本发明涉及游离核酸测序领域，具体涉及一种母体外周血血浆快速分离方法及其应用。
背景技术：
20世纪40年代，法国科学家mandel和metais发现外周血中存在游离于细胞外的dna，称之为外周血游离dna(circulatingdnainplasmaorserum)。1997年，卢煜明等在怀有男胎孕妇的外周血中检测到y染色体的特异性序列，证明孕妇外周血中存在游离胎儿dna(cell-freefetaldna，cffdna)，cffdna的发现为无创性产前基因筛查(nipt)胎儿出生缺陷性疾病开辟了新纪元。与传统有创侵入性(绒毛膜取样、羊水穿刺和脐带血穿刺)的产前诊断相比，无创产前基因筛查具备无创采样、高通量、快速出结果的优势，目前最为人熟知的应用是用于评估胎儿常见染色体非整倍体(t21、t18和t13)异常风险。
无创产前基因筛查(nipt)包括母体外周血血浆分离、血浆游离dna提取、高通量测序、生物信息学分析步骤。胎儿dna浓度对无创产前的胎儿基因组异常检测的准确性至关重要，胎儿dna浓度为无创产前基因检测的关键质控点。母体外周血中游离dna大部分来源于母体自身的细胞凋亡，仅极少部分来源于胎儿，而外周血离体后有核血细胞的裂解影响到总游离dna的浓度及胎儿dna浓度检测的准确性。因此，有效分离母体外周血血浆是保证游离dna胎儿浓度的关键因素之一。
目前母体外周血血浆分离采用经典的两步离心法：一步低速离心之后，取血浆进行第二步高速离心，以确保完全除去母体有核细胞。然而两步离心法中间涉及一次转管操作，这增加了在血浆分离环节样本混淆的概率；并且离心设备需要支持采血管低速离心和离心管高速离心，以上条件无形增加了人力和物料成本。因此，开发一种快速、简化，且不影响胎儿游离dna浓度的血浆分离方法，对于获取胎儿核酸信息和开展无创产前基因检测有重要作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种母体外周血血浆快速分离方法及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种母体外周血血浆快速分离方法，所述方法包括：对离体的母体外周血进行一步离心获得血浆。
优选的，5～10ml母体外周血，一步离心的总离心力为10000～100000(g·min)。
进一步优选的，5～10ml母体外周血，一步离心的总离心力为16000～64000(g·min)。
进一步优选的，5～10ml母体外周血，一步离心的相对离心力为1600～3200g，离心时长为10～20min。
其中，母体外周血选自保质的母体外周血；处于正常状态或微溶血状态或中度溶血状态的母体外周血。
上述的母体外周血血浆快速分离方法在游离dna提取、胎儿核酸信息获取中的应用。
一种游离dna提取方法，所述方法包括：利用上述的母体外周血血浆快速分离方法获得血浆，从血浆中提取游离dna。
优选的，采用硅胶膜柱离心法或磁珠法从血浆中提取游离dna。
一种胎儿核酸信息获取系统，包括：
血浆一步分离装置：用于利用上述的母体外周血血浆快速分离方法获得血浆；
游离dna提取装置：用于从血浆中提取游离dna；
文库构建装置：用于利用游离dna进行文库构建；
高通量测序装置：用于对文库进行高通量测序；
生物信息分析装置：用于根据高通量测序数据进行生物信息分析，获得胎儿核酸信息。
上述的胎儿核酸信息获取系统应用于无创胎儿染色体非整倍体筛查系统、无创胎儿染色体微缺失微重复筛查系统、无创胎儿单基因病筛查系统。
本发明的有益效果是：
本发明的母体外周血血浆快速分离方法包括：对离体的母体外周血进行一步离心获得血浆。分离后的血浆经游离dna提取、文库构建、高通量测序、生物信息分析后，与两步离心法的血浆相比，游离dna浓度、游离dna片段分布、胎儿dna浓度、测序片段分布相当，可应用于游离dna提取，胎儿核酸信息获取，及无创产前基因筛查产品。
