐演变形成一系列生理或发育的机制来响应环境中的水分胁迫。植物的这种适应性涉及植物的形态、生理生化及分子生物学等诸多领域。高等植物对水分胁迫的耐受性在一定程度上具有相同的分子基础,很多基因的表达受水分胁迫的诱导并在植物抵抗水分胁迫中起作用。抗旱相关基因的挖掘已成为目前植物遗传资源与品种改良研究的热点。目前通过基因工程手段导入植物体内提高抗旱性的植物抗旱相关基因包括渗透调节物质合成酶类基因、清除活性氧的酶类基因以及一些保护生物大分子及膜结构的蛋白质基因。

禾本科植物是种子植物中最有经济价值的大科,禾本科植物抗旱能力的研究一直以来都是国内外学者的研究热点。植物角质层作为植物与环境之间的直接屏障,具有重要的生理生态功能,在植物适应干旱的陆生环境中发挥了重要作用。目前,通过改良植物角质层、减少其渗透性以提高植株抗旱性的研究较少。主要原因是能够改良角质层特性的备选基因还比较少。

综上所述,现有技术存在的问题是:目前尚缺乏改良禾本科植物角质层特性的有效基因资源,特别是缺少在禾本科非模式植物上的蜡质合成基因,从而阻碍了利用基因工程技术改良角质层特性提高植株抗旱性的应用。



技术实现要素:

针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种PpCER1-2基因、载体及在提高禾本科植物的抗旱性中的应用。

本发明是这样实现的,一种PpCER1-2基因,所述PpCER1-2基因的序列为:SEQ ID NO:1。

本发明的另一目的在于提供一种所述PpCER1-2基因的构建方法,所述PpCER1-2基因的构建方法包括:

步骤一,根据草地早熟禾叶片转录组数据,设计上游引物:ATGGCGACCAGGCCGGG、下游引物:TCAAGCTTTCGTCAGAGGGACGA,以草地早熟禾叶片RNA反转录合成的cDNA第一链为模板,进行PCR扩增;

步骤二,PCR扩增程序:94℃预变性2分钟,94℃变性1min,56℃复性1min,72℃延伸2min,30个循环后,72℃延伸10min,4℃保存;对PCR产物纯化后克隆至pGEM-T载体。

本发明的另一目的在于提供一种所述PpCER1-2基因构建的植物超表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种所述植物超表达载体的构建方法,所述植物超表达载体的构建方法包括:

根据核苷酸序列设计引物,并在上、下游引物分别引入限制性内切酶位点BamHI和SacI,上游引物序列为:CGGGATCCATGGCGACCAGGCCGGG,下游引物序列为:TCGAGCTCTCAAGCTTTCGTCAGAGGGACGA;

利用PCR从草地早熟禾cDNA中扩增完整的核苷酸序列,PCR扩增程序如下:94℃预变性2分钟,94℃变性1min,56℃复性1min,72℃延伸2min,30个循环后,72℃延伸10min,4℃保存;

对PCR产物纯化后用BamHI与Sacl酶切,胶回收,与用同样酶切的载体pCambia2301连接,获含SEQ ID NO:1的超表达重组质粒;

将含超表达重组质粒利用冻融法转入农杆菌中,挑取菌斑进行PCR检测,阳性克隆进行摇菌分装-70℃保存或直接用于植物转化。

本发明的另一目的在于提供一种所述植物超表达载体在提高禾本科植物的抗旱性中的应用。

本发明提供了PpCER1-2基因在提高禾本科植物抗旱性方面的用途;实验证明转入了PpCER1-2基因并超表达的二穗短柄草叶片角质层烷类物质增加,叶片表面水分散失减缓,叶绿素浸提率减小,其幼苗在干旱环境下的生长情况也证明了PpCER1-2基因能有效的提高植株抗旱性。禾本科植物是重要的粮食作物及园林绿地植物,通过本发明提高禾本科植物抗旱性后,可减少灌溉水的用量,同时可增强夏季高温天气下缺水引起的作物减产问题,具有好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例提供的PpCER1-2基因的构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的转PpCER1-2基因再生植株的鉴定示意图。

