用于检测肠道病毒的核酸及其应用的制作方法

本发明涉及用于检测肠道病毒、尤其是coxa16型/ev71型/ev通用型的核酸及其应用。

背景技术

手足口病由人肠道病毒引起的儿童常见急性传染病。临床上以发热和手、足、口腔等部位皮疹或疱疹为主要特征。肠道病毒属的柯萨奇病毒(coxsackievirus)a组16、4、5、7、9、10型，b组2、5型；埃可病毒(echoviruses)和肠道病毒71型(ev71)等均能引起手足口病，其中起主要作用的为肠道病毒71型(ev71)，柯萨奇a16(ca16)。手足口病由人肠道病毒引起的儿童常见急性传染病，大多数患儿症状轻微，少数患儿可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快。为有效防止手足口病疫情扩散，相关省市卫生主管部门也启动疫情防控应急预案，力争将疫情控制到最小范围，减轻疫情危害。因此，需要开发能有效监测手足口病的的检测试剂盒。

此外，肠道病毒感染的特异性诊断方法有三种，即病毒分离鉴定、血清学检测和分子生物学技术，操作繁琐、耗时、敏感性低、特异性差，不适宜作为病毒的早期诊断。需要开发一种既能有效节约检测成本和时间又能有效监测手足口病的的检测试剂盒。

技术实现要素：

一方面，本发明提供用于检测肠道病毒(尤其是coxa16型/ev71型/ev通用型)的核酸。

用于检测coxa16型的核酸(例如引物或探针)包含来源于或用于扩增或检测coxa16型a序列或b序列的核苷酸序列。所述a序列对应于genbank登录号kc117318序列中的61－254位置，优选为：

cggagtgtttcgctcagcacttcccccgtgtagatcaggtcgatgagtcactgtaaaccccacgggcgaccgtgacagtggctgcgttggcggcctgcccatggggtaacccatgggacgctctaatacagacatggtgtgaagagtctattgagctagttagtagtcctccggcccctgaatg(seqidno:1)。

所述b序列对应于genbank登录号gb|kf055245.1|序列中的序列中的4365－4460位置，优选为：

aaggatgaacaactacatgcagttcaagagcaaacaccgtattgaacctgtatgtttaatcattagaggctccccaggaacaggtaa(seqidno:2)。

用于检测ev71型的核酸(例如引物或探针)包含来源于或用于扩增或检测ev71型a和/或b序列的核苷酸序列。所述a序列对应于genbank登录号fj606449.1序列中的5678-5783位置，优选为：

agtgatgccaccctagtgatcaacacggagcacatgccatcaatgtttgtcccggtgggtgacgttgtgcagtatggcttcttgaatctcagtggtaagcctaccc(seqidno:3)。

所述b序列对应于genbank登录号gb|kc436271.1|序列中的4288-4430位置，优选为：

tgaagtcatgtttgggaatgtgtcgtacctagcccacttctgtcgcaagttccaaccgctatacgccacggaagctaaaagagtctatgccctggagaagagaatgaataattatatgcagttcaagagcaaacaccg

(seqidno:4)。

用于检测ev通用型的核酸(例如引物或探针)包含来源于或用于扩增或检测genbank登录号gb|kf312457.1|序列中的442-566位置的核苷酸序列，优选来源于或用于扩增或检测以下序列：cccctgaatgcggctaatcccaactgcggagcacacgcccacaagccagcgggtagtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttcctt(seqidno:5)。用于检测ev通用型的核酸可以检测柯萨奇病毒(coxsackievirus)a组16、4、5、7、9、10型，b组2、5型；以及肠道病毒71型(enterovirus71，ev71)等肠病毒。

在本发明的某些实施方案中，所述核酸为用于检测肠道病毒的引物。

用于检测coxa16型病毒a序列的引物优选包含上游引物coxa16a-f5‘-cggagtgtttcgctcagcac-3’(seqidno:6)和下游引物coxa16a-r5‘-cattcaggggccggagg-3’(seqidno:7)组成的引物对。

用于检测coxa16型病毒b序列的引物优选上游引物coxa16b-f序列为5‘-aaggatgaacaactacatgcagttc-3’(seqidno:8)和下游引物coxa16b-r序列为5‘-ttacctgttcctggagagcctct-3’(seqidno:9)组成的引物对。

用于检测肠道病毒ev71型a序列的引物优选上游引物ev71a-f序列5’-aagtgatgccaccctagtgatcaa-3’(seqidno:10)和下游引物ev71a-r序列5’-gggtaggcttaccactgagattca-3’(seqidno:11)组成的引物对。

用于检测肠道病毒ev71型b序列的引物优选上游引物ev71b-f序列5’-tgaagtcatgtttgggaatgtgtc-3’(seqidno:12)和下游引物ev71b-r序列5’-cggtgtttgctcttgaactgc-3’(seqidno:13)组成的引物对。

