一种多聚葡萄糖醛酸及其制备方法和在免疫调节药物中的应用与流程

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种多聚葡萄糖醛酸及其制备方法和在免疫调节药物中的应用。
背景技术：
灵芝多糖是灵芝中较为重要的活性成分之一，结构分析显示灵芝多糖主要以高分子量的糖聚合物为主，主要是由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和岩藻糖等单糖形成地糖类大分子组成。不同来源及提取方式所获得地灵芝多糖，具有不同的单糖组成、分子量、分支构象和溶解性等特征，可以诱导多种免疫反应来发挥免疫调节效力。传统的灵芝多糖提取方法主要是水提醇沉、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶法提取。中国专利cn102766221a公开一种灵芝多糖的提取方法，该方法包括复合酶酶解灵芝子实体、超声波处理和灵芝多糖提取。中国专利cn104292357a公开一种灵芝多糖的提取方法，该方法包括从灵芝中提取多糖，采用酶作用条件温和，采用各种不同的酶将灵芝中的脂肪、纤维素酶解，将其中的多糖提取出来，提高灵芝的利用率。中国专利cn104558227a公开一种灵芝多糖的提取方法，包括以下步骤：前处理、粗提取、冷冻提取、醇沉、除蛋白、脱色、超滤、真空干燥。以上专利均不涉及水提之后残渣的研究，而且对残渣的碱提工艺研究较少，所以以多聚葡萄糖醛酸为主的灵芝多糖的制备工艺仍未见相关报道。灵芝是一种名贵的中药材，然而灵芝多糖的提取纯化仍然存在效率较低、水提残渣的再利用途径有限等亟待解决的问题，本发明对水提后的残渣进一步用碱溶液进行提取，通过纯化得到一种以多聚葡萄糖醛酸为主的灵芝多糖，有助于灵芝药材的充分开发和利用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种多聚葡萄糖醛酸及其制备方法和在免疫调节药物中的应用，从赤灵芝水提后的残渣中进一步用碱液分离得到一种天然的多聚葡萄糖醛酸，并用阴离子交换树脂进行纯化，最终得到高纯度的多聚葡萄糖醛酸，通过细胞实验证明该种多聚葡萄糖醛酸能显著促进raw264.7细胞吞噬中性红，可用于制备免疫调节的药物。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：一种多聚葡萄糖醛酸，多聚葡萄糖醛酸分子量为5～500kda，单糖组成以葡萄糖醛酸(glca)和葡萄糖(glc)为主，葡萄糖醛酸含量在50wt％～95wt％之间，葡萄糖含量在5wt％～50wt％之间，其主链连接方式为→3)glca(β1→，glc以支链形式连接在glca主链上。所述的多聚葡萄糖醛酸的制备方法，以赤灵芝为原料，通过热水提取除去水溶性多糖，再用碱液进行提取，提取液用盐酸中和后，浓缩