一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物化学纳米材料技术领域，具体涉及一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居于所有癌症导致死亡的前列。近年来，肺癌对人类健康的威胁更是不容忽视，愈发严重。因此研究制定有效的治疗策略从而提高对肺癌的治疗力度是非常必要的。

对于肺癌的治疗，目前现有的治疗技术多采用手术治疗及放射治疗。而手术治疗存在创伤大，风险高，易产生并发症等缺陷，而放射治疗对于机体正常组织的损害则较大，而且治疗周期相对较长。单纯的靠一种治疗方式，作用效果不佳。而且容易在治疗癌症的同时，对机体造成其他的伤害，引起并发症，在具体的实验研究以及临床应用中存在不容忽视的弊端。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针及其制备方法和应用。本发明所述基因纳米探针特异性识别能力强，靶向精准，毒副作用小，对肺癌细胞的杀伤强度大，治疗效果好，在肺癌治疗的应用中具有极大的潜力。

本发明提供了一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针，所述基因纳米探针包括rna纳米水凝胶和负载在所述rna纳米水凝胶上的dox和/或tmpyp4；

所述rna纳米水凝胶包括dna自组装单链、成环dna模板和靶向适配体；

所述dna自组装单链包括核苷酸序列如seqidno.1所示的asm-dna-1、核苷酸序列如seqidno.2所示的asm-dna-2和核苷酸序列如seqidno.3所示的asm-dna-3，三条dna单链分别以序列中间为节点，两端两两互补配对，构成三叉型自组装结构；

所述成环dna模板包括5’端经磷酸化的核苷酸序列如seqidno.4所示的three-let7a、5’端经磷酸化的核苷酸序列如seqidno.5所示的three-mir34a和5’端经磷酸化的核苷酸序列如seqidno.6所示的three-mir145中的一种或多种，所述成环dna模板通过序列两端的t7启动子互补序列，与所述三叉型自组装结构的分支末端的t7启动子序列互补结合；

所述靶向适配体为seqidno.7所述序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰胆固醇的物质；所述靶向适配体通过t7启动子互补序列与成环dna模板结合。

优选的是，所述rna纳米水凝胶的粒径为80～200nm。

优选的是，所述荧光基团包括fam、fitc或cy3。

优选的是，所述基因纳米探针中rna纳米水凝胶与dox的承载体积比为(0～100)：100；所述rna纳米水凝胶与tmpyp4的承载体积比为(0～25)：5。

本发明还提供了上述技术方案所述基因纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

1)将dna自组装单链与成环dna模板于tris-hcl缓冲液中混合进行退火处理，所述退火处理的条件为：95℃，5min，再以0.5℃/min的速度降至16～28℃，得到三叉型自组装结构载体；

2)将步骤1)得到的三叉型自组装结构载体与t4连接酶及t4连接酶缓冲液混合，16℃进行成环反应，得到含有环状模板的三叉型自组装结构载体；

3)将步骤2)得到的含有环状模板的三叉型自组装结构载体与核苷酸三磷酸混合液、rna酶抑制剂和t7聚合酶及t7聚合酶缓冲液混合，37℃进行滚环转录反应0.5～3h，得到结合环状dna的载体；

4)将步骤3)得到的结合环状dna的载体与靶向适配体混合，进行退火处理，所述退火处理的条件为：65℃，5min，再以0.5℃/min的速度降至16～28℃，得到rna纳米水凝胶；

5)将步骤4)得到的rna纳米水凝胶与dox和/或tmpyp4混合，37℃反应2h，得到基因纳米探针。

优选的是，所述dna自组装单链与成环dna模板的混合体积比为1:(0.8～1.2)。

优选的是，步骤4)中所述结合环状dna的载体与靶向适配体的混合体积比为1:(90～110)。

优选的是，步骤5)所述基因纳米探针中rna纳米水凝胶与dox的承载体积比为(0～100)：100；所述rna纳米水凝胶与tmpyp4的承载体积比为(0～25)：5。