本发明的母体外周血血浆快速分离方法，在业内将产生重要效益：(1)打破传统的血浆分离两步离心法认知和做法；(2)血浆分离的实验操作时间由30min(以分离10例外周血为例)减少至15min，节约操作时间的效果显著；(3)对血浆分离的设备需求由满足低速离心和高速离心条件减为满足低速离心即可；(4)在血浆分离过程中，血浆分离由2次转管操作减为1次转管操作，减少血浆分离中二次标示动作，减少血浆分离的耗材需求(枪头、离心管)，减少血浆分离中样本人为混淆的概率，减少血浆分离转管时的复核动作，亦提高血浆分离操作全自动化的可行性和简化血浆分离全自动化的操作流程；(5)在保持有核血细胞及维持游离dna完整性的同时，减少第二步高速离心带来的dna损耗，提高胎儿游离dna的丰度；(6)基于血浆快速分离的游离dna提取、胎儿核酸信息获取、无创产前基因筛查流程都得到简化，大大减少了人力、物力的投入。
附图说明
图1是t001样本2100图，其中，c1表示对比例1，l1～l3按顺序表示实施例1～3；
图2是t001样本测序片段分布图；
图3是w001样本2100图，其中，c2表示对比例2，l4～l6按顺序表示实施例4～6；
图4是w001样本测序片段分布图；
图5是d001样本2100图，其中，c1表示对比例1，l1表示实施例1；
图6是d001样本测序片段分布图；
图7是l001样本2100图，其中，c1表示对比例1，l1表示实施例1；
图8是l001测序片段分布图。
具体实施方式
发明人根据母体外周血中含有红细胞、白细胞及游离dna，母体外周血中的cffdna自然降解成主峰为＜313bp的dna片段，在外周血采集后cffdna主要来源即被切断的情况以及离心力(总离心力＝相对离心力×离心时间)，提出一种母体外周血血浆快速分离方法。
本发明涉及公式：总离心力＝相对离心力×离心时间；
其中，相对离心力(rcf，relativecentrifugalforce)，单位为重力加速度g；总离心力(tcf，totalcentrifugalforce)单位为g·s或g·min；表示整个离心周期内总施加的离心力。
一种母体外周血血浆快速分离方法，所述方法包括：对离体的母体外周血进行一步离心获得血浆。
优选的，5～10ml母体外周血，一步离心的总离心力为10000～100000(g·min)。
进一步优选的，5～10ml母体外周血，一步离心的总离心力为16000～64000(g·min)。
进一步优选的，5～10ml母体外周血，一步离心的相对离心力为1600～3200g，离心时长为10～20min。
其中，母体外周血选自保质的母体外周血；处于正常状态或微溶血状态或中度溶血状态的母体外周血。
上述的母体外周血血浆快速分离方法在游离dna提取、胎儿核酸信息获取中的应用。
一种游离dna提取方法，所述方法包括：利用上述的母体外周血血浆快速分离方法获得血浆，从血浆中提取游离dna。
优选的，采用硅胶膜柱离心法或磁珠法从血浆中提取游离dna。
一种胎儿核酸信息获取系统，包括：
血浆一步分离装置：用于利用上述的母体外周血血浆快速分离方法获得血浆；
游离dna提取装置：用于从血浆中提取游离dna；
文库构建装置：用于利用游离dna进行文库构建；
高通量测序装置：用于对文库进行高通量测序；
生物信息分析装置：用于根据高通量测序数据进行生物信息分析，获得胎儿核酸信息。
上述的胎儿核酸信息获取系统应用于无创胎儿染色体非整倍体筛查系统、无创胎儿染色体微缺失微重复筛查系统、无创胎儿单基因病筛查系统。
本发明术语“保质的母体外周血”是指母体外周血采集至采血管后，只要在符合相应采血管的保质标准下存放和/或运输，并且未超过规定的保质期限，就属于“保质的母体外周血”，例如，根据本领域常规技术，利用edta抗凝采血管采集的母体外周血，需在2～8℃保存或运输，且要求8小时内分离血浆；再如，利用游离核酸稳定采血管采集的母体外周血，则可拓展至常温保存或运输(4～30℃)，要求96小时内分离血浆。此外，本发明对一步离心的温度不作限定，基于采血管的保质性能，利用edta抗凝采血管装载的外周血需在2～8℃下低温保存(包括离心)，而游离核酸稳定采血管可在常温条件下保存(包括离心)。
下面将结合具体的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的思路，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未特别说明的仪器和试剂均可市售获得，未特别说明的试验条件均按本领域常规操作或厂商说明书进行。