A为GUS染色鉴定PpCER1-2超表达转基因株系;B为qRT-PCR鉴定PpCER1-2超表达转基因株系;C为超表达植株外源基因表达分析。

图3是本发明实施例提供的超表达PpCER1-2基因二穗短柄草植株和对照植株叶片角质层蜡质组分含量比较示意图。

图4是本发明实施例提供的超表达PpCER1-2基因提高转基因二穗短柄草的抗旱性示意图;

图中:A为野生型和超表达PpCER1-2二穗短柄草植株幼苗;B为水分胁迫处理14天后的野生型植株和转基因植株表型图;左为野生型,右为转基因型。

图5是本发明实施例提供的超表达PpCER1-2基因二穗短柄草植株和对照植株叶片渗透性比较示意图;

图中:A为野生型与转基因型叶片叶绿素浸提率分析;B为野生型与转基因型叶片水分损失率分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的PpCER1-2基因的序列为:SEQ ID NO:1。

如图1所示,本发明实施例提供的PpCER1-2基因的构建方法包括以下步骤:

S101:根据草地早熟禾叶片转录组数据,设计上游引物:ATGGCGACCAGGCCGGG(SEQ ID NO:2)、下游引物:TCAAGCTTTCGTCAGAGGGACGA(SEQ ID NO:3),以草地早熟禾叶片RNA反转录合成的cDNA第一链为模板,进行PCR扩增;

S102:PCR扩增程序如下:94℃预变性2分钟,94℃变性1min,56℃复性1min,72℃延伸2min,30个循环后,72℃延伸10min,4℃保存;对PCR产物纯化后克隆至pGEM-T载体,测序获得草地早熟禾烷脱羰基酶基因PpCER1-2的编码区序列SEQ ID NO:1。

本发明实施例提供的PpCER1-2基因构建植物超表达载体的方法包括:

根据SEQ ID NO:1所示核苷酸序列设计引物,并在上、下游引物分别引入限制性内切酶位点BamHI和SacI,上游引物序列为:CGGGATCCATGGCGACCAGGCCGGG(SEQ ID NO:4),下游引物序列为:TCGAGCTCTCAAGCTTTCGTCAGAGGGACGA(SEQ ID NO:5),利用PCR从草地早熟禾cDNA中扩增完整的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,PCR扩增程序如下:94℃预变性2分钟,94℃变性1min,56℃复性1min,72℃延伸2min,30个循环后,72℃延伸10min,4℃保存。对PCR产物纯化后用BamHI与Sacl酶切,胶回收,与用同样酶切的载体pCambia2301连接,获含SEQ ID NO:1的超表达重组质粒。将含SEQ ID NO:1的超表达重组质粒利用冻融法转入农杆菌中,挑取菌斑进行PCR检测,阳性克隆进行摇菌分装-70℃保存或直接用于植物转化。

本发明实施例提供的转基因植株的获得与阳性植株鉴定方法包括:

将含SEQ ID NO:1的超表达重组质粒的农杆菌遗传转化二穗短柄草,对获得的转基因植株进行PCR阳性鉴定。取叶片少量抽提总DNA,以提取的DNA做模板,检测载体抗性标记。检测上游引物为5’TAAAGGGACCACCTATGA 3’(SEQ ID NO:6,下游引物为5’GGACGCAGAAGGCAAT3’(SEQ ID NO:7)。PCR程序如下:94℃预变性5分钟,94℃变性30s,50℃复性30s,72℃延伸40s,30个循环后,72℃延伸10min,4℃保存。然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现,检测结果见图2A。进一步对转基因植株进行GUS染色检测,取一小块叶片放入1.5mL离心管中,加入200μL的GUS染液,于37℃染色24小时,再用75%乙醇脱色,染色结果见图2B。抗性标记与GUS检测显示,重组质粒已成功转入受体植株中。然后对超表达植株外源基因表达进行检测,分别取转基因T1、T2、T3代植株叶片提取RNA,反转录cDNA,利用Q-PCR进行表达检测,检测结果见图2C。eEF-1α作为内参基因,内参上游引物为5'-AGCACGCTCTTCTTGCTTTC-3'(SEQ ID NO:8),下游引物为:5'-GGGACCTTGTCAGGGTTGTA-3'(SEQ ID NO:9)。外源基因特异引物为:上游引物5'AGAACCTCCACGCCTGCGA3'(SEQ ID NO:10),下游引物5'GCCTTGTCGACGCCGGTG3'(SEQ ID NO:11)。结果显示,转基因植株中,外源基因表达量显著上升。

