基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及敲除人神经母细胞瘤细胞capns1基因的方法。

背景技术

钙蛋白酶(calpain)是一组高度保守的特异性ca²⁺依赖性细胞内中性蛋白酶，其活性主要与细胞内ca²⁺浓度有关。calpain在机体的生理过程中发挥着重要作用，其不仅与细胞内蛋白质的水解关，还参与细胞自噬、细胞周期调控与凋亡、细胞骨架重构、葡萄糖转运、细胞信号转导等正常的生理过程[3,4]。自在大鼠的脑组织中首次发现一种可溶的ca²⁺依赖的中性蛋白酶以来，研究者们越来越关注这种蛋白酶在体内的作用。目前，研究发现在哺乳动物中calpain存在15种亚型，其中，calpain1(μ-calpain)和calpain2(m-calpain)在体内广泛表达，且研究也较为广泛。calpain1和calpain2主要由80kd的大亚基和30kd的小亚基(calpain-s1，capns1)组成，capns1是calpain1和calpain2活性所必需的，而且也是细胞迁移，凋亡和存活所必需的。

人神经母细胞瘤细胞(humanneuroblastomacell,hnc)是研究神经系统基因功能和神经毒性机制的良好的体外模型，建立敲除capns1基因的人神经母细胞瘤细胞模型有利于对capns1蛋白的作用的进一步研究，更有利于对神经系统多种疾病机理的研究。

基因敲除是通过dna序列改变，出现基因功能的“全或无”表象。基因沉默技术是以不改变dna序列为前提，使基因沉默，即基因不表达或低表达。基因编辑技术是指在基因组水平精确地进行基因编辑，其是通过精确识别靶细胞dna片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对dna靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞dna目的基因片段的敲除、加入等过程。基因敲除构建出的突变型细胞系比基因沉默构建的细胞系稳定。细胞基因沉默的效率并不总是非常高，也不十分稳定，影响实验结果敏感性和可靠性。

继锌指核酸酶(zfn)和转录激活因子样效应物核酸酶(talens)基因编辑技术之后，第三代基因编辑技术crispr/cas技术是目前运用最为广泛的基因技术。crispr/cas是一种来源于原核生物适应性免疫系统，通过人工改良而得。相比zfn和talens，crispr/cas技术具有成本低、可同时进行多位点编辑、效率高等优势。crispr/cas系统分为3种，其中ii型最为简单，研究得也较多。该系统主要包含非特异性cas9核酸酶和sgrna两部分，其中sgrna具引导和检测作用；cas9是一种rna依赖的dna内切核酸酶，其利用单一向导rna(sgrna)使双链dna断裂，起到剪刀作用。

脱靶效应是存在于所有基因组靶向修饰技术中的一道难题，它会对基因组非特性序列进行切割，造成未知突变，增加后期的鉴定工作量。crispr/cas9系统中，对靶序列的识别主要是依靠一段20bp的短rna，但是研究表明当存在单个甚至多达5个碱基错配时，切割仍能正常发生。进一步研究发现，在这20bp中只有位于pam位点前12bp的种子序列对靶位点识别影响较大，即总共只有14bp(pam中的gg和种子序列)是靶位点识别的关键序列。这在生物体庞大的基因组中很容易出现脱靶位点，从而引入意外突变。除此之外，cas9蛋白或sgrna的浓度也对脱靶活性产生影响。

而神经细胞本身较其他细胞的培养较为苛刻，是一种转染质粒较难的细胞系，且转染效率低，而电转对神经细胞的伤害也较大，因此，对于转染条件的摸索较不易。在筛选单克隆时，神经细胞生长培养较难。综上，构建敲除人神经母细胞瘤细胞capns1基因并不容易。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于以crispr/cas技术敲除人神经母细胞瘤细胞capns1基因的方法及细胞系，其能够成功、稳定的敲除掉人神经母细胞瘤细胞中的capns1基因。

本发明提供了人capns1基因第4外显子和/或第5外显子在构建capns1基因敲除人神经母细胞瘤细胞中的应用。

本发明还提供了靶向capns1基因第4外显子的sgrna，其核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

靶向capns1基因第5外显子的sgrna，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明试验表明，采用capns1基因的第1～3外显子区域的靶位点构建出来的载体在转染细胞后，没有筛选到纯合子。而采用capns1基因的第4～5外显子的cds区作为靶点，成功地构建了capns1基因敲除sk-n-sh细胞株。

本发明还提供了如seqidno.4～9所示的核苷酸序列的6条敲除capns1基因的靶标寡核苷酸序列。

所述seqidno.4～9的核苷酸序列中，seqidno.4～5以seqidno.1为靶序列。seqidno.6～7以seqidno.2为靶序列。seqidno.8～9以seqidno.3为靶序列。

本发明还提供了敲除capns1基因的载体，包括骨架载体和dsdna片段；所述dsdna片段由seqidno.4～5退火形成；或由seqidno.6～7退火形成；或由seqidno.8～9退火形成。

本发明中，所述骨架载体为pgk1.1。

所述敲除capns1基因的载体的制备方法为，将dsdna与线性化的骨架载体t4dnaligase酶连接。

本发明还提供了敲除capns1基因的试剂，包括本发明提供的靶标寡核苷酸序列或本发明提供的敲除载体。本发明还提供了一种敲除人神经母细胞瘤细胞capns1基因的方法，将本发明提供的敲除载体转染入人神经母细胞瘤细胞中，获得敲除capns1基因的人神经母细胞瘤细胞株。

本发明中，所述人神经母细胞瘤细胞为sk-n-sh细胞。

所述sk-n-sh细胞为对数期的sk-n-sh细胞。

本发明中，所述转染采用电转染，转染的电压为1400v。

转染中，所述载体的浓度不低于1μg/μl。

以本发明提供方法构建的敲除capns1基因的人神经母细胞瘤细胞。

本发明提供了敲除人神经母细胞瘤细胞capns1基因的方法，质粒转染sk-n-sh细胞后，制备单克隆，cruiser^tmenzyme酶切后疑似为阳性克隆，单克隆测序结果显示sk-n-sh细胞capns1基因敲除细胞系构建成功；并且，在capns1^-/-组，capns1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。结果表明sk-n-sh细胞capns1基因敲除细胞系构建成功。

附图说明

图1pgk1.1质粒图谱；

图2载体酶切后的电泳检测图；其中泳道1是原质粒对照，m为marker，2-4为切开的载体

图3菌落pcr检测电泳图；m为marke菌落pcr检测电泳图k；1、2为capns1-grna1菌落pcr检测电泳图；3、4为capns1-grna2菌落pcr检测电泳图；5、6为capns1-grna3菌落pcr检测电泳图

图4sgrna测序验证；a、b、c分别代表插入pgk1.1载体的sgrna1、sgrna2、sgrna3序列测序图；

图5sgrna测序比对结果；a、b、c分别表示sgrna1位点、sgrna2位点、sgrna3位点比对结果；

图6capns1基因cruiser验证；

图7sk-n-sh细胞capns1基因敲除细胞系单克隆测序；

图8capns1基因敲除sk-n-sh细胞ta克隆测序及比对；

图9capns1敲除后capns1、calpain1和calpain2蛋白表达情况；

图10不同电压转染sk-n-sh细胞结果；

图11capns1基因敲除载体转染后的混克隆测序验证。

具体实施方式

本发明提供了以crispr/cas技术敲除人神经母细胞瘤细胞capns1基因的方法及细胞系，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1)设计crispr/cas9敲除靶位点

首先，需要在靶标dna区域中设计一对20bp左右的oligodna，通过以下在线工具设计：

麻省理工学院的crisprdesign：http://crispr.mit.edu/

选取capns1基因所有转录本公共的cds区，找出公共cds区所处的外显子进行靶位点设计，选择第四个和第五个外显子进行靶位点设计。

3个靶位点序列信息：

capns1-grna1：agttcgacactgaccgatcaggg(seqidno.1)

capns1-grna2：tgaactcccaggtgcctttgagg(seqidno.2)

capns1-grna3：cactttcatctgagtagcgtcgg(seqidno.3)