本发明还提供了上述技术方案所述基因纳米探针或上述技术方案所述制备方法得到的基因纳米探针在制备靶向抑制肺癌细胞药物中的应用。

优选的是，所述肺癌细胞包括a549细胞系。

优选的是，所述药物中基因纳米探针的有效剂量为30～150μl。

本发明提供了一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针。本发明所述基因纳米探针通过将rna纳米水凝胶和负载在所述rna纳米水凝胶上的dox和/或tmpyp4结合，形成了集基因治疗、化学药物治疗和/或光动力治疗的多重作用体系，治疗效果更好。rna纳米水凝胶能够使得所述基因纳米探针具有靶向识别作用和基因治疗作用，dox能够对肺癌起到化学治疗作用，tmpyp4能够对肺癌起到光动力学治疗。本发明所述基因纳米探针特异性识别能力强，靶向精准，毒副作用小，对肺癌细胞的杀伤强度大，治疗效果好。试验结果表明，本发明的基因纳米探针能够对靶向细胞可精准识别，并具有很好的协同治疗作用。

附图说明

图1为本发明提供的基因纳米探针合成示意图；

图2为本发明提供的rna纳米水凝胶的tem表征图；

图3为本发明提供的rna纳米水凝胶对dox及tmpyp4承载量的优化图；

图4为本发明提供的rnanhs-t与rnanhs作用于细胞后的流式细胞仪检测图；

图5为本发明提供的rnanhs-d-t在光照作用下对a549细胞治疗机制的clsm检测图；

图6为本发明提供的rnanhs-d-t与rna纳米水凝胶、dox、tmpyp4、rnanhs-d以及rnanhs–t分别作用于a549细胞后，细胞毒性的检测图；

图7为本发明提供的肺癌(a549)荷瘤小鼠经pbs(左)和rnanhs-d-t(右)给药后的活体荧光检测图；

图8为本发明提供的最终从小鼠体内剥离出来的肿瘤图片以及经过不同的注射之后相对的肿瘤体积的变化图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针，所述基因纳米探针包括rna纳米水凝胶和负载在所述rna纳米水凝胶上的dox和/或tmpyp4；所述rna纳米水凝胶包括dna自组装单链、成环dna模板和靶向适配体；

所述dna自组装单链包括核苷酸序列如seqidno.1所示的asm-dna-1、核苷酸序列如seqidno.2所示的asm-dna-2和核苷酸序列如seqidno.3所示的asm-dna-3，三条dna单链分别以序列中间为节点，两端两两互补配对，构成三叉型自组装结构；

所述成环dna模板包括5’端经磷酸化的核苷酸序列如seqidno.4所示的three-let7a、5’端经磷酸化的核苷酸序列如seqidno.5所示的three-mir34a和5’端经磷酸化的核苷酸序列如seqidno.6所示的three-mir145中的一种或多种，所述成环dna模板通过序列两端的t7启动子互补序列，与所述三叉型自组装结构的分支末端的t7启动子序列互补结合；

所述靶向适配体为seqidno.7所述序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰胆固醇的物质；所述靶向适配体通过t7启动子互补序列与成环dna模板结合。

在本发明中，所述dox为阿霉素，本发明对阿霉素的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的阿霉素常规市售产品即可。本发明所述tmpyp4为光敏剂，同理，本发明对光敏剂tmpyp4的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的光敏剂tmpyp4常规市售产品即可。在本发明中，所述基因纳米探针中rna纳米水凝胶与dox的承载体积比为(0～100)：100，更优选为80:100；本发明所述dox的浓度优选采用20μm。在本发明中，所述rna纳米水凝胶与tmpyp4的承载体积比为(0～25)：5，更优选为20:5；本发明所述tmpyp4的浓度优选采用25μm。

在本发明中，上述dna自组装单链、成环dna模板和靶向适配体涉及的核苷酸序列如表1所示：

表1基因纳米探针相关序列

在本发明中，三条所述dna自组装单链asm-dna序列的一端各带有t7启动子序列，所述成环dna模板的两端带有t7的互补序列，成环dna模板能够通过此互补序列与dna自组装单链结合。在three-let7a、three-mir34a和three-mir145三条成环dna模板序列中各自包含有相应的microrna的互补序列，故后续可通过转录过程分别产生相应的发夹rna结构，三种成环dna模板的5’端均含有磷酸基团，所述磷酸基团可使dna链两端进行连接，利于成环。本发明所述靶向适配体通过碱基配对引入了带有肺癌细胞特异性s6适配体的序列片段，该序列一端修饰有荧光基团，一端修饰有胆固醇，靶向适配体中的t7启动子互补序列能够使所述靶向适配体结合在上述转录后的发夹结构上。

