本发明涉及基因工程领域，是一种植物病毒样颗粒的修饰、表达与制备方法及其应用，具体为肿瘤靶向肽f3修饰的豇豆褪绿斑驳病毒样颗粒的构建、表达及其应用。
背景技术：
：
病毒样颗粒(virus-likeparticles,vlps)是不含病毒核酸的空壳结构，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。由于vlps不含有病毒遗传物质，无感染性，有些已作为疫苗成功应用。许多病毒结构蛋白都具有自我组装成vlps的能力，可由非原宿主的异源表达系统产生获得。
以vlps为基础构建的纳米颗粒载体，具有生物相容性好、特定靶向性强等优势，是理想的药物输送系统载体。病毒纳米颗粒内部空间可以包载多肽、药物或示踪剂等小分子物质，以及核酸、蛋白或纳米粒等大分子物质。而通过化学修饰和基因工程改造等手段在vlps表面嵌合各种目的分子，包括叶酸、聚乙二醇、适配体、多肽以及纳米粒等，也可改变衣壳蛋白的氨基酸序列和种类，从而提高载体的靶向性、载药量和包封率等。
豇豆褪绿斑驳病毒(cowpeachloroticmottlevirus,ccmv)作为植物病毒研究的模式种，在纳米生物技术领域备受重视探讨，已被作为纳米反应器、纳米显影剂、药物/基因输送载体等详细阐述。ccmv病毒样颗粒为正二十面体结构，由90个衣壳蛋白(capsidprotein,cp)二聚体组成，以三角形剖分数t＝3对称排列，在不同的ph和离子强度下进行可逆的自我解聚/组装结构转换过程，还可以形成28nm(t＝3)或18nm(pseudot＝2)vlps。根据这一特性，cornelissen等用ccmv包载阴离子聚合物如聚苯乙烯磺酸盐(pss)、聚二茂铁基硅烷(pfs)、四磺基酞菁锌(znpc)及酞菁(pc)树状聚合物，形成单分散或多分散的t＝1,2,3vlps，甚至是衣壳蛋白—树状聚合物生物杂合纳米颗粒；这些纳米颗粒均展现出良好的靶向光动力学和光热治疗效果，如与巨噬细胞孵育后用620-660nm汞灯照射，照射部分细胞死亡率92％-95％，未照射部分细胞存活良好。douglas和young等通过基因工程修饰ccmv衣壳蛋白，将42位的赖氨酸替换成精氨酸并将102和130位的丝氨酸替定向突变为半胱氨酸，以具有碘乙酰胺基的含钌光敏剂选择性地与半胱氨酸的巯基发生反应形成共价连接，最后通过酰化反应把生物素连接到衣壳蛋白表面，修饰后的ccmv可作为纳米显影剂。动物毒理实验表明，ccmv静脉注射后在小鼠体内肺、肾和肝聚集，24小时内大部分vlps即可排出体外，可生物降解、无感染性及附加毒性。
肿瘤靶向肽f3是位于人类高迁移率族蛋白2(humanhigh-mobilitygroupprotein2,hmgn2)氨基端的31个氨基酸残基，由porkka等于2002年通过噬菌体展示技术发现，具有细胞穿透性。f3肽能够识别结合肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞表面的核仁素(nucleolin)，而核仁素在正常细胞中只在核内表达。通过核仁素，f3肽选择性地与肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞结合，而不需要穿透实体瘤的致密结构。reddy等制备了f3肽靶向的有机纳米颗粒聚合物，包裹显像剂(氧化铁或荧光)和光敏剂photofrin，体外研究表明该纳米颗粒能够结合、内化并转运到肿瘤细胞核内，光激活杀灭肿瘤细胞，体内核磁共振成像(mri)显示纳米颗粒可作用于小鼠脑胶质瘤细胞系9l，比未包裹的光敏剂显著增加小鼠的存活时间和治疗效果。以f3肽作为肿瘤靶向位点修饰病毒样颗粒表面，尚未见报道。ir780碘化物属于近红外染料，具有比临床应用的吲哚菁绿(icg)更高、更稳定的荧光强度，可用于激光照射的光热治疗ptt，但其亲脂性限制了其应用。ir780已被人转铁蛋白和血清白蛋白包载获得纳米颗粒，增加溶解度，降低细胞毒性，并表现出令人鼓舞的光热性能。
目前，肿瘤靶向病毒载体的研究多以动物病毒样颗粒为基础，涉及的靶向肽主要包括rgd、vegf等，如何建立基于植物病毒样颗粒的药物输送载体并有效表达及应用，是本发明要解决的技术问题。
技术实现要素：
：
本发明的目的在于将肿瘤靶向肽f3引入氨基末端敲除部分氨基酸残基的ccmv衣壳蛋白cp(δn26)中，构建融合基因f3-cp(δn26)，在毕赤酵母系统中诱导表达、纯化融合蛋白，利用衣壳蛋白的自组装特性，获得肿瘤靶向肽修饰的f3-ccmv病毒样颗粒，以之包载近红外染料ir780碘化物，研发肿瘤靶向的纳米药物输送载体。
本发明的肿瘤靶向肽f3修饰的豇豆褪绿斑驳病毒样颗粒的构建、表达及其应用是通过如下技术方案实现：
一种肿瘤靶向肽修饰的豇豆褪绿斑驳病毒样颗粒，ccmv衣壳蛋白cp敲除氨基末端1-26氨基酸残基，插入肿瘤靶向肽f3，构建f3-cp融合基因，获得f3-ccmv病毒样颗粒。