用于检测肠道病毒通用型的引物优选上游引物ev-f序列5-cccctgaatgcggctaatc-3(seqidno:14)和下游引物ev-r序列‘5-ggaaacacggacacccaaagta-3’(seqidno:15)组成的引物对。

在另外的实施方案中，所述核酸为用于检测肠道病毒的探针。用于检测coxa16型a序列的探针优选为5’-ctcatcgacctgatctacacgggg-3’(seqidno:16)。用于检测coxa16型b序列的探针优选为5’-agcaaacaccgtattgaacc-3’(seqidno:17)

用于检测ev71型a序列的探针优选为5’-atactgcacaacgtcacccaccgg-3’(seqidno:18)。用于检测ev71型的b序列为5’-ttctgtcgcaagttccaaccgctata-3’(seqidno:19)。

用于检测肠道病毒ev通用型的探针ev-b序列为5-aactctgcagcggaacc-3(seqidno:20)。

本发明还包括上述引物序列和探针序列的等同序列，例如来源于所述基因或位置且包含所述引物或探针序列中12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个连续核苷酸的引物或探针。

另一方面，本发明还提供用于检测样品中肠道病毒coxa16、ev71、ev通用型及其组合的检测试剂盒。所述试剂盒包含至少一种如上所述的核酸。

本发明的试剂盒可以包含一种或多种引物或引物对。

本发明的试剂盒可以包含探针。所述探针可以是标记的探针。例如，所述探针用酶、放射性同位素、化学发光分子、荧光等标记。例如所述探针可以用标记有荧光淬灭基团标记，所述荧光淬灭基团标记例如为fam，vic，cy5和rox。

本发明的试剂盒可以是rt-pcr检测试剂盒。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒为用于检测coxa16和ev71的二联试剂盒。所述试剂盒优选包含由seqidno:6和7组成的引物对、和由seqidno:10和12组合的引物对。在进一步的实施方案中，所述试剂盒包含seqidno:16和18的探针。

在另一个实施方案中，本发明的试剂盒为用于检测coxa16、ev71和通用肠道病毒的三联试剂盒。所述试剂盒优选包含由seqidno:8和9组成的引物对、由seqidno:12和13组合的引物对、和由seqidno:14和15组成的引物对。在进一步的实施方案中，所述试剂盒包含seqidno:17、19和20的探针。

本发明的试剂盒优选为实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒，其中探针用淬灭基团标记，例如所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自bhq1，tamra，优选bhq1；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自fam，vic，cy5，rox。

rt-pcr在本领域众所周知。其反应条件例如为：

45℃25分钟；然后是：95℃3分钟，1个循环；95℃5秒，60℃45秒，40个循环。

本文提供的试剂盒可以检测的样品为来自肠道病毒疑似病人的咽喉拭子、泄殖腔拭子、人粪便、组织样本、血清或血浆、疱疹液、脑脊液或病毒分离培养物标本等。

荧光rt-pcr试剂盒的检测原理是，利用特异性引物和特异性荧光探针，在包含反转录酶、耐热dna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸以及镁离子等rt-pcr反应缓冲液中，扩增待检测样品中的肠道病毒，通过多种市售荧光pcr扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而快速、灵敏地检测样品中的肠道病毒。

本发明还涉及所述核酸在制备用于检测肠道病毒感染的试剂盒中的应用，所述试剂盒优选用于检测coxa16型、肠道病毒71型和/或通用肠道病毒。

本发明也涉及检测肠道病毒感染的方法，所述方法包括使用本发明的核酸通过pcr检测生物样品中是否存在肠道病毒，例如coxa16型、肠道病毒71型和/或通用肠道病毒。

附图说明

图1-5是利用用于肠道病毒coxa16型a和b序列/ev71型a和b序列/ev通用型的引物对和探针、通过实时荧光定量rt-pcr检测肠道病毒阳性样品的单联灵敏度的荧光rt-pcr扩增图。

图6-9是利用用于肠道病毒coxa16型a和b序列/ev71型a和b序列的引物对和探针、通过实时荧光定量rt-pcr检测肠道病毒阳性样品的二联灵敏度和特异性的荧光rt-pcr扩增图。

图10-13是利用肠道病毒coxa16型a和b序列/ev71型a和b序列/ev通用型的引物对和探针、通过实时荧光定量rt-pcr检测肠道病毒阳性样品的三联灵敏度和特异性的荧光rt-pcr扩增图。

图6-13显示了实施例3中利用本发明试剂盒检测的阳性样本的荧光rt-pcr扩增图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1引物和探针设计以及反应体系的建立和优化：

1.引物和探针设计：

通过分别对所有已知的coxa16型、ev71型及其它肠道病毒基因序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，不同引物探之间不会发生聚合反应，针对不同的肠道病毒设计特异性引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

肠道病毒coxa16型a序列的引物及探针：

上游引物coxa16a-f序列为5‘-cggagtgtttcgctcagcac-3’

下游引物coxa16a-r序列为5‘-cattcaggggccggagg-3’

探针coxa16a-b序列为fam5’-ctcatcgacctgatctacacgggg-3’bhq1。

肠道病毒coxa16型b序列的引物及探针：

上游引物coxa16b-f序列为5‘-aaggatgaacaactacatgcagttc-3’

下游引物coxa16b-r序列为5‘-ttacctgttcctggagagcctct-3’

探针coxa16b-b序列为fam5’-agcaaacaccgtattgaacc-3’mgb。

肠道病毒ev71型a序列的引物及探针：

上游引物ev71a-f序列为5’-aagtgatgccaccctagtgatcaa-3’

下游引物ev71a-r序列为5’-gggtaggcttaccactgagattca-3’

探针ev71a-b序列为vic5’-atactgcacaacgtcacccaccgg-3’。

肠道病毒ev71型b序列的引物及探针：

上游引物ev71b-f序列为5’-tgaagtcatgtttgggaatgtgtc-3’

下游引物ev71b-r序列为5’-cggtgtttgctcttgaactgc-3’

探针ev71b-b序列为vic5’-ttctgtcgcaagttccaaccgctata-3’。

肠道病毒通用型引物及探针：

上游引物ev-f序列为5-cccctgaatgcggctaatc-3

下游引物ev-r序列为5-ggaaacacggacacccaaagta-3’

探针ev-b序列为cy55-aactctgcagcggaacc-3mgb。

2.肠道病毒实时荧光rt-pcr反应体系的建立和优化：

靶区域模板以如下方法获得：利用灭活的肠道病毒株作为待检样品，用酚氯仿的提取方法提取病毒基因组核酸，分装后储存于－20℃备用。

2.1引物浓度的优化在反应体系中，将肠道病毒coxa16型/ev71型/ev通用型的引物浓度分别从0.1μmol/l至0.6μmol/l作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定coxa16型/ev71型/ev通用型最佳引物终浓度分别为0.25μmol/l、0.25μmol/l、0.2μmol/l。

2.2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将mgcl2的浓度从1.5mmol/l至3.5mmol/l以0.5mmol/l递增，经过多次重复实验选定2.0mmol/l为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。

2.3taqdna聚合酶(taq酶)用量的优化通过比较taq酶用量(以单位unit计)的优化实验结果，选定3u作为试剂盒反应体系中taq酶的用量。

2.4反转录酶用量的优化通过比较反转录酶用量(以单位unit计)的优化实验结果，选定4u作为试剂盒反应体系中反转录酶的用量。

2.5dntps浓度的优化通过使用不同浓度的dntps进行检测，综合评估后选0.2mmol/l作为试剂盒反应体系中dntps的使用量。

2.6探针浓度的优化在反应体系中，将肠道病毒coxa16型/ev71型/ev通用型的探针浓度分别从0.05μmol/l至0.2μmol/l作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定coxa16型/ev71型/ev通用型最佳探针终浓度为0.12μmol/l、0.12μmol/l、0.1μmol/l。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光rt-pcr反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1优化后的rt-pcr反应体系

注：a.在荧光rt-pcr反应体积不同时，各试剂应按比例调整。

b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光rt-pcr反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

4.rt-pcr条件选择如下：

45℃反转录25分钟；然后是：95℃3分钟，1个循环；95℃10秒，60℃45秒，40个循环。

实施例2检测coxa16型、ev71型及肠道病毒的拷贝数的灵敏度实验

本实施例用于检验coxa16型/ev71型二联试剂盒和coxa16型、ev71型及肠道病毒三联试剂盒的灵敏度。coxa16型/ev71型二联试剂盒含有用于检测coxa16型a序列和ev71型a序列的引物和探针，即含有：包含：由seqidno:6和7组合的引物对、由seqidno:10和11组成的引物对、由seqidno:16组成的探针和由seqidno:18组成的探针。coxa16型、ev71型及肠道病毒三联试剂盒含有用于检测coxa16型b序列、ev71型b序列和通用肠道病毒的引物和探针，即含有：由seqidno:8和9组合的引物对、由seqidno:12和13组成的引物对、由seqidno:14和15组成的引物对、由seqidno:17组成的探针、由seqidno:19组成的探针和由seqidno:20组成的探针。

将浓度为10⁶个拷贝/ml的中国生物制品检定所提供的coxa16型、ev71型及其它肠道病毒株，按10倍梯度稀释到10⁵个拷贝/ml、10⁴个拷贝/ml、10³个拷贝/ml、10²个拷贝/ml，采用实施例1中设计的引物、探针以及建立的反应体系和仪器、扩增条件，进行荧光rt-pcr检测。