实施例1、一种母体外周血血浆快速分离方法
采集母体外周血5ml，一步离心获得血浆，所述一步离心的具体操作为：放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为1600g，离心10分钟，上清即为分得的血浆，于-20℃保存备用。
实施例2、一种母体外周血血浆快速分离方法
采集母体外周血5ml，一步离心获得血浆，所述一步离心的具体操作为：放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为2500g，离心10分钟，上清即为分得的血浆，于-20℃保存备用。
实施例3、一种母体外周血血浆快速分离方法
采集母体外周血5ml，一步离心获得血浆，所述一步离心的具体操作为：放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为3200g，离心10分钟，上清即为分得的血浆，于-20℃保存备用。
实施例4、一种母体外周血血浆快速分离方法
采集母体外周血10ml，一步离心获得血浆，所述一步离心的具体操作为：放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为1600g，离心15分钟，上清即为分得的血浆，于-20℃保存备用。
实施例5、一种母体外周血血浆快速分离方法
采集母体外周血10ml，一步离心获得血浆，所述一步离心的具体操作为：放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为2500g，离心15分钟，上清即为分得的血浆，于-20℃保存备用。
实施例6、一种母体外周血血浆快速分离方法
采集母体外周血10ml，一步离心获得血浆，所述一步离心的具体操作为：放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为3200g，离心15分钟，上清即为分得的血浆，于-20℃保存备用。
对比例1、一种母体外周血血浆常规两步分离方法
采集母体外周血5ml，两步离心获得血浆，所述两步离心的具体操作为：1)放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为1600g，离心10min，吸取上清转移至新的离心管中；2)放入上步所得上清的离心管，以相对离心力为16000g，离心10min，上清即为分得的血浆，放于-20℃中保存。
对比例2、一种母体外周血血浆常规两步分离方法
采集母体外周血10ml，两步离心获得血浆，所述一步离心的具体操作为：1)放入装有母体外周血的采血管，以相对离心力为1600g，离心15min，吸取上清转移至新的离心管中；2)放入上步所得上清的离心管，以相对离心力为16000g，离心10min，上清即为分得的血浆，放于-20℃中保存。
实施例7、游离dna提取及获取胎儿核酸信息
本实施例利用实施例1～3和对比例1提供的血浆分离方法，对来自东莞妇幼保健院2例离体的母体外周血样本(编号为t001、t002，证实怀男胎的样本)进行分离，获得血浆。利用实施例4～6和对比例2提供的血浆分离方法，对来自东莞妇幼保健院2例离体的母体外周血样本(编号为w001、w002，证实怀男胎的样本)进行分离，获得血浆。
血浆游离dna提取
使用常规的硅胶膜柱离心法提取、磁珠法提取等方式提取血浆中的游离dna，本实施例选用东莞博奥木华基因科技有限公司的核酸提取或纯化试剂盒(产品货号s10020)，提取方法按照产品说明书进行：首先，用裂解液和蛋白酶k对样品进行裂解消化，将游离dna释放到裂解液中；其次，将游离的核酸吸附到磁珠表面；第三，利用洗涤液洗去未吸附的蛋白质、盐分等杂质；第四，将被吸附的游离dna从磁性粒子上洗脱，获得游离dna。
采用qubit3.0荧光定量仪检测dna浓度，换算成游离dna总量，结果如表1所示。
表1、各例分离血浆的游离dna总量(ng)
可见，实施例1～3的血浆快速分离方法与对比例1的常规两步血浆分离方法获得的血浆中游离dna总量相当；实施例4～6的血浆快速分离方法与对比例2的常规两步血浆分离方法获得的血浆中游离dna总量相当。