2)引物添加接头

引物合成需在靶序列头部添加额外的碱基，正向引物添加cacc，反向引物添加aaac，需要特别注意的是靶序列的第一个碱基必须是g，如果你选取的靶序列第一个碱基不是g，可自行在靶序列前加一个g，靶序列引物设计如下：

capns1-1f：caccgagttcgacactgaccgatca(seqidno.4)

capns1-1r：aaactgatcggtcagtgtcgaactc(seqidno.5)

capns1-2f：caccgtgaactcccaggtgcctttg(seqidno.6)

capns1-2r：aaaccaaaggcacctgggagttcac(seqidno.7)

capns1-3f：caccgcactttcatctgagtagcgt(seqidno.8)

capns1-3r：aaacacgctactcagatgaaagtgc(seqidno.9)

3)oligo杂交，敲除载体连接反应

将合成后的2条单链oligodna稀释成10μm，退火形成dsdna，再与线性化后的pgk1.1linearvector(cat.no.gp0134，图谱如图1)载体连接，可直接用t4dnaligase连接，退火反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于pcr仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1μl的杂交后的dsdna进行t4dnaligase连接反应，反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于pcr仪中16℃孵育30min。

pgk1.1质粒包含了含cas9核酸酶表达框和grna克隆框2个重要原件，其图谱如下，大小为10656bp。vspprimer：catatgcttaccgtaactt

gaaag序列位于载体的u6启动子区域。下游负链oligo序列即靶位点的反向互补序列，位于载体的双bbsi酶切位点。(靶位点替换双bbsi酶切位点)。载体经酶切后，获得10kb左右片段，见图2。

4)转化top10感受态

①从-80℃冰箱中取1管top10感受态，置冰上融解。

②融解后加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰上孵育30min。

③42℃水浴热击60sec，迅速拿出置冰上冷却2～3min。

④向管中加入800μl无抗soc液体培养基，至摇床(37℃/160rpm)恢复培养培养45min。

⑤4500rpm离心5min，弃去800μl上清，将沉淀悬在剩余的100μl上清中，均匀涂布于含kan抗性的的筛选平板上，倒置培养过夜。

5)筛选阳性重组子

第二天使用上游引物vspprimer与下游负链oligo引物进行菌落pcr筛选，阳性克隆pcr正确大小应为100bp，筛选到的阳性克隆抽质粒进一步测序验证。测序正确的质粒浓缩到1μg/μl浓度以上。

使用上游引物vspprimer与下游负链oligo引物进行菌落pcr筛选，均能扩增出100bp大小的片段，说明所检测单克隆全为阳性，见图3。测序发现插入序列正确，见图4。seqman软件测序比对结果正确，载体构建成功，见图5。

6)电转染靶细胞(cat.no.gp7901)

①取状态良好的对数生长期sk-n-sh细胞悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95％)。

②取5×10⁶个细胞于15ml离心管中，离心弃上清(1000rpm/4min)。

③将细胞沉淀悬浮于210μldpbs中，转移至1.5mlep管中，加入所需量构建好的敲除质粒5～8μg(质粒浓度要求1μg/μl以上)，轻轻混匀。

④将上述细胞质粒混合液用专用电转枪头转移至电击杯中，确定电击杯中溶液无气泡，且液面凸起后，盖上电击杯盖并至于电转仪，设定好电转条件后进行电转。待显示峰图正常后取出细胞液转移至六孔板培养基中(培养基需事先37℃预热且无抗生素)。

