一种沙门氏菌的检测方法及其应用与流程

文档序号:15457512发布日期:2018-09-15 01:31

本发明属于生物技术领域,涉及食源性疾病的致病菌—沙门氏菌的检测,具体涉及一种沙门氏菌的检测方法及其应用。



背景技术:

沙门氏菌(Salmonella)是一百多年前发现的一种病原体,其是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科的一个大属,其菌型繁多,分布广泛,是常见的重要的人畜共患病病原菌之一,也是引起人发生食物中毒最常见的病原菌,它不仅可以引起胃肠炎,还会引起伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种症候群。据统计,在世界各国的细菌性食物中毒中,沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首,在我国,以沙门氏菌引起的食物中毒也排在细菌性食物中毒的首位,沙门氏菌是监测食品卫生状况的重要指标菌,一旦发现食品污染沙门氏菌,表明监测的食品卫生不合格。食品及其原料中沙门氏菌的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.。

目前,世界各国对食源性沙门氏菌的检测方法及限量标准均制定出了非常严格的规定,使受污染的食品能够得到及时处理,以保障食品质量及食品安全。然而,包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的临床检测仍然采用传统的培养方法,这种常规的沙门氏菌检测存在操作繁琐、检测时间长、结果判定误差大等诸多弊端,已经远远不能满足现代快速检测诊断的需要。近年来,沙门氏菌检测技术有了很大的进展,由十分困难的传统分离培养法到免疫学检测方法发展成为今天的分子生物学检测技术,例如黄金海等人研究的环介导等温扩增技术(LAMP)对沙门氏菌进行检测(“食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立”,《天津大学学报》,2012年05期),钟伟军等人研究了食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立(“食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立”,《中国人兽共患病学报》,2007年第12期),然而以上分子检测方法均需要昂贵的设备,并且在结果判定方面不直观,需要借助一定的设备才能判断。



技术实现要素:

基于现有沙门氏菌分子检测方法的不足,本发明旨在提供一种沙门氏菌的检测方法及其运用,该沙门氏菌的检测方法操作简单,灵敏度高,特异性高,特别适合基层食品安全的检测。

为实现本发明的目的,解决现有技术中存在的技术问题,本发明采用了如下技术方案:

一种沙门氏菌的检测方法,包括如下步骤:

步骤一,制备探针分子:根据沙门氏菌的基因组结构和保守序列,选取沙门氏菌的invA基因作为检测目标片段,根据GenBank: EU348365公开的沙门氏菌invA基因序列,设计探针分子,所述探针分子序列为5’-GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT-3’,所述探针分子的5’端采用报告荧光基团进行标记,即探针分子结构为:报告荧光基团- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;

步骤二,将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子:报告荧光基团- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT混合,然后加入待测样品,检测荧光。

其中,步骤一中所述的报告荧光基团优选为异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、四甲基罗丹明(TAMRA)、ROX、CY3、CY5、CY5.5、CAL red、Red640和Texas Red等。

其中,步骤二中所述的聚苯乙烯纳米球由以下方法制备得到:将0.05g过硫酸氨和0.05g十二烷基磺酸钠溶解到10mL水中,再加入12mL苯乙烯,将反应物加热一段时间,然后将产物离心,用甲醇冲洗移除SDS,即制得聚苯乙烯纳米球。

在本发明结果判定过程中,分别设置阳性对照组和阴性对照组,根据样品检测荧光的强度判断样品中是否存在沙门氏菌。

本发明还请求保护一种用于沙门氏菌检测的试剂盒,其包括:探针分子溶液、聚苯乙烯纳米球溶液、阳性对照质粒、阴性对照,其中所述探针分子的结构为:报告荧光基团- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT。

本发明还请求保护所述的沙门氏菌的检测方法或用于沙门氏菌检测的试剂盒在用于食品中沙门氏菌的检测,所述的食品为肉类食品、乳制品或果蔬制品,其中肉类食品优选为鲜肉制品,所述乳制品优选为鲜牛乳,所述新鲜果蔬制品优选为新鲜果蔬或者鲜榨果蔬汁。

基于以上技术方案,本发明所使用的沙门氏菌的检测方法成本低廉,其是将靶核酸分子特异性结合探针分子吸附在聚苯乙烯纳米球表面,淬灭探针分子的荧光,然后,当探针分子与待测样品中的DNA分子混合,杂交形成双链时,探针分子从聚苯乙烯纳米球表面脱离,荧光淬灭效应消失,通过检测荧光信号实现对待测样品的检测,根据荧光的强度变化还可确定待测样品中靶核酸分子的含量。该方法实现起来十分简单,不需要使用昂贵的PCR仪器以及昂贵的ELISA检测试剂,仅需简单的荧光检测设备即可实现结果的检测和分析,检测时间短、灵敏度高,可以广泛用于食品安全检测,特别是基层食品卫生监督部门的食品安全检测。

附图说明:

图1:检测试验结果。采用实施例1的方法对阳性对照和阴性对照进行了试验,其中a为探针DNA(25nM)的荧光发射光谱,b为探针DNA(25nM)+阳性对照质粒(来自实施例3,50nM)的荧光发射光谱,c为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+去离子水的荧光发射光谱,d为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒(来自实施例3,50nM)的荧光发射光谱,e为聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱。其中纵轴为荧光强度,横轴为检测波长。

图2:灵敏度检测结果。其中a为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液++阳性对照质粒(1倍稀释)的荧光发射光谱,b为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒(10倍稀释)的荧光发射光谱;c为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒(100倍稀释)的荧光发射光谱;d为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒(1000倍稀释)的荧光发射光谱,凝胶电泳的M、1-4泳道分别对应为macker,1倍稀释、10倍稀释、100倍稀释和1000倍稀释。其中纵轴为荧光强度,横轴为检测波长。

