本发明属于植物遗传转化技术领域,特别提供了一种棉花遗传转化方法。
背景技术:
棉花是我国的非起源作物,因此我国的棉花种质资源较为匮乏,利用遗传转化技术将外源基因导入棉花基因组内,不仅可以有效打破物种间的界限,还能增加棉花的品种,提高棉花抗性。但是目前的棉花遗传转化方法均存在着遗传转化率低、转化时间长等问题。
技术实现要素:
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种棉花遗传转化方法,通过调整过程中的培养基及培养参数,大大缩短了棉花遗传转化的时间,并且提高了遗传转化率。
本发明是这样实现的,提供一种棉花遗传转化方法,包括如下步骤:
1)制备转化受体
棉花种子的灭菌:选取脱绒后的棉花种子用70%的乙醇灭菌1min,之后用15%的过氧化氢灭菌4h,最后用无菌水清洗3-5次;
预培养:用灭菌滤纸吸干种子表面水分,放到gs1培养基上,28℃培养室中避光培养6天,至下胚轴的长度在9-11cm;
2)制备侵染液
取50mlgs-inf,将农杆菌挑至gs-inf中,制成侵染液;
3)侵染
切取无菌苗的下胚轴,用解剖刀切成0.5cm小段,将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中,放置摇床100rpm侵染20min,之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液;
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴,以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的gs-cocu培养基上培养两天,至下胚轴变为淡黄色;
5)筛选
第一次筛选:将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基gs2-1中筛选40天;
第二次筛选:第一次筛选后,将下胚轴转入到筛选培养基gs2-1中筛选30-40d,直到筛选到大块初级愈伤;
6)胚性愈伤诱导培养
将步骤5)获得的初级愈伤接入gs3培养基中光培养,每30天循环继代一次,直到有胚长出;
7)苗诱导
将步骤6)得到的胚继代到gs4培养基中光培养,每30天循环继代一次,直到有生根好的苗长出,至少长出3根根系,3片叶绿色叶子;
各步骤中用到的培养基具体配方见下表:
上述培养基配方表中各个代码含义为:
进一步地,所述步骤2)中制备的侵染液od600=1.0。
选用的农杆菌为lba4404,携带的为kana抗性基因。
进一步地,所述棉花的品种为r15或xu142中的一种。
与现有技术相比,本发明的优点在于:过程简单、操作方便、参数及培养基优化,能够在较短时间内获得高遗传转化率的棉花转基因植株。
附图说明
图1为利用本发明的方法获得的共培养阶段的下胚轴;
图2为利用本发明的方法获得的第一次筛选阶段的愈伤组织;
图3为利用本发明的方法获得的第二次筛选阶段的愈伤组织;
图4为利用本发明的方法获得的胚性愈伤;
图5为利用本发明的方法获得的胚;
图6为利用本发明的方法获得的芽;
图7为利用本发明的方法获得的伸长的芽;
图8为利用本发明的方法获得的生根的苗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例、
1)制备转化受体
棉花种子的灭菌:取50粒棉花种子(r15或xu142),用50ml70%的乙醇灭菌1min,之后用50ml15%的过氧化氢灭菌4h,最后用无菌水清洗3-5次;
预培养:用灭菌滤纸吸干种子表面水分,放到gs1培养基上,28℃培养室中避光培养6天,至下胚轴的长度在9-11cm;
2)制备侵染液
取50mlgs-inf,将携带kana抗性基因的lba4404农杆菌挑至gs-inf中,制成侵染液,od600=1.0;
3)侵染
切取无菌苗的下胚轴,用解剖刀切成0.5cm小段,将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中,放置摇床100rpm侵染20min,之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液;
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴,以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的gs-cocu培养基上,至下胚轴变为淡黄色,参考图1;
5)筛选
第一次筛选:将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基gs2-1中筛选40天,参考图2;
第二次筛选:第一次筛选后,将下胚轴转入到筛选培养基gs2-1中筛选30-40天,直到筛选到大块初级愈伤,参考图3;
6)胚性愈伤诱导培养
将步骤5)获得的初级愈伤接入gs3培养基中光培养,每30天循环继代一次,直到有胚长出,参考图4和图5;
7)苗诱导
将步骤6)得到的胚继代到gs4培养基中光培养,每30天循环继代一次,直到有生根好的苗长出,至少长出3根根系,3片叶绿色叶子,参考图6、图7和图8;
各步骤中用到的培养基具体配方见下表: