本发明属于病毒检测
技术领域：
，具体涉及一种鸽I型副粘病毒病的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：鸽I型副黏病毒病是由鸽副黏病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病，俗称“鸽瘟”，具有与新城疫病原类似的特性。各种品种、年龄、性别的鸽都易感，发病没有明显的季节性，一年四季都有发生。鸽被I型副黏病毒感染后，潜伏期1-10天，通常1-5天。病鸽表现扭头、曲颈、转圈，有的不能站立,有的翅下垂，有的蹲伏或侧卧。食欲下降，嗉囊空虚，充满液体或气体，倒提口流黏液。拉黄绿色稀便，鸽的羽毛、趾爪常被粪便污染为黄绿色。目前此病无有效的药品。由于该病的死亡率一般可达20％-80％，对养鸽业危害极大，故需一种专门针对鸽I型副粘病毒病的检测试剂盒及其检测方法，及早发现快速诊断。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸽I型副粘病毒病的检测试剂盒与检测方法。技术方案：本发明所述的一种鸽I型副粘病毒病的检测试剂盒，包括两条特异性引物：SPLVGV-1：5’-CACAGTCAAACCCGAACAAAGGATT-3’；SPLVGV-2：5’-GAAGCATAGCGTGCTAAACCCAGTT-3’。进一步的，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。进一步的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明中还提供一种鸽I型副粘病毒病的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品总RNA；(2)设计并合成引物；(3)RT-PCRa.反转录合成cDNA，以鸽I型副粘病毒总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNAb.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR反应；(4)电泳检测吸取2.5μLRT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该鸽I型副粘病毒病的样品中有895bp的核酸条带。进一步的，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚组织的裂解法。进一步的，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。有益效果：本发明提供了一种在检测鸽I型副粘病毒病鉴别诊断的试剂盒与检测方法，利用RT-PCR方法检测鸽I型副粘病毒病，克服了分离鸽I型副粘病毒病核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵活性和可重复性，为鸽I型副粘病毒病的检测提供了有效方法。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。实施例(1)引物设计与合成根据鸽I型副粘病毒小RNA高通量测序分析结果，设计并合成该O型鸽I型副粘病毒的特异性引物：SPLVGV-1(CACAGTCAAACCCGAACAAAGGATT)和SPLVGV-2(GAAGCATAGCGTGCTAAACCCAGTT)；(2)总RNA提取多肽多酚组织裂解法(3)RT-PCRa.反转录合成cDNA以鸽I型副粘病毒总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶为MLV，合成cDNA，反转录体系为：模板RNA600ngSPLVGV-20.5μLRTaseM-MLV0.5μL5×M-MLVBuffer2μLdNTPMixture2μLRNaseInhibitor(40U·μL-1)0.25μLddH2O至10μL轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；b.PCR扩增cDNA2μL2×TaqMix10μLSPLVGV-1(10μmol)2μLSPLVGV-2(10μmol)2μLddH2O至10μLPCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存；(4)电泳检测吸取2.5μLRT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，有895bp的核酸条带，为受鸽I型副粘病毒病侵染的样品，无条带为未受侵染样品。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。当前第1页1 2 3