利用双重不对称pcr和重叠延伸pcr两步pcr法进行融合基因f3-cp(δn26)的合成，其中f3基因插入到n-末端敲除1-26氨基酸残基的ccmvcp(δn26)基因中。
所述的肿瘤靶向肽修饰的豇豆褪绿斑驳病毒样颗粒的表达，具体步骤为：
(1)融合基因f3-cp(δn26)的构建
利用双重不对称pcr(da-pcr)和重叠延伸pcr(oe-pcr)两步pcr法进行融合基因f3-cp(δn26)的合成，其中f3基因插入到n-末端敲除1-26氨基酸残基的ccmvcp(δn26)基因中。
(2)重组表达质粒ppicza-f3-cp(δn26)的构建
通过酶切、连接将融合基因f3-cp(δn26)插入到毕赤酵母穿梭载体ppicza上，获得重组表达质粒ppicza-f3-cp(δn26)。
(3)毕赤酵母的转化、筛选
将重组质粒ppicza-f3-cp(δn26)线性化后转化毕赤酵母，培养、筛选阳性转化株。
(4)重组蛋白f3-cp的诱导表达
对毕赤酵母阳性转化株进行甲醇诱导，离心收集菌体，破壁后通过蛋白凝胶电泳(sds-page)检测f3-cp的表达情况。
(5)重组蛋白f3-cp的纯化
纯化重组蛋白f3-cp，重悬浮于组装缓冲液以获得f3-ccmv病毒样颗粒。
(6)f3-ccmv病毒样颗粒的鉴定
将获得的f3-ccmv病毒样颗粒用透射电镜tem和动态光散射dls检测其形态和粒径大小。
步骤(3)中所述的毕赤酵母为毕赤酵母gs115，培养条件为含有博来霉素zeocin的ypd平板(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉)。
步骤(5)中利用聚乙二醇peg沉降和氯化铯密度梯度离心法纯化重组蛋白f3-cp。
所述的肿瘤靶向肽修饰的豇豆褪绿斑驳病毒样颗粒在识别及杀灭mcf-7肿瘤细胞中的应用。
所述的应用，包括以下步骤：
(1)f3-ccmv-ir780纳米颗粒的制备
利用ccmv可逆的自我解聚/组装结构转换特性，以f3-ccmv病毒样颗粒包载ir780碘化物，经超滤离心、fplc分离，制备f3-ccmv-ir780纳米颗粒；
(2)f3-ccmv-ir780纳米颗粒的体外细胞摄取
以人乳腺癌细胞系mcf-7为指示细胞，f3-ccmv-ir780纳米颗粒对肿瘤细胞的体外摄取和靶向结合能力；
(3)细胞活力检测
通过激光照射诱发ir780的近红外效果，f3-ccmv-ir780纳米颗粒利用光热效应杀灭mcf-7肿瘤细胞。
本发明的有益效果有：
1.将肿瘤靶向肽f3引入ccmv衣壳蛋白cp氨基末端，而不影响病毒样颗粒的自我组装，构建具有肿瘤靶向的病毒样颗粒；
2.f3-ccmv病毒样颗粒来源于植物病毒，对人无传染性，安全可靠；
3.制备的f3-ccmv-ir780纳米颗粒对肿瘤细胞具有光热疗效，可以用于生物免疫靶向治疗。
附图说明：
图1是融合基因f3-cp(δn26)的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，a)融合基因f3-cp(δn26)的pcr扩增结果，采用宝生物100bpdna标准；b)重组质粒ppicza-f3-cp(δn26)的ecori和xhoi双酶切结果，采用大连宝生物1kbdna标准；
图2是重组蛋白f3-cp的sds-page凝胶电泳结果；其中，a)不同毕赤酵母阳性转化株的重组蛋白f3-cp；b)重组蛋白f3-cp的纯化结果；采用dokdo-marktm广泛蛋白标准；
图3是f3-ccmv病毒样颗粒的鉴定结果；其中a)f3-ccmv病毒样颗粒的电镜图，直径约为18nm，插入部分是直径为30nm的野生型ccmv，单位标尺200nm；b)f3-ccmv病毒样颗粒的动态光散射分析，粒径大小为18.2±1.4nm；
图4是f3-ccmv-ir780纳米颗粒的fplc分离结果；插入部分是制备的f3-ccmv-ir780、ccmv-ir780和游离ir780样品(从左到右)；
图5是f3-ccmv-ir780纳米颗粒在mcf-7肿瘤细胞的体外摄取结果；共聚焦显微图像中红色荧光代表ir780碘化物的激发；其中，a)ccmv-ir780处理；b)f3-ccmv-ir780处理；c)游离ir780(乙醇溶液)对照；
图6是f3-ccmv-ir780纳米颗粒对mcf-7肿瘤细胞的细胞活力检测结果；其中，a)不同处理诱发的光热效应；b)不同处理诱发的显微镜检；从左至右依次为pbs，游离ir780(乙醇溶液)，ccmv-ir780，和f3-ccmv-ir780。
具体实施方式：
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过一个具体实施方式，并结合说明书附图附图，对本发明进行阐述。
实施例1重组表达质粒ppicza-f3-cp(δn26)的构建
通过pcr方法将肿瘤靶向肽f3基因插入到敲除氨基末端1-26氨基酸残基的ccmvcp(δn26)基因中，构建融合基因f3-cp(δn26)。ccmvcp氨基末端的1-25氨基酸残基为rna结合结构域，研究表明其敲除或替换并不影响cp二聚体组装成vlps。首先，设计两组具有互补序列的dna寡核苷酸olig-1与olig-c1、olig-2与olig-c2，分别退火得到f3基因和cp(δn26)片段，二者间有50个重叠碱基(表1)。随后，分别以相应的引物(f3-up与f3-dn、cp-up与cp-dn)进行双重不对称pcr(da-pcr)和重叠延伸pcr(oe-pcr)两步基因合成，利用二者间的重叠碱基作为桥联。最后，以两个外部引物f3-up和cp-dn通过一般pcr扩增获得融合基因f3-cp(δn26)，全长585碱基，编码195氨基酸(如说明书附图图1a所示)。
表1构建融合基因f3-cp(δn26)的寡核苷酸及引物序列
195氨基酸序列如下：
将上述得到的融合基因f3-cp(δn26)插入到毕赤酵母穿梭载体ppicza(购自invitrogen公司)，构建重组表达质粒ppicza-f3-cp(δn26)，采用ecori和xhoi双酶切鉴定其分子量大小，得到3.3kb和600bp的预期条带(见说明书附图图1b)。
实施例2f3-ccmv病毒样颗粒的诱导表达与纯化
将重组质粒ppicza-f3-cp(δn26)以saci单酶切线性化后，采用电穿孔法转化毕赤酵母gs115。转化后的毕赤酵母涂布含有100μg/ml博来霉素zeocin的ypd平板(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉)，30℃倒置培养2-3天后，筛选阳性转化株。
将鉴定的阳性转化株接种缓冲甘油复合培养基bmgy和缓冲甲醇复合培养基进行甲醇诱导。离心收集酵母细胞，加入等体积的0.5mm酸洗玻璃珠(购自sigma公司)和5倍体积的破碎缓冲液(ph5.5,50mm磷酸钠,1mmpmsf,1mmedta,5％甘油)，漩涡震荡破碎。离心收集上清，进行蛋白凝胶电泳(sds-page)，检测重组蛋白f3-cp的表达情况(如图2a所示)。
通过聚乙二醇peg沉降和氯化铯密度梯度离心法纯化重组蛋白f3-cp，收集f3-ccmv病毒样颗粒，重悬浮于组装缓冲液(ph5.2,100mm乙酸钠,1mmedta,5mmdtt,0.5mmpmsf)中，sds-page检测纯化效果(见图2b)。
实施例3f3-ccmv病毒样颗粒的鉴定
对纯化后的f3-ccmv病毒样颗粒在透射电镜tem(镍网，2％乙酸双氧铀负染)下进行形态观察，结果表明f3-ccmv为直径约18nm的球形纳米颗粒，小于野生型ccmv病毒颗粒(如图3a所示)。动态光散射dls测定其流体动力学直径为18.2±1.4nm，具有良好的单分散性(见图3b)。这与现有技术中ccmv衣壳蛋白cp被组氨酸标签(his6)和弹性蛋白样多肽(elp)修饰后获得的病毒样颗粒大小类似，应为由120个cp亚基构成(t＝2)的假病毒颗粒，而非野生ccmv由180个cp亚基组成的病毒颗粒(t＝3)。
实施例4f3-ccmv-ir780纳米颗粒的制备
将f3-ccmv病毒样颗粒置于解聚缓冲液(ph7.5,1m氯化钠,20mmtris-hcl,5mmdtt,0.5mmpmsf)透析，温和搅拌加入3mg/mlir780碘化物溶液(溶于乙醇中)，与组装缓冲液再次透析以形成病毒样颗粒。经超滤离心浓缩后以fplc分离，获得f3-ccmv-ir780纳米颗粒(如图4所示)。
实施例5f3-ccmv-ir780纳米颗粒对肿瘤细胞的体外靶向杀伤
将对数生长期的人乳腺癌细胞系mcf-7以2×104细胞/孔接种在8孔板上，加入f3-ccmv-ir780纳米颗粒孵育2小时，固定染色后通过共聚焦激光扫描显微镜观察f3-ccmv-ir780对肿瘤细胞的体外靶向效果，以ccmv-ir780和游离ir780(乙醇溶液)为对照。结果见说明书附图图5，f3-ccmv-ir780处理的mcf-7细胞质周围红色荧光明显增强，表明f3-ccmv-ir780对肿瘤细胞mcf-7有明显的细胞摄取和靶向结合能力。
将对数生长期的mcf-7细胞以4×103细胞/孔接种在96孔板上，37℃培养24小时后代替以含有f3-ccmv-ir780、ccmv-ir780、游离ir780(乙醇溶液)或pbs的培养基，孵育2小时后洗涤两次，用850nm激光(0.6w/cm2)照射细胞5分钟以进行光热处理，37℃孵育12小时后进行cck-8细胞活力检测。结果表明f3-ccmv-ir780对mcf-7细胞具有显著的光热疗效(如图6a所示)，显微镜检也发现在nir激发下大部分mcf-7细胞死亡，基本没有着色(见图6b)。这证明了f3-ccmv-ir780纳米颗粒对mcf-7肿瘤细胞具有良好的靶向性和光热效应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本领域普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110>山东省科学院生态研究所
<120>肿瘤靶向肽f3修饰的豇豆褪绿斑驳病毒样颗粒的构建、表达及其应用
<150>2018100118586
<151>2018-01-05
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>108
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>1
catggtgccaaggtgaaggacgaaccacagagaagatcggcaaggttatctgctaaacct60
gctcctccaaagccagagcccaagcctaaaaaggcccctgcaaagaag108
<210>2
<211>108
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>2
ccgccacggttccacttcctgcttggtgtctcttctagccgttccaatagacgatttgga60
cgaggaggtttcggtctcgggttcggatttttccggggacgtttcttc108
<210>3
<211>108
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>3
gacgaggaggtttcggtctcgggttcggatttttccggggacgtttcttcgtggtccaac60
ctgttattgtagaacccatcgcttcaggccaaggcaaggctattaaag108
<210>4
<211>108
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>4
ctgctcctccaaagccagagcccaagcctaaaaaggcccctgcaaagaagcaccaggttg60
gacaataacatcttgggtagcgaagtccggttccgttccgataatttc108
<210>5
<211>30
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>5
ccggaattcatgggtgccaaggtgaaggac30
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>6
ctttaatagccttgccttggc21
<210>7
<211>27
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>7
gtggtccaacctgttattgtagaaccc27
<210>8
<211>30
<212>dna
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>8
tgcctcgagttaatacactggagtgaaaga30
<210>9
<211>195
<212>prt
<213>人工合成(artificiallysynthesized)
<400>9
lysaspgluproglnargargseralaargleuseralalysproala
151015
proprolysprogluprolysprolyslysalaproalalyslysval
202530
valglnprovalilevalgluproilealaserglyglnglylysala
354045
ilelysalatrpthrglytyrservalserlystrpthralasercys
505560
alaalaalaglualalysvalthrseralailethrileserleupro
65707580
asngluleusersergluargasnlysglnleulysvalglyargval
859095
leuleutrpleuglyleuleuproservalserglythrvallysser
100105110
cysvalthrgluthrglnthrthralaalaalaserpheglnvalala
115120125
leualavalalaaspasnserlysaspvalvalalaalamettyrpro
130135140
glualaphelysglyilethrleugluglnleuthralaaspleuthr
145150155160
iletyrleutyrserseralaalaleuthrgluglyaspvalileval
165170175
hisleugluvalgluhisvalargprothrpheaspaspserphethr
180185190
provaltyr
195