下面结合转基因植株叶片蜡质组分分析对本发明的应用效果作详细的描述。

取PpCER1-2超表达株系与对照植株叶片进行蜡质组分含量分析(图3)。选取3片生长良好的植物叶片,加入试管中,添加5ml三氯甲烷涡旋30s进行蜡质提取,加入5ul浓度为1mg/ml的24烷烃作为内标,再次添加5ml三氯甲烷,涡旋提取30s。将上述提取液于装有玻璃棉和硅胶的吸管中过滤,移动过滤液至2ml内衬管置于色谱瓶,经氮吹仪蒸发干燥。加入20ul吡啶、20ul BSTFA,于70℃衍生45min;将衍生液经氮吹仪蒸发干燥,然后溶于0.5ml三氯甲烷,并进行气相色谱和质谱分析。叶片提蜡后,叶表面积采用数字化扫描仪(EPSON V750,Japan)和WinFOLIA专业叶片图像分析系统(Regent Instrument Inc,Canada)进行分析并记录。蜡质分析采用福立9790Ⅱ系列气相色谱仪分析。气相色谱(GC)毛细管柱长30m,直径0.32mm,液膜厚度0.25μm;氮气作为载气;进样量为1.5μl。柱膜和FID检测器的温度分别为300℃和320℃。程序升温方式:初始温度80℃,每分钟15℃升至260℃,保持10min;然后以每分钟2℃升温至290℃,保持1min;再以每分钟5℃的升温至320℃,并保持10min。利用气相色谱—质谱联用仪(AOC-5000Plus)鉴定蜡质组分,用HP-5MS毛细管气相色谱柱将蜡质各组分分离。分流比为10:3;m/z=789;流速1.4ml/min;氦气为载气;进样量为1.0ul。接口温度250℃。升温程序为:初温80℃,每分钟15℃升至260℃,保持10min;然后以每分钟2℃升温至290℃,保持1min,再以每分钟5℃升至320℃,并保持3min。蜡质量化基于FID峰值,根据质谱所鉴定的标准确定色谱中各种化学成分的出峰位置,用内标计算出植物单位面积的实际蜡质含量,单位为μg/cm2

下面结合转基因植株抗旱性评价对本发明的应用效果作详细的描述。

将正常条件下生长20天的二穗短柄草(包括超表达株系与野生型)进行干旱处理,停止浇水14天,期间定期观察其生长情况,并在复水后观察其生长恢复情况。结果如下:停止浇水当天基本无区别(参见图4A);停止浇水14天后,野生型幼苗大部分叶片均已干枯萎蔫(参见图4B),而转PpCER1-2基因型幼苗仍保持大部分绿叶。

干旱胁迫处理14天后,取叶片测定叶绿素浸提率。叶片冰浴30min,然后浸泡在50ml 80%的乙醇中,黑暗条件下轻轻摇晃,每隔1h测定一次,连续测定8h,24h测定最后一次。取3ml浸提液用于测定其在波长664nm和647nm下的吸光值,每次测定后的浸提液倒回相应的培养皿中。叶绿素浸提量(mmol/g)=7.93A664+19.53A647;叶绿素浸提率(%)=各时间段的叶绿素浸提量/24h叶绿素浸提量,结果见图5A。干旱胁迫处理14天后,取叶片测定水分损失率。叶片置于蒸馏水中,黑暗下放置1h,称其饱和重量,之后置于培养箱(黑暗中)失水,每隔15min取出,称其重量,150min后结束试验,70℃后烘干叶片24h,称其干重。叶片总水量=饱和重量-干重,水分损失(%)=(饱和重量-每个时间点的重量)/总水量,结果见图5B。叶绿素浸提率与水分损失率测定结果说明,与未转化植株相比,超表达转基因植株叶片渗透性降低,叶片保水力增强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>西南大学