本发明所述rna纳米水凝胶的成环dna模板包含有可发挥基因调控作用的microrna(let-7a和/或mir34a和/或mir145)，其中，let-7a和mir34a的存在均可以使bcl-2和c-my两种原癌基因(原癌基因会抑制肿瘤细胞凋亡)显著下调，而mir145会使oct-4表达下调，oct-4的高表达也会抑制肿瘤细胞凋亡，所以使oct-4下调，则会促使肿瘤细胞凋亡；当多种microrna同时存在于rna纳米水凝胶中时，可协同增强基因治疗的作用，且当三种microrna同时存在于所述rna纳米水凝胶中时，所述rna纳米水凝胶的调控作用最强，治疗效果也最好。本发明所述靶向适配体为序列中包含有靶向细胞的序列的适配体，能够使该水凝胶具有靶向识别作用。在本发明中，所述靶向适配体中荧光基团的加入有利于荧光成像观测；在本发明中，所述荧光基团优选包括fam、fitc或cy3，具体地，本发明实施例中具体选择fam荧光基团。在本发明中，所述靶向适配体进行胆固醇的修饰能够使其利用胆固醇的疏水性使rna纳米水凝胶结构收缩，粒径变小。在本发明中，所述rna纳米水凝胶的粒径为80～200nm，最优选为150nm。

本发明所述rna纳米水凝胶本身具备形成鸟嘌呤四链体(g4)的能力，能够为tmpyp4提供承载位点，使tmpyp4通过物理吸附作用直接嵌入到rna纳米水凝胶当中，在激光(650nm)照射条件下，tmpyp4会引起活细胞内活性氧(ros)分子生成，随后细胞死亡。dox能够与rna纳米水凝胶中双链gc或cg序列结合，通过物理吸附作用直接嵌入到rna纳米水凝胶中的双链gc或cg碱基对中，对肺癌细胞进行化学治疗。在本发明中，当所述rna纳米水凝胶同时负载dox和tmpyp4时，多重作用体系的结合能够使得基因纳米探针具有更强的药效，实现度肺癌的联合治疗作用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

1)将dna自组装单链与成环dna模板于tris-hcl缓冲液中混合进行退火处理，所述退火处理的条件为：95℃，5min，再以0.5℃/min的速度降至16～28℃，得到三叉型自组装结构载体；

2)将步骤1)得到的三叉型自组装结构载体与t4连接酶及t4连接酶缓冲液混合，16℃进行成环反应，得到含有环状模板的三叉型自组装结构载体；

3)将步骤2)得到的含有环状模板的三叉型自组装结构载体与核苷酸三磷酸混合液、rna酶抑制剂和t7聚合酶及t7聚合酶缓冲液混合，37℃进行滚环转录反应0.5～3h，得到结合环状dna的载体；

4)将步骤3)得到的结合环状dna的载体与靶向适配体混合，进行退火处理，所述退火处理的条件为：65℃，5min，再以0.5℃/min的速度降至16～28℃，得到rna纳米水凝胶；

5)将步骤4)得到的rna纳米水凝胶与dox和/或tmpyp4混合，37℃反应2h，得到基因纳米探针。

本发明所述基因纳米探针中rna纳米水凝胶的合成是基于dna自组装和滚环转录反应(rolligcircletranscription，rct)实现的，通过物理吸附作用，所述rna纳米水凝胶能够负载dox和/或tmpyp4。图1为本发明提供的基因纳米探针合成示意图。本发明图1中的基因片段和序列之间不存在任何比例关系，图片只是为了形象示意需要。

本发明将dna自组装单链与成环dna模板于tris-hcl缓冲液中混合进行退火处理，所述退火处理的条件为：95℃，5min，再以0.5℃/min的速度降至16～28℃，更优选为25℃，得到三叉型自组装结构载体。在本发明中，所述退火操作能够使得三条dna自组装单链发生自组装，形成三叉型自组装结构载体，具体地，asm-dna-1、asm-dna-2、asm-dna-3三条dna分别以中间为节点两端两两互补配对，形成“三叉型”型的自组装结构。在本发明中，所述tris-hcl缓冲液的ph值优选为7.8，所述缓冲液的浓度优选为30mm，在本发明中，所述tris-hcl缓冲液优选包括10mm的mgcl2。在本发明中，所述dna自组装单链与成环dna模板的混合体积比优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1:1，在本发明中，所述dna自组装单链和成环dna模板各自在缓冲液中的浓度优选独立地为1.0×10^-4mol/l～1.0×10^-7mol/l，更优选为1.0×10^-6mol/l。

