一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，尤其涉及一种hemi-m甲基化修饰引物及其应用。
背景技术：
在表观遗传学中，甲基化是目前研究中相对较为深刻的。dna的甲基化水平可以决定一个或者一类基因的表达或者抑制，对于细胞功能正常与否有着重要作用，进而影响人类的生命进程。所以，甲基化研究是表观遗传学研究的热门领域之一。基因组dna水平的甲基化是在dna甲基转移酶的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将一个甲基添加到胞嘧啶5’-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，原理如图1所示。cpg岛(cpgisland)是富含cpg二核苷酸的一些区域，长度为300—3000bp，cpg是胞嘧啶(c)—磷酸(p)—鸟嘌呤(g)的缩写，位于转录起始位点上游的启动子区域，看家基因的启动子cpg岛保持非甲基化状态，以保证看家基因的正常表达。组织特异性基因的cpg相对较少，并且在大多数组织中都处于甲基化状态。当启动子区域的cpg被甲基化时，转录受到抑制，该区域的cpg甲基化密度与转录抑制的程度有关。肿瘤组织中存在着基因组普遍低甲基化和局部区域过甲基化。抑癌基因启动子区域cpg岛过甲基化是许多肿瘤发生的早期重要事件，抑癌基因启动子区域cpg岛过甲基化可致使相关基因表达下调，甚至不表达，从而影响细胞内及细胞间正常生长凋亡。原癌基因的低甲基化，可以引起原癌基因的转录激活，同时也能影响临近基因的正常表达。dna的去甲基化破坏基因组印记，增加了患癌风险。目前的甲基化研究方法中，主要包含：甲基化特异性pcr、重亚硫酸盐测序法、高分辨率溶解曲线法、基因组直接测序法等。最常用的方法是重亚硫酸盐的方法。该方法中，在重亚硫酸盐的作用下，dna中未被甲基化修饰的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，通过高通量测序检测出未被转化的胞嘧啶(c)，即为被甲基化修饰。cn105002567a提供了一种无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，对样品基因组酶切和加a，获得5’末端具有磷酸化修饰和3’粘性末端a的dna片段，将其与含有不同条形码序列的甲基化接头相连；连接产物分为两组，一组进行pcr扩增，另一组经重亚硫酸盐转化后再扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；两组pcr产物分别混合，选择相同的特定长度片段序列进行低循环pcr，扩增产物分别分离纯化构建高通量简化甲基化测序文库。该方法通量高、成本低、序列一致，无需参考基因组，在大量无参考基因组或参考基因组组装不全物种的dna甲基化表观遗传学研究领域应用前景广阔。cn104532360a提供了一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法。该构建方法包括以下步骤：s1，对全基因组dna进行片段化，得到dna片段；s2，采用由datp、dttp和dgtp混合形成的dntp对dna片段进行末端修复，得到修复片段；s3，对修复片段进行3’末端加“a”，得到3’末端带“a”片段；s4，采用经过“c”到“t”转化处理的接头序列对3’末端带“a”片段进行接头连接，得到带接头片段；s5，对带接头片段进行“c”到“t”转化处理，得到处理片段；s6，对处理片段进行扩增，得到全基因组甲基化测序文库，通过采用不含dctp的dntp进行末端修复，避免了非甲基化c的引入，提高了甲基化程度分析的准确性。但是，目前的研究中，只能将序列比对到基因组上，才能得知甲基化位点。还没有一种方法可以是自身作为对照进行甲基化位点定位分析。因此，提供一种甲基化修饰引物并用于以自身为对照进行甲基化位点分析，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种hemi-m甲基化修饰引物及其应用，本发明通过设计特异性的甲基化修饰引物，巧妙地与dctp被mdctp替代的dntp相结合，对样本dna进行胞嘧啶保护，创造性地将其应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库dna自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种hemi-m甲基化修饰引物，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶；其中，所述甲基化修饰包括：甲基化、羟甲基化等不能够被重亚硫酸盐处理转化为尿嘧啶(u)的修饰。所述hemi-m为甲基化hemi-methylation的缩写。