<120>PpCER1-2基因、载体及在提高禾本科植物的抗旱性中的应用

<160> 11

<210> 1

<211> 1860

<212> DNA

<213> Poa pratensis(草地早熟禾)

<400>1

atggcgacca ggccggggcc tttgactgaa tggccatggc ataggatggg caacttcaag 60

tacctggtga tggcgccggt ggtggtccac ggcgcgcacc gtgtgatgaa caaggggtgg 120

ggcgacatcg acatcgccta cgcgctcatc ctgccgtcgc tgctgctgcg gatgatccac 180

aaccagatct ggatcagcct ctcccgctac cagaccgccc gcagcaagca ccagatcgtc 240

gaccgcccca tcgagttcga ccaggtcgac cgcgagcgcg gatgggacga ccagatcatc 300

ttcaacgggc tgctcttcta cgtgggctac ctggcgatgc cgagcgtgag ggggtacccg 360

ctgtggagga cggacggagc cgtgatgacg gcgctgctcc acgccgggcc cgtggagttc 420

ctctactact ggttccaccg cgcgctgcac caccacttcc tctactcccg ttaccactcc 480

caccaccacg cctccatcgt caccgagccc atcacctcgg ttatccatcc ttttggcgaa 540

cacattgtct atttcatgct ctttgcaatc ccgatgctgt ccacaattta catgggaaat 600

ggttctgccc tcgtctttgt gctctacatc gtttacattg acttcatgaa caacatgggg 660

cactgcaatt ttgagttggt gccgaagtgg atgttccaag ttttccctcc tctcaagtat 720

ctcatgtaca ctccatcgtt tcattctctt caccacacgc agttccgtac aaactattca 780

ctcttcatgc cattttacga ctacatatac agcactatgg acaagtcatc tgacgagctg 840

tatgagagct cactgaaagg aacagaggag acacctgacc ttgttcatct cacacatatg 900

accaacttgc agtcggccta tcatctaagg ataggattcg cctccatagc atccaaacca 960

tctgataact acgagtggta tatgtggacg ctgtggccct tggcatggct gtcaatggta 1020

gtagcatgga tttatggatc atctgcattc gtggttgaga gaatcaaact gaagaagatg 1080

aagatgcaaa catgggtcgt accgagatac aacttccaat atggtctgac atgggatagg 1140

gaatcgatca acgaattaat tgaaaaagca atattagatg ctgatataag aggggttaaa 1200

gtgctcagtc tgggactact aaatcaggaa aaacagctga atggaaatgg tgaactattt 1260

agacaaaagt atccaaaatt gggagttcga attgttgatg gaagtggatt agcaactgga 1320

gtggtcctaa aaagcatccc tttagatgca aagcaagttt ttcttcataa agggacttct 1380

aagatagccc gtgccgttgc tatgacatta tgtggcaggg gcgtccaggt aatcatgaaa 1440

cagaagaaag aatatgatat gctcaagtca cagatgccag acaacagagc aagttatttg 1500

aggtgctcca gcaatgacat aatcaagatc tggatagtag ataacatcga cgagaaagaa 1560

caaaggatgg caccaaaagg aacagtattc gttcctatat cgcagttccc ccctaagaaa 1620

gttcgcaagg actgcactta cttgagcact ccggccatga agatcccgct ggaaatgcag 1680

aacatccact cctgcgagaa ctggttgccg agaagggtga tgagcgcgtg gcatatcgct 1740

ggaatactcc acgtcctgga aggatggagc acgcacgagt gcggggacga cgtgatggac 1800

atcgagaagg catggtcggc tgctctcaga cacgggttcg tccctctgac gaaagcttga 1860

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ATGGCGACCAGGCCGGG

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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CGGGATCCATGGCGACCAGGCCGGG

<210>5

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

GGACGCAGAAGGCAAT

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<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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AGCACGCTCTTCTTGCTTTC

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<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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GGGACCTTGTCAGGGTTGTA

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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AGAACCTCCACGCCTGCGA

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<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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GCCTTGTCGACGCCGGTG

再多了解一些
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