采用agilent2100生物分析仪，选用agilenthighsensitivitydnakit对血浆的游离dna进行片段分布检测，以样本t001和w001为例，结果分别如图1、图3所示，血浆快速分离方法与常规的两步血浆分离方法获得的血浆提取得到的游离dna分布相当。
文库构建
将提取的游离dna采用常规方法进行文库构建和定量，本实施例使用胎儿染色体非整倍体(t21、t18、t13)检测试剂盒(博奥生物集团)中的建库试剂成分：末端修复缓冲液、末端修复酶、dna连接缓冲液、dna连接酶、pcr扩增试剂、pcr引物、te溶液、p1接头、标签序列x，磁珠b1，磁珠b2，作为替代，也可以使用lifetechnologies或newenglandbiolabs、enzymatics在proton测序平台上的建库试剂、测序试剂。
文库构建方法包括：末端修复、接头连接、pcr扩增，具体如下：
a.末端修复
将提取的游离dna分别按照下面的表格配置反应体系，置于室温孵育20min，加入100μl磁珠b1进行结合，在磁力架上澄清后，转移上清到90μl磁珠b2中进行纯化，25μlte溶液溶解洗脱：
b.接头连接
将上步纯化产物分别按照下面的表格配置反应体系，置于室温孵育30min，使用75μl磁珠b2进行纯化，18.2μlte溶液溶解洗脱：
p1接头为由如下两个正反序列组成的p1-adapter：
5'-ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgat-3'(seqidno:1)，
3'-t*t*ggtgatgcggaggcgaaaggagagatacccgtcagccacta-5'(seqidno:2)。
标签序列x是由如下正反两个序列组成的barcodeprimerx组成：
5'-ccatctcatccct*g*cgtgtctccgactcagnnnnnnnnnngat-3'(seqidno:3)，
3'-cgcacagaggctgagtcnnnnnnnnnncta-5'(seqidno:4)。
其中”n”代表a、t、c、g任意一个碱基，*代表核苷酸进行了硫代修饰。
c.pcr扩增
将上步纯化产物按照下面的表格配置反应体系：
pcr引物序列为：
primer1：5’-ccatctcatccctgcgtgtc-3’(seqidno:5)，
primer2：5’-ccactacgcctccgctttcctctctatg-3’(seqidno:6)。
pcr反应条件：72℃，10min，95℃，5min；(95℃，15s；58℃，15s；70℃，1min)12cycles；70℃，2min；4℃，holding。
pcr结束后，用85μl磁珠b2进行纯化，50μlte溶液溶解洗脱，获得待测序文库。
高通量测序
对文库进行乳液pcr反应、富集纯化，引物退火及样本加载到芯片，即可进行测序反应。ionprotontm测序平台采取单端测序法，测序最大读长为300bp，获得测序数据。图2示例性给出样本t001各例测序片段长度分布图，图4示例性给出样本w001各例测序片段长度分布图，可见血浆快速分离方法与常规的两步血浆分离方法获得的血浆中游离dna建库测序片段分布相当。
生物信息分析
将高通量测序数据进行生物信息分析，获得胎儿核酸信息：将测序得到的序列(reads)比对到人类参考基因组，并去除低质量的比对结果以及重复序列，进而计算22对染色体以及性染色体的序列数(readsnumber)和序列比例(readsratio)，根据男胎y染色体与胎儿dna浓度的关系，获得胎儿游离dna浓度，结果如表2所示。
表2、各例分离血浆的胎儿dna浓度(％)
可见，实施例1～3的血浆快速分离方法与对比例1的常规两步血浆分离方法获得的血浆中胎儿dna浓度相当；实施例4～6的血浆快速分离方法与对比例2的常规两步血浆分离方法获得的血浆中胎儿dna浓度相当。
实施例8、分离血浆可反复冻融
本实施例针对来自东莞妇幼保健院3例离体的母体外周血样本(证实已怀男胎的样本，编号为d001、d002、d003)，均利用实施例1和对比例1提供的血浆分离方法获得血浆，