在本发明中，发明人通过深入研究甲基化在表观遗传学中的作用，广泛探究甲基化研究方法的优缺点，发现甲基化检测的常用方中法，只能将序列比对到基因组上，才能得知甲基化位点，还没有一种方法可以是自身作为对照进行甲基化位点定位分析，因此结合甲基化反应的特性与测序文库的要求，通过大量创造性实验，最终摸索设计得到了一种甲基化修饰引物，能够应用于甲基化检测领域，对dna链中的胞嘧啶(c)进行甲基化保护，产生一条链正常，另一条链胞嘧啶(c)全部被甲基化胞嘧啶(mdc)代替，从而解决文库dna自身对比分析的问题，更好的定位甲基化位点。第二方面，本发明提供一种pcr方法，所述方法为：采用如第一方面所述的甲基化修饰引物进行pcr扩增反应，对样本dna链进行胞嘧啶保护，其中，所述pcr扩增的dntp中的dctp被mdctp替代。优选地，所述pcr扩增的反应循环数为1-3个循环，例如可以是1个、2个或3个循环。具体地，所述方法为：将如第一方面所述的甲基化修饰引物与dntp(含甲基化的mdctp，不含未甲基化的dctp)进行甲基化文库构建的ct转化步骤前的扩增反应，对dna互补链进行胞嘧啶保护。第三方面，本发明提供一种甲基化文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：(1)将dna样品进行末端修复，3’端加a，甲基化接头连接；(2)将步骤(1)处理后的产物采用第一方面所述的甲基化修饰引物进行胞嘧啶保护；(3)将步骤(2)处理后的产物进行重亚硫酸盐处理；(4)将步骤(3)处理后的产物进行扩增添加索引序列，得到所述甲基化文库。优选地，若步骤(1)所述的dna样品为gdna，所述方法还包括对dna样品进行片段化处理的步骤。本发明中，若步骤(1)所述的dna样品为cfdna，则可以直接用于步骤(1)。优选地，所述步骤(1)之前还包括引入标签的步骤。优选地，所述标签的结构为反向互补，正链3’端突出，5’端未被磷酸化，负链5’端被磷酸化。优选地，所述3’端突出为悬突胸腺嘧啶。优选地，所述标签含有鸟嘌呤和胞嘧啶，且与第一方面所述的甲基化修饰引物结合于同一条dna链上，且标签序列的所有胞嘧啶全部被甲基化修饰。优选地，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到dna片段两端。优选地，所述标签为一条oligo退火形成的茎环结构，且3’端突出，5’端磷酸化。优选地，所述标签为两条oligo退火形成两端或一端互补配对，且3’端突出，5’端磷酸化。本发明中，所述标签存在三种情况，当一条链退火形成茎环结构；第二种情况：当两条链发生两端互补配对时形成结构；第三种情况：当两条链发生一端互补配对形成结构，三种情况示意图如图5。优选地，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到dna片段两端，经过处理后形成5’端突出，延伸后形成两端为平末端带标签的dna片段。本发明中，步骤(4)所述索引序列与甲基化标签不同，用于区分不同的样本；因为不同的样本混合后共同检测，需要此索引序列区分不同的样本，是构建二代测序文库时均需添加的序列。第四方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的甲基化修饰引物。第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的甲基化修饰引物和/或如第四方面所述的试剂盒用于制备检测癌症的药物和/或试剂。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的甲基化修饰引物，通过与dctp被mdctp替代的dntp相结合，对样本dna进行胞嘧啶保护，应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库dna自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，减少将测序结果比对回基因组序列的复杂过程，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。附图说明图1为本发明中基因组dna甲基化的原理图；图2为本发明中随机标签(barcode1)引入dna片段两端的示意图；图3为本发明中利用甲基化修饰引物进行胞嘧啶保护的示意图；图4为本发明中的随机标签(barcode2)引入dna片段两端的示意图；图5为本发明中的引入标签的三种情况示意图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例中，相关术语解释：(1)甲基化标签：反向互补双链结构，正链的5’端磷酸修饰(p○)；当两条链退火后，负链在3’端悬突胸腺嘧啶。(2)甲基化修饰引物：引物序列中，胞嘧啶被甲基化处理为5-甲基胞嘧啶(5-mdc)。(3)mdc：无特殊说明，mdc指5-甲基胞嘧啶。(4)barcode：随机标签。(5)甲基化引物：引物序列中，所有的胞嘧啶被甲基化修饰。(6)纯化：如无特殊标注，实施例中的“纯化”指的是磁珠纯化。(7)退火：两条全部或部分反向互补的dnaoligo在一定反应条件下，结合为双链dna。(8)加a：在dna片段3’末端加上一个腺嘌呤碱基。实施例1(1)一种甲基化修饰引物，所述引物序列如seqidno.1所示：所述seqidno.1如下：引物1：5’ga/mdc/tggagtt/mdc/aga/mdc/gtgtg3’所述引物修饰方法如下：上述甲基化引物序列中，所有胞嘧啶(c)在合成时全部被修饰为5-甲基胞嘧啶(mdc)。(2)样本处理：若被处理样本为gdna，利用neb公司的片段化酶将2μg样本gdna片段化处理，通过磁珠或者切胶的方法选择100-250bp的dna片段，片段化酶处理条件：37℃，43min，将片段选择后的dna用30μl去离子水溶解；若被处理样本为cfdna，可以直接用于后续实验过程。(3)利用试剂盒neb文库准备试剂盒进行dna末端修复，3’端加a，甲基化接头连接。(4)胞嘧啶(c)保护：将甲基化接头连接后的纯化产物按表1所示体系进行反应：表1pcr循环条件如表2：表2温度/℃时间9545s6130s685min4保持(5)对上述产物进行纯化，纯化后按照zymodna重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理、纯化。(6)终文库扩增加索引序列：将上述纯化产物按表3所示体系进行反应：表3pcr循环条件如表4所示，：95℃-30s，[95℃-15s，61℃-30s，68℃-30s]15-18个循环，68℃-5min，4℃-保持。表4(7)对上述产物进行纯化，-20℃保存。实施例2(1)一种甲基化标签，所述甲基化标签正链与负链的核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示：seqidno.2即barcodef：5’nnnnnnnntgaat3’seqidno.3即barcoder：5’-tt/mdc/annnnnnnn3’其中，barcodef与barcoder反向互补，barcoder的5’端磷酸修饰当两条链退火后，barcodef在3’端悬胸腺嘧啶，5’端不进行磷酸化处理。将barcodef与barcoder退火为标签barcode1，barcode1为双链oligo,每条链的序列即seqidno.2和no.3相同，只是两条链互补形成双链结构。(2)一种甲基化修饰引物，所述引物序列如下：seqidno.1即primer1：5’ga/mdc/tggagtt/mdc/aga/mdc/gtgtg3’所述引物修饰方法如下：上述甲基化引物序列中，所有胞嘧啶在合成时全部被修饰为5-甲基胞嘧啶(mdc)。(3)样本处理：若被处理样本为gdna，利用neb公司的片段化酶将2μg样本gdna片段化处理，通过磁珠或者切胶的方法选择100-250bp的dna片段，片段化酶处理条件：37℃，43min。将片段选择后的dna用30μl去离子水溶解；若被处理样本为cfdna，可以直接用于后续实验过程。(4)片段化dna末端修复，3’端加a：利用试剂盒neb文库准备试剂盒进行dna末端修复，3’端加a。(5)标签barcode1连接：上述产物不需经过纯化，按表5所示体系进行反应，示意图如图2所示：表5组分体积μl上一步处理后的dna60barcode12.5连接混合体系30连接提高剂1共计93.5(6)将上述产物进行纯化，利用试剂盒neb文库准备试剂盒进行dna末端修复，3’端加a，甲基化接头连接。(7)胞嘧啶保护：将甲基化接头连接后的纯化产物按表6所示体系进行反应，示意图如图3所示：表6组分体积μl甲基化接头连接的dna30引物12.5dntp(mdctp替代dctp)(10mm)15×epimark热启动taq酶反应缓冲液10epimark热启动taq酶(2units/μl)0.25ddh2o加至50pcr循环条件如表7所示：表7温度/℃时间9545s6130s685min4保持(8)对上述产物进行纯化，纯化后按照zymodna重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理、纯化。(9)终文库扩增加索引序列：将上述纯化产物按表8所示体系进行反应：表8pcr循环条件如表9所示：表9(10)对上述产物进行纯化，-20℃保存。实施例3(1)一种标签，所述标签的核苷酸序列如seqidno.4所示：seqidno.4即oligo：5’-catag/du/nnnnnnnnctatgt3’oligo的5’端磷酸化修饰，且5’端五个碱基与3’端反向互补，退火后形成茎环结构，且3’端悬突胸腺嘧啶的标签barcode2，，所示barcode2的核苷酸序列序列即seqidno.4，只是退火后自身互补形成茎环结构：(2)一种甲基化修饰引物，所述引物序列如下：seqidno.1即primer1：5’ga/mdc/tggagtt/mdc/aga/mdc/gtgtg3’所述引物修饰方法如下：上述甲基化引物序列中，所有胞嘧啶(c)在合成时全部被修饰为5-甲基胞嘧啶(mdc)。(3)样本处理：若被处理样本为gdna，利用neb公司的片段化酶将2μg样本gdna片段化处理，通过磁珠或者切胶的方法选择100-250bp的dna片段，片段化酶处理条件：37℃，43min。将片段选择后的dna用30μl去离子水溶解；若被处理样本为cfdna，可以直接用于后续实验过程。(4)片段化dna末端修复，3’端加a：利用试剂盒neb文库准备试剂盒进行dna末端修复，3’端加a。(5)标签barcode2连接：上述产物不需经过纯化，按表10所示体系进行反应，示意图如图4所示：表10组分体积μl上一步处理后的dna60barcode22.5连接混合体系30连接提高剂1共计93.5(6)在上述产物中加入3μl的user酶和3μl的虾碱性磷酸酶(rsap)，37℃反应30min。(7)标签延伸：将上述产物纯化后按表11所示体系进行反应：表11组分体积μlbarcode2连接的dna30dntp(mdctp替代dctp)(10mm)15×epimark热启动taq酶反应缓冲液10epimark热启动taq酶(2units/μl)0.25ddh2o加至50pcr循环条件：95℃-45s，61℃-30s，68℃-5min，4℃-保持。(8)对上述产物进行纯化，利用试剂盒neb文库准备试剂盒进行dna末端修复，3’端加a，甲基化接头连接。胞嘧啶保护：将甲基化接头连接后的纯化产物按表12所示体系进行反应：表12组分体积μl甲基化接头连接的dna30引物12.5dntp(mdctp替代dctp)(10mm)15×epimark热启动taq酶反应缓冲液10epimark热启动taq酶(2units/μl)0.25ddh2o加至50pcr循环条件如表13所示：表13温度/℃时间9545s6130s685min4保持(9)对上述产物进行纯化，纯化后按照zymodna重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理、纯化。(10)终文库扩增加索引序列：将上述纯化产物按表14所示体系进行反应：表14组分体系μl修改后dna30nebnext通用pcr引物2.5nebnext索引(x)引物2.5dntp(10mm)15×epimark热启动taq酶反应缓冲液10epimark热启动taq酶(2units/μl)0.25ddh2o加至50pcr循环条件如表15所示：表15(11)对上述产物进行纯化，-20℃保存。综上所述，本发明提供的一种hemi-m甲基化修饰引物及其应用，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶，其中，所述甲基化修饰包括甲基化和/或羟甲基化修饰；本发明通过设计特异性的甲基化修饰引物，巧妙地与dctp被mdctp替代的dntp相结合，对样本dna进行胞嘧啶保护，创造性地将其应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库dna自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，减少将测序结果比对回基因组序列的复杂过程，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>深圳市海普洛斯生物科技有限公司<120>一种hemi-m甲基化修饰引物及其应用<130>2018年<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>26<212>dna<213>人工合成<400>1gamdctggagttmdcagamdcgtgtg26<210>2<211>13<212>dna<213>人工合成<220><221>misc_feature<222>(1)..(8)<223>nisa,c,g,ort<400>2nnnnnnnntgaat13<210>3<211>14<212>dna<213>人工合成<220><221>misc_feature<222>(7)..(14)<223>nisa,c,g,ort<400>3ttmdcannnnnnnn14<210>4<211>21<212>dna<213>人工合成<220><221>misc_feature<222>(8)..(15)<223>nisa,c,g,toru<400>4catagdunnnnnnnnctatgt21当前第1页12