结果表明，在10³个拷贝/ml时，ct值为32，其它各项指标也符合检测要求。因此，本发明通过优化引物和探针，提高了检测的灵敏度，其灵敏度可以达到10³个拷贝/ml。结果见图1-5。

实施例3检测coxa16型、ev71型及肠道病毒的特异性实验

本实施例用于检验实施例1中所提供的引物和探针检测相关肠道病毒的特异性，还检测了所述coxa16型/ev71型二联试剂盒和coxa16型、ev71型及肠道病毒三联试剂盒的特异性。。

1.样本：

检测样本80人份，其中包括经深圳疾病预防控制中心推荐方法确定为coxa16型患者20例，ev71型患者24例，其它肠道病毒16例，为阳性样本；另20例为阴性样本。这80例样本为咽喉拭子。样本处理：在装有拭子的离心管中加入500μlpbs或生理盐水，剧烈振荡35sec。尽量挤出液体移到离心管中8000rpm离心25sec，取上清备用。

阴性对照：depc水；

2.检验条件

试剂：所用实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒肠道病毒rna提取液，为trizolreagent总rna提取试剂(购自invitrogen)。

仪器：ab7500荧光定量仪，由本实验室提供。

3.模板rna的提取

(1)取1.5ml经灭菌的无rna酶污染的离心管，作好标记。首先各加入600μl肠道病毒rna提取液，然后分别加入相应编号的经前处理的检测样本以及阴、阳性对照各200μl，吸打混匀；再加入200μl氯仿，振荡混匀；静置3min，12,000rpm离心10min；

(2)分别吸取各管中的上层液相转移至新的1.5ml无rna酶污染的离心管中，加入400μl-20℃预冷的异丙醇，作好标记，颠倒混匀；静置6min，12,000rpm离心10min；

(3)轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入700μl75％乙醇，颠倒洗涤；12,000rpm离心6min；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体；

(4)4,000rpm离心10sec，用微量加样器尽量将残余液体吸干，室温干燥1-5min；

(5)加入15μldepc水，轻弹混匀，溶解管壁上rna，保存于-18℃以下备用。

4.检测程序

荧光rt-pcr反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

在ab7500荧光定量仪上进行检测。rt-pcr条件为：45℃反转录25分钟；然后是：95℃3分钟，1个循环；95℃10秒，60℃45秒(收集荧光fam、vic、cy5)，40个循环。

5.检测结果

80份样品实时荧光rt-pcr检测试剂盒的检测结果(检出率)见下表2。其中所述二联和三联试剂盒的阳性样本的荧光rt-pcr扩增图见图6-13。

表2

注释：“-”表示未进行测定。

“coxa16-a”表示使用用于检测coxa16a序列的引物对(seqidno:8和9)和探针(seqidno:16)。

“coxa16-b”表示使用用于检测coxa16b序列的引物对(seqidno:10和11)和探针(seqidno:17)。

“ev71-a”表示使用用于检测ev71a序列的引物对(seqidno:10和11)和探针(seqidno:18)。

“ev71-b”表示使用用于检测ev71b序列的引物对(seqidno:12和13)和探针(seqidno:19)。

“ev通用”表示使用引物对(seqidno:14和15)和探针(seqidno:20)。

其它肠道病毒阳性样品。

本发明提供的检测试剂盒(荧光rt-pcr法)在疾控中心肠道病毒阳性样品中的检出率：肠道病毒coxa16型20/20＝100％；肠道病毒ev71型24/24＝100％；其它肠道病毒16/16＝100％；

本发明提供的检测试剂盒(荧光rt-pcr法)在疾控中心肠道病毒阴性样品中的检出率：20/20＝100％；

本发明提供的检测试剂盒(荧光rt-pcr法)在疾控中心肠道病毒样品检出符合率：(20+24+16)/80＝100％。

对疾控中心肠道病毒检测标本的检测结果表明：20份肠道病毒coxa16型阳性标本，24份肠道病毒ev71型阳性标本和16份其它肠道病毒阳性标本中，本发明提供的检测试剂盒(荧光rt-pcr法)检测出结果与以上结果一致，符合率100％。说明本发明核酸检测试剂盒(荧光rt-pcr法)检测结果与实际相互合，结果准确可信，符合临床检测的要求。

本发明的优点：

(1)本发明提供的荧光rt-pcr试剂盒的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

(2)本发明提供的引物和探针对于不含有肠道病毒的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。

(3)由于本发明分别对所有已知的肠道病毒序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。

(4)当采用荧光pcr技术作为检测方法时，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如pcr－电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对pcr产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。