对实施例1分离的血浆进行反复冻融3次：即将血浆置于-20℃冰箱中冷冻后取出，室温完全解冻后，再冷冻，再完全解冻，重复3次，然后置于-20℃冰箱中保存。检测指标的时间点安排在反复冻融后的第1个月，第3个月，以对比例1分离的血浆为对照。
根据实施例7的血浆游离dna提取、文库构建、高通量测序、生物信息分析的方法，获得相应的游离dna总量及胎儿核酸浓度等指标。
结果：
以样本d001为例展示agilent2100分析的血浆游离dna片段分布图，结果如图5所示，血浆快速分离方法获得的血浆反复冻融后不同保存时间获得的游离dna分布与两步血浆分离方法获得的血浆相当。
以样本d001为例展示游离dna文库测序片段分布图，结果如图6所示，血浆快速分离方法获得的血浆反复冻融后不同保存时间获得的游离dna建库测序片段分布与两步血浆分离方法获得的血浆相当。
表3给出各例分离血浆的游离dna总量(ng)和胎儿dna浓度(％)。
表3、分离血浆反复冻融后的检测结果
可见，本发明的血浆快速分离方法获得的血浆经反复冻融3次后，保存至3个月仍与常规两步分离方法获得的血浆中游离dna浓度和胎儿dna浓度相当。
实施例9、对微溶血、中度溶血的母体外周血进行血浆分离
本实施例针对来自东莞妇幼保健院3例离体的母体外周血样本(证实已怀男胎的样本)，样本状态分别为l001(微溶血)、l002(微溶血)、l003(中度溶血)，均利用实施例1和对比例1提供的血浆分离方法获得血浆，并根据实施例7的血浆游离dna提取、文库构建、高通量测序、生物信息分析的方法，获得相应的游离dna总量及胎儿核酸浓度等指标。
结果：
以样本l001为例展示agilent2100分析的血浆游离dna片段分布图，结果如图7所示，血浆快速分离方法与常规的两步血浆分离方法获得的血浆中游离dna分布相当。
以样本l001为例展示游离dna文库测序片段分布图，结果如图8所示，可见血浆快速分离方法与常规的两步血浆分离方法获得的血浆中游离dna建库测序片段分布相当。
表4给出各例分离血浆的游离dna总量(ng)和胎儿dna浓度(％)。
表4、微溶血、中度溶血样本分离血浆后的检测结果
可见，血浆快速分离方法与常规两步血浆分离方法获得的血浆中游离dna总量和胎儿dna浓度相当。
总而言之，本发明提供的母体外周血血浆快速分离方法对游离dna浓度、游离dna片段分布、胎儿dna浓度、测序片段分布无显著影响，可应用于游离dna提取，胎儿核酸信息获取及无创产前基因筛查产品，其中，无创筛查产品包括但不限于无创胎儿染色体非整倍体筛查产品、无创胎儿染色体微缺失微重复筛查产品、无创胎儿单基因病筛查产品。
sequencelisting
<110>东莞博奥木华基因科技有限公司
<120>一种母体外周血血浆快速分离方法及其应用
<130>
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<170>patentinversion3.5
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<213>人工接头
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<220>
<221>硫代修饰
<222>(13)..(14)
<220>
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<222>(31)..(40)
<223>nisa,c,g,ort
<400>3
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<212>dna
<213>人工标签
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(13)
<223>nisa,c,g,ort
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<400>5
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<212>dna
<213>人工引物
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