本发明涉及生防菌剂制备技术领域，特别是涉及一种生防木霉厚垣孢子及菌剂的高效制备方法。
背景技术：
木霉(trichodermaspp.)作为一种生防因子，具有广泛适应性、广谱性及多机制性等特点，已被广泛用作防治植物病害和促进植物生长的拮抗真菌制剂。在国际上已有50多种木霉菌的不同机型作为生物农药或生物肥料进行登记，占据了50％的真菌生防制剂市场份额。目前商品化的木霉菌活体制剂，其活性成分主要为木霉分生孢子，因为分生孢子天然的抗逆性差、耐储性差等缺陷，木霉活体菌剂的保质期一般只有3个月。除了通过纳米载体等技术延长菌剂效用，利用木霉自身产生抗逆性强的繁殖体作为菌剂活性成分是治本之道。
厚垣孢子是木霉在逆境条件下产生的一种繁殖体，由于与分生孢子相比，具有体积大、细胞壁厚、内容物多等特点，因此在相同条件下厚垣孢子货架期明显长于分生孢子，且耐干燥和高温，对土壤抑菌作用不敏感，有利于提高木霉菌剂的贮藏时间和应用时效性。厚垣孢子仅在特定条件下大量产生，目前诱导厚垣孢子的方法多为针对具体木霉株系，调节养分、培养条件等参数获得厚垣孢子，对于不同菌株参数需进行大量调整，推广难度较大。建立一种菌株适应性广且简单高效的厚垣孢子制备的方法。
技术实现要素：
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种生防木霉厚垣孢子及菌剂的高效制备方法。本发明通过调整ph诱导产生木霉厚垣孢子，对培养基组分含量进行了优化，仅通过添加草酸即可达到大量产生厚垣孢子的目的，成本和配料复杂度低于传统的产厚垣孢子的培养基。本发明利用草酸对木霉的生防机制诱导效应，所诱导产生的厚垣孢子尤其对灰霉病和菌核病等草酸分泌型病害具有良好的防治效果，相较于传统的方法更具有应用指向性。
本发明的一种生防木霉厚垣孢子及菌剂的高效制备方法技术方案为，生防木霉厚垣孢子制备包括以下步骤：
(1)配制草酸母液；
(2)配制培养基i，所述的培养基i包括马铃薯，葡萄糖和水；
(3)配制培养基ii，所述的培养基ii包括葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，七水硫酸镁，硝酸铵，磷酸二氢钾和水；
(4)将草酸添加至培养基ii中；
(5)活化木霉菌株；
(6)将活化好的木霉制取分生孢子悬浮液，在培养基i中培养得种子液；
(7)将种子液接种到添加了草酸的培养基ii中培养获得发酵液，发酵液是厚垣孢子与菌丝的混合物。
采用上述获得的发酵液制备生防木霉厚垣孢子菌剂。
步骤(1)中，草酸母液浓度为0.1～0.5mol/l，经0.22μm水相滤膜在无菌条件下过滤后储存在室温下。
步骤(2)中，马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，纱布过滤出滤液，滤液加20g葡萄糖，用水补足1l体积，高压灭菌115℃30分钟得到培养基i。
步骤(3)中，葡萄糖5～10g，酵母粉5～10g,蛋白胨10～20g，七水硫酸镁1.3～1.5g,硝酸铵1.5～1.9g,磷酸二氢钾1～2g，水补足1l体积，高压灭菌115℃30分钟得到培养基ii。
步骤(4)具体为，无菌条件下，草酸母液添加至培养基ii中，将培养基ph调至2.5～4。
步骤(5)中，将木霉菌株接种于pda平板上，在菌株的适宜温度下半光半暗培养7天，对菌株进行活化。
步骤(6)中，取活化好的木霉平板，用无菌水将分生孢子冲洗至无菌离心管，用含0.05％吐温80的无菌水将分生孢子悬浮均匀，计数制成浓度为107分生孢子/ml的悬浮液。
步骤(6)中，无菌条件下，按1:100的体积比将木霉分生孢子悬浮液加入培养基i中，25℃～30℃，在转速160～180r/min条件下震荡暗培养1～2d,得到种子液。
步骤(7)中，将种子液按体积比5～20:100接种至添加草酸的培养基ii中，25℃～30℃，转速160～180r/min，暗培养5～7d得到发酵液。
所述的木霉为可在浓度为20～50mmol/l的含草酸培养基中生长的菌株。
本发明的有益效果为：
1.本发明通过调整ph诱导产生木霉厚垣孢子，对培养基组分含量进行了优化，仅通过添加草酸即可达到大量产生厚垣孢子的目的，成本和配料复杂度低于传统的产厚垣孢子的培养基。
2.本发明利用草酸对木霉的生防机制诱导效应，所诱导产生的厚垣孢子尤其对灰霉病和菌核病等草酸分泌型病害具有良好的防治效果，相较于传统的方法更具有应用指向性。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
一种生防木霉厚垣孢子的高效制备方法，包括以下步骤：