得到三叉型自组装结构载体后，本发明将三叉型自组装结构载体与t4连接酶及t4连接酶缓冲液混合，16℃进行成环反应，得到含有环状模板的三叉型自组装结构载体。本发明对所述t4连接酶及其缓冲液的来源没有特殊的限定，采用常规市售t4连接酶及其缓冲液即可。本发明对所述t4连接酶的使用方法也没有特殊的限定，采用常规t4连接酶使用方法即可。在本发明中，三种成环dna模板的5’端均含有磷酸基团，磷酸基团可使dna链两端进行连接，利于成环；且在dna自组装单链形成的三叉型自组装结构载体分支的末端含有t7启动子序列，而成环dna模板两端具有与t7互补配对的序列，二者通过碱基配对相互作用，形成环状模版(该环状模板分别由各自的microrna互补序列及t7启动子互补序列组成)，得到含有环状模板的三叉型自组装结构载体。

得到含有环状模板的三叉型自组装结构载体后，本发明将含有环状模板的三叉型自组装结构载体与核苷酸三磷酸混合液、rna酶抑制剂和t7聚合酶及t7聚合酶缓冲液混合，37℃进行滚环转录反应1.5h，得到结合环状dna的载体。本发明对核苷酸三磷酸混合液、rna酶抑制剂和t7聚合酶及其缓冲液的来源、用量和使用方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的常规市售产品和常规用量、使用方法即可。在本发明中，所述滚环转录反应(rct)以含有环状模板的三叉型自组装结构载体为模板，通过37℃，1.5h的反应，实现成环dna模板的扩增。此成环dna模板的扩增有利于靶向适配体的结合。

得到结合环状dna的载体后，本发明将结合环状dna的载体与靶向适配体混合，进行退火处理，所述退火处理的条件为：65℃，5min，再以0.5℃/min的速度降至16～28，更优选降至25℃，得到rna纳米水凝胶。在本发明中，所述结合环状dna的载体与靶向适配体混合的体积比优选为1:(90～110)，更优选为1：100。在本发明中，所述结合环状dna的载体与靶向适配体各自的浓度优选独立地为1.0×10^-4mol/l～1.0×10^-7mol/l，更优选为1.0×10^-6mol/lmol/l。在本发明中，所述退火过程中，靶向适配体与扩增的环状dna模板中的t7启动子序列互补结合，得到rna纳米水凝胶。

得到rna纳米水凝胶后，本发明将rna纳米水凝胶与dox和/或tmpyp4混合，37℃反应2h，得到基因纳米探针。在本发明中，所述rna纳米水凝胶与dox的承载体积比为(0～100)：100，更优选为80：100。在本发明中，所述dox的浓度优选为20μm。在本发明中，所述rna纳米水凝胶与tmpyp4的承载体积比优选为(0～25)：5，更优选为20:5，在本发明中，所述tmpyp4的浓度优选为25μm。本发明在37℃反应2h后，优选对产物进行清洗，所述清洗优选采用dpbs进行清洗，所述清洗的次数优选为2～3次。

本发明还提供了上述技术方案所述基因纳米探针或上述技术方案所述制备方法得到的基因纳米探针在制备靶向抑制肺癌细胞药物中的应用。

在本发明中，所述肺癌相应的细胞系优选包括a549细胞系。本发明在验证所述rna水凝胶的作用时，优选采用以下方法：将所述rna纳米水凝胶作用于a549细胞系：将rnanhs与已培养好的a549细胞置于培养箱中孵育，培养环境条件为37℃，5％co2浓度，孵育一定的时间后，进行相关检测。

在本发明中，所述药物中基因纳米探针的有效剂量为30～150μl。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

rna纳米水凝胶的制备：

分别将用于合成三叉型自组装结构载体的三条dna单链(asm-dna-1，asm-dna-2，asm-dna-3)以及用来成环的three-let7a，three-mir34a，three-mir145三种成环dna模版混合在一起，加tris-hcl缓冲液定容至20μl，使上述物质的浓度均为1×10^-6mol/l。将上述混合液经过退火处理(95℃，5min，然后每分钟降0.5℃降至25℃)之后，三叉型自组装结构载体；