结论：1200v、1300v和1400v三个条件，1400v电转效率较高且死细胞较少，建议使用1400v。

药杀浓度结果：puro1ug/ml；

单克隆验证结果：能长成单克隆细胞，3cell/孔；图10。

7)pool细胞测序检测敲除效率

①电转72hr后，pool细胞台盼蓝计数。

②在筛选阳性克隆之前，需对pool细胞(混合克隆)的敲除效率进行体内验证。

③一般靶位点附近的序列测序中(图11)，阳性样品应在靶点位置及之后的序列中出现套峰，如敲除效率较低时，信号强度往往较低，影响判断；

根据图11的测序结果，可以看出在靶点位置及之后的序列中明显出现套峰，初步认为阳性克隆的存在。

8)单克隆的制备和生长

有限稀释法稀释细胞至10块96孔板中，37℃，co2培养箱中静置培养；一周后观察单克隆生长情况，约两周后将长起来的单克隆转移至48孔中扩大培养；当细胞长满48孔1/2时，即可取出一部分(10²～10⁴)，使用genlocitna抽提试剂盒(cat.no.gp0155,gp0156)提取细胞基因组。

9)单克隆基因组dna的提取

取10²～10⁴个细胞于1.5mlep管中，室温1500rpm离心5min，小心吸掉培养液。

加入150μlpbs重悬细胞，室温1500rpm离心5min，小心弃去上清。

重复步骤2一次。

向离心管中加入适量体积(推荐体积为50～200μl)预先配制的溶液a与溶液b的混合液，枪头吹打5次，冰上放置10min，使细胞充分裂解。

加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃条件下沉淀20min以上。

4℃，12000rpm，离心20min，弃上清。

加入400～500μl预冷的75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心10min，小心弃去上清，自然晾干(不超过5min为宜)。

加入适量体积(推荐体积为10-30μl)灭菌的双蒸水溶解沉淀，溶液可直接用于pcr反应，或于-20℃保存。

10)pcr扩增目的片段

引物设计

在敲除靶位点附近设计高特异性的primers，扩增产物长度为分别为455bp。primers引物序列如下：

capns1-seqf3：aagccatggagacactatgc

capns1-seqr3：tggtccatagaggtcatagg

pcr扩增获得杂交dna

在灭菌pcr管中配制如下反应体系，使用高特异性的primers，扩增获得野生型和突变型充分杂交的dna产物。

pcr反应程序如下：

自然冷却至40℃以下(野生型片段与突变型片段杂交)。

pcr结束后，取2～3μl进行电泳检测，要求目的片段明亮并且单一。

11)cruiser^renzyme酶切筛选阳性克隆

在灭菌pcr管中配制如下反应体系：

45℃反应20min后立即向上述10μl反应体系内加入2μl6×stopbuffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置于-20℃保存。

根据扩增引物及理论敲除位点位置，扩增产物约455bp，扩增目的大小明显变小或者可以切出条带的克隆为疑似阳性克隆。从图6可以看出，呈现的条带在400bp和500bp之间，疑似为阳性克隆。

12)测序筛选阳性克隆

对crusier酶切初步筛选出来的阳性克隆进行测序验证，进一步确认阳性克隆(图7)。ta克隆测序结果比对发现两个亲本都缺失35bp：tcagggaccatttgcagtagtgaactcccaggtgc，见图8。capns1基因敲除sk-n-sh细胞株构建成功。

13)ta克隆

对于阳性克隆中，两个等位基因突变情况不一样的阳性克隆，重新做ta克隆后送测序，跟野生型比对，确定每个等位基因的突变情况。

14)westernblot检测capns1、calpain1和calpain2蛋白表达情况

对稳定capns1基因敲除后的sk-n-sh细胞中的capns1蛋白及活性受capns1调节的calpain1和calpain2蛋白表达进行westernblot分析，结果显示，与对照sk-n-sh细胞(capns1^+/+)相比，稳定capns1基因敲除后的sk-n-sh细胞(capns1^-/-)中capns1、calpain1和calpain2的蛋白表达明显降低。见图9。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>南华大学

<120>基于crispr/cas技术敲除capns1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法

<130>mp1803791

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agttcgacactgaccgatcaggg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

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<211>25

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