具体实施方式:

实施例1:一种沙门氏菌的检测方法,包括如下步骤:

步骤一,制备探针分子:根据沙门氏菌的基因组结构和保守序列,选取沙门氏菌的invA基因作为检测目标片段,根据GenBank: EU348365公开的沙门氏菌invA基因序列,设计探针分子,所述探针分子序列为5’-GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT-3’,所述探针分子的5’端采用报告荧光基团FAM进行标记,即探针分子结构为:FAM- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;

步骤二,将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子:FAM- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT混合,然后加入待测样品,检测荧光。

实施例2:一种沙门氏菌的检测方法,包括如下步骤:

步骤一,制备探针分子:根据沙门氏菌的基因组结构和保守序列,选取沙门氏菌的invA基因作为检测目标片段,根据GenBank: EU348365公开的沙门氏菌invA基因序列,设计探针分子,所述探针分子序列为5’-GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT-3’,所述探针分子的5’端采用报告荧光基团FITC进行标记,即探针分子结构为:FITC- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;

步骤二,将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子:FITC- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT混合,然后加入待测样品,检测荧光。

实施例3:一种用于沙门氏菌检测的试剂盒,其包括:探针分子溶液、聚苯乙烯纳米球溶液、阳性对照质粒、阴性对照,其中所述探针分子的结构为:报告荧光基团-GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT。

其中阳性对照质粒是采用PCR扩增的方法,将序列为GenBank: GenBank: EU348365公开的沙门氏菌invA基因克隆至 pGEM -T Easy载体上,经验证所得到的阳性质粒;其中阴性对照组为水。

实施例4:检测试验

采用实施例1的方法对阳性对照和阴性对照进行了试验,以验证检测方法的准确性,其检测结果对于于说明书附图图1,其中a为探针DNA(25nM)的荧光发射光谱,b为探针DNA(25nM)+阳性对照质粒(来自实施例3,50nM)的荧光发射光谱,c为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+去离子水的荧光发射光谱,d为探针DNA(25nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒(来自实施例3,50nM)的荧光发射光谱,e为聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱。

以上检测结果表明,在没有检测模板存在的情况下,探针分子和聚苯乙烯纳米球相互结合,发生荧光淬灭效应,其在520nm下检测到的荧光强度(c)不足探针分子溶液(a)或者探针DNA(25nM)+阳性对照质粒(b)荧光强度的一半,而当添加模板后(d),其相应的荧光值即恢复到接近探针分子溶液的荧光值,以上结果表明本发明的方法检测结果准确,能够有效地通过荧光情况判断待检测 样品中是否存在沙门氏菌。

实施例5:灵敏度检测:

取阳性对照质粒(50nM),分别稀释1倍、10倍、100倍、1000倍,采用实施例1的方法进行检测,检测结果见图2;同时对相同稀释倍数的阳性对照质粒采用传统的PCR检测方法进行检测(PCR扩增invA基因上一段长为202bp的核酸片段,其上游引物序列为5’-CGGTGGGGTTTGTTGTCTTTTC-3’ , 下游引物为5’-TCTCTTTCCAGTTCGCTTCGCC-3’,Tm=54℃)。由图2的检测将可见,PCR方法仅能检测到100倍稀释的样品,本发明的方法能够检测出来1000倍稀释的样品,而PCR方法不能有效地检测,说明本发明构建方法的灵敏度比传统PCR检测方法高出10倍。

实施例6:对比试验

基于引物设计的特异性,在本发明中设置了以下对照例,其所使用的探针序列为:5’-TATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCT-3’,其余同实施例1,经检测试验和灵敏度试验表明,本发明实施例1的方法的检测的准确率高于对比试验例的检测结果,对于同批次阳性样品(各样品之间存在浓度、沙门氏菌菌种的差异),实施例1的检出率为100%,而对比例的检出率为96.7%;且灵敏度试验结果表明,本发明实施例1的灵敏度相比对比例高出约10倍左右,对比例仅能达到PCR相当的灵敏度。

实施例7:样品检测

取新鲜果蔬汁30份,每个样品分为均分为三等份,每份10mL,每份样品经离心后取上清液,置于100℃水浴中水浴15min,而后8000rpm离心10min,取上清液作为检测样品,其中第一份按照实施例1的方法进行检测,第二份样品采用常规PCR方法(PCR扩增invA基因上一段长为202bp的核酸片段,其上游引物序列为5’-CGGTGGGGTTTGTTGTCTTTTC-3’ , 下游引物为5’-TCTCTTTCCAGTTCGCTTCGCC-3’,Tm=54℃,参见“沙门氏菌 PCR 检测方法的建立”,许会会等,《中国畜牧兽医》,2010年第37卷第4期)检测,第三份样品采用黄金海等人研发的LAMP方法进行检测,具体检测结果如下(下表1中的“+”表示检出沙门氏菌污染,“/”表示未检出沙门氏菌污染):

表1 检测结果表

由以上表1的结果可知,实施例1的方法检出:阳性24件,阴性6件;常规PCR方法检出:阳性14件,阴性16件;LAMP方法检出:阳性20例,阴性10例,其中样品13和29经PCR和LAMP同时检测为阴性、而实施例1的方法检测为阳性,事后,经传统细菌培养的方式检测后,以上两件样品均为阳性;并且有以上检测结果还可知,本发明实施例1的方法的检出率高于常规PCR方法和LAMP检测方法,也证明本发明的方法检测准确。

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