加入t4连接酶及其缓冲液置于16℃条件下进行成环，得到含有环状模板的三叉型自组装结构载体。

然后加入核苷酸三磷酸混合液(rntp)、rna酶抑制剂、t7聚合酶及其缓冲液于37℃下进行rct反应1.5h后，得到结合环状dna的载体；

以1：100的体积比将结合环状dna的载体与靶向适配体混合，进行退火处理，所述退火处理的条件为：65℃，5min，再以0.5℃/min的速度降至25℃，得到rna纳米水凝胶(rnanhs)。对得到的rna纳米水凝胶用透射电子显微镜(tem)进行表征，表征结果如图2所示，由图可知，rna纳米水凝胶呈纳米花状的水凝胶，平均粒径在150nm左右，粒径较均匀，实现了其成功合成。

基因纳米探针的制备：

将dox和tmpyp4分别用水溶解备用，将上述方法得到的rna纳米水凝胶与dox和/或tmpyp4混合，每80μlrna纳米水凝胶负载20μl25μm的tmpyp4和/或100μl20μm的dox，37℃反应2h，通过在g-四链体结果上的物理承载作用使得dox和/或tmpyp4与rna纳米水凝胶结合，用dpbs清洗，分别得到负载dox的基因纳米探针(rnanhs-d)、负载tmpyp4的基因纳米探针(rnanhs-t)和同时负载dox和tmpyp4的基因纳米探针(rnanhs-d-t)。

实施例2

进行dox及tmpyp4的承载与优化：

取25μm，5μl的tmpyp4溶液，检测其位于421nm处的紫外吸收，然后分别加入按要求比例所合成的rna纳米水凝胶不同的体积(0～20μl)，混合均匀后于37℃条件下反应2h。然后高速离心取上清液进行紫外光吸收光谱检测。

同样，类似于上述操作，在20μm，100μldox中加入不同体积(0～80μl)的rnanhs，则随着加入rnanhs量的增多，载入到上面的dox会增多，剩下的未载入到水凝胶上的dox会游离在上清液中，利用dox本身的荧光特性，取高速离心后的上清液进行荧光检测。

通过上述方法可以检测出rnanhs上所可以承载的dox及tmpyp4的最优化的量。rna纳米水凝胶对dox及tmpyp4承载量的优化结果如图3所示，其中，图3a为rnanhs对tmpyp4承载量的紫外光谱优化图，5μl25μmtmpyp4与20μl的rnanhs大致能达到完全的承载，即tmpyp4与rnanhs承载比为5:20。图3b为rnanhs对dox承载量的荧光光谱优化图。当rnanhs的体积达到80μl时，20μm，100μl的dox的荧光强度达到了相对较低的值(荧光信号值为200左右)，表明两者之间达到相对饱和的状态，即dox与rnanhs承载比为100:80。

实施例3

细胞内ros水平的检测，具体操作过程如下：

将a549细胞置于35mm的玻璃纽扣培养皿中于37℃条件下孵育12h,待细胞密度达到80％左右时分别加入含有rnanhs，rnanhs-t培养2h，随后用含有1％bsa的dpbs缓冲液清洗。然后加入用纯培养液溶解的50μmdcfh-da(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)作为分子探针培养40min之后，置于650nm激光下照射50min。最后，将细胞重悬在1mldpbs中，用流式细胞仪进行检测。

rnanhs-t与rnanhs作用于细胞后的流式细胞仪检测结果如图4所示，检测结果表明，rnanhs或rnanhs-t处理后的a549细胞荧光信号变化明显，而且rnanhs-t作用的细胞荧光信号更强一些。这是因为，由于dcfh-da可在细胞内酯酶作用下水解生成不能通透细胞膜的dcfh，当rnanhs-t携带的tmpyp4进入细胞后诱导细胞产生了ros，ros则把dcfh氧化生成有荧光的dcf，使荧光信号增强。同时也验证了rnanhs-t与rnanhs相比，rnanhs-t作用后细胞内ros的存在。荧光强度越强，则细胞内由tmpyp4诱导产生的ros越多，则更容易导致细胞死亡。

实施例4

对于dox及tmpyp4载入到rnanhs上之后对于细胞的联合作用机制，具体实验如下：

将备用的a549肺癌细胞与含有rnanhs-d-t的培养基在37℃培养箱中培养2h，然后加入无血清的纯培养基溶解的50μm的dcfh-da于培养箱中培养20min,然后在650nm激光下照射50min，同时，作为对照组，设置未经激光照射处理的细胞。两组细胞都用dapi对细胞核进行标记。最后进行激光扫描共聚焦显微镜进行成像检测。

rnanhs-d-t在光照作用下对a549细胞治疗机制的clsm检测结果如图5所示，其中，图5-1、5-3、5-5分别为未进行激光照射的dapi细胞核染色图，dox作用图，及二者叠加图；图5-2、5-4、5-6分别为进行激光照射后的dapi细胞核染色图，dox作用图，及二者叠加图。dapi的细胞核染色明显，未进行激光处理的细胞，dox主要处于细胞质中，而经过激光照射处理之后的细胞，dox则作用到细胞核的位置。这说明光照作用下，dox从rnanhs-d-t上释放，与tmpyp4同时发挥了作用。

实施例5

利用cck-8试剂盒进行细胞毒性实验：

首先在96孔板中配置100μl细胞悬液，将培养板放在37℃，5％co2培养箱中预培养24h，向培养板中加入10μl不同种类的待测药物(dox、tmpyp4、rnanhs、rnanhs-d、rnanhs-t、rnanhs-d-t)，将培养板放在培养箱中孵育一定时间后，弃掉原有的培养液换上100μl新的培养液，然后向每个孔加入10μlcck-8溶液(注意不能在孔中生成气泡，否则会影响od值的读数)，继续在培养箱中孵育一段适当的时间后，用酶标仪测定在450nm的吸光度。选择细胞悬液只加入cck-8不加入待测物质的孔作为对照孔，选择不含有细胞的培养液加入cck-8作为空白组，进行实验。最终的细胞活力％＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]×100％。

rnanhs-d-t与rna纳米水凝胶、dox、tmpyp4、rnanhs-d以及rnanhs–t分别作用于a549细胞后，细胞毒性的检测结果如图6所示，同等实验条件下，rnanhs-d-t作用后的细胞存活率明显低于rnanhs、rnanhs-d、rnanhs–t作用后的细胞存活率。即rnanhs-d-t对于靶向肺癌细胞的治疗作用效果最好。rnanhs-d和rnanhs-t相对于rnanhs来说，治疗效果稍微明显一些，但是仍不及rnanhs-d-t的最佳治疗效果。

实施例6

体内检测实验

首先建立a549细胞皮下荷瘤小鼠模型，一组设置为实验组，瘤内注射rnanhs-d-t药物，另一组作为对照组，同样注射pbs进行对比实验，两组的注射剂量均为每次注射30μl，注射频次一致。进行注射操作后，不断追踪观察，跟踪小数的肿瘤体积并记录。实验终止结束后，利用二氧化碳窒息法处死小鼠，剥离肿瘤。

肺癌(a549)荷瘤小鼠经pbs(左)和rnanhs-d-t(右)给药后的活体荧光检测结果如图7所示，肿瘤区域表现出肿瘤所带的强烈的荧光，经过rnanhs-d-t给药之后的肿瘤明显小于pbs对比给药之后的肿瘤大小。其肿瘤成像的高对比度归因于rnanhs-d-t的靶向识别以及协同治疗作用。最终从小鼠体内剥离出来的肿瘤图片以及经过不同的注射之后相对的肿瘤体积的变化结果如图8所示，其中，图8a为小鼠活体检测荧光成像图，图8b为小鼠体内肿瘤体积变化图。其中，图8a说明，肿瘤小鼠在同等实验条件下，实验组解剖所得的肿瘤明显小于对照组，二者差异显著。监测相对肿瘤体积的变化可知(图8b)，用rnanhs-d-t处理肿瘤小鼠后，其肿瘤生长明显减慢，有效评估了rnanhs-d-t对肿瘤的体内治疗效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>临沂大学

<120>一种用于靶向肺癌治疗的基因纳米探针及其制备方法和应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>57

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcgcccaggctagctacaacgactcgtgcagactataatacgactcactatagggat57

<210>2

<211>57

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

actgtgcatcagttagttgtagctagcctgggcgctaatacgactcactatagggat57

<210>3

<211>56

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tagtctgcacgagtcgtactaactgatgcacagttaatacgactcactatagggat56

<210>4

<211>118

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atagtgagtcgtattataggaaagacagtagattgtatagttatctcccagtggtgggtg60

tgaccctaaaactatacaacctactacctcatcccaaatcccaatccaatcccatccc118

<210>5

<211>119

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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