(1)配制草酸母液，草酸母液浓度为0.1～0.5mol/l，经0.22μm水相滤膜在无菌条件下过滤后储存在室温下；
(2)配制培养基i，马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，纱布过滤出滤液，滤液加20g葡萄糖，用水补足1l体积，高压灭菌115℃30分钟得到培养基i；
(3)配制培养基ii，葡萄糖5～10g，酵母粉5～10g,蛋白胨10～20g，七水硫酸镁1.3～1.5g,硝酸铵1.5～1.9g,磷酸二氢钾1～2g，水补足1l体积，高压灭菌115℃30分钟得到培养基ii；
(4)无菌条件下，草酸母液添加至培养基ii中，将培养基ph调至2.5～4；
(5)将木霉菌株接种于pda平板上，在菌株的适宜温度下半光半暗培养7天，对菌株进行活化；
(6)取活化好的木霉平板，用无菌水将分生孢子冲洗至无菌离心管，用含0.05％吐温80的无菌水将分生孢子悬浮均匀，计数制成浓度为107分生孢子/ml的悬浮液，无菌条件下，按1:100的体积比将木霉分生孢子悬浮液加入培养基i中，25℃～30℃，在转速160-180r/min条件下震荡暗培养1～2d,得到种子液；
(7)将种子液按体积比5～20:100接种至添加草酸的培养基ii中，25℃～30℃，转速160～180r/min，暗培养5～7d得到发酵液。
所述的木霉为可在浓度为20～50mmol/l的含草酸培养基中生长的菌株。
采用上述获得的发酵液采用常规菌剂制备方法制备生防木霉厚垣孢子菌剂或者直接将发酵液作为菌剂使用。
实施例2
待测的3株木霉菌株在中国农业微生物菌种保藏中心编号分别为绿色木霉accc31911、绿木霉accc32489和棘孢木霉accc30536。其中绿色木霉的最适生长温度为25℃，绿木霉的最适生长温度为28℃，棘孢木霉的最适生长温度为30℃。
步骤一
将木霉菌株接种于pda(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g,1l水)平板上，在各菌株的适宜温度下半光半暗培养7天，对菌株进行活化。
步骤二
取活化好的木霉平板，用无菌水将分生孢子冲洗至无菌离心管，用含0.05％吐温80的无菌水将分生孢子悬浮均匀，计数制成浓度为107分生孢子/ml的悬浮液。
无菌条件下，取1ml木霉分生孢子悬浮液，加入含100ml培养基i的500ml锥形瓶中。在转速180r/min、合适温度暗培养条件下震荡培养40h,得到种子液。
步骤三
无菌条件下，将步骤二的种子液按照10:100的体积比分别接种至培养基ii和添加了适量草酸的培养基ii，在转速180r/min、合适温度暗培养条件下震荡培养7d，获得发酵液。其中绿色木霉培养基的草酸添加量为30mmol/l(初始ph3.2)，绿木霉的草酸添加量为30mmol/l(初始ph3.2)，棘孢木霉的草酸添加量为20mmol/l(初始ph4.0。
本实施例效果
表1不同菌株发酵液的厚垣孢子密度
表1所示结果表明，添加适量草酸后,各木霉菌株经发酵产生的厚垣孢子数量比不添加草酸高4～5个数量级，厚垣孢子增益效果显著。
实施例3
将本发明制备的木霉厚垣孢子制备成可湿性粉剂(或其他常规方法可制备成的菌剂)，步骤如下：
步骤1将实施例1中制备的厚垣孢子发酵液与硅藻土按6:1的比例混合后，经50℃烘干，充分粉碎后，过100目筛，获得厚垣孢子粉；
步骤2厚垣孢子粉20重量份，十二烷基硫酸钠5重量份，羧甲基纤维素4重量份，糊精1重量份，硅藻土70重量份。搅拌均匀即为厚垣孢子可湿性粉剂。
实施例4
比较利用本发明制备的木霉厚垣孢子发酵液制备的菌剂与常规发酵法制备的木霉分生孢子菌剂在不同储存期内的存活率。可湿性粉剂配置方法为实施例3中的方法。表2所示结果表明不同菌株在3个月内厚垣孢子和分生孢子的存活率均较高，6个月时分生孢子存活率显著降低至70％以下。厚垣孢子在6个月内保持较高存活率，12个月仍有75％以上的存活率。
表2不同菌株厚垣孢子与分生孢子的存活率
实施例5
对本发明制备的木霉厚垣孢子可湿性粉剂进行生防功能测试，可湿性粉剂配置方法为实施例3中的方法，靶标病害为黄瓜灰霉病和油菜菌核病。实施方法分别参考ny/t1156.10-2008《农药室内生物测定实验准则杀菌剂第10部分：防治灰霉病试验盆栽法》和gb/t17980.35-2000《农药田间药效试验准则(一)杀菌剂防治油菜菌核病》进行。其中处理为喷施厚垣孢子菌剂，对照为喷施清水。
表3所示结果表明各木霉菌株的厚垣孢子菌剂对两种病害均有良好的防治效果。
表3不同菌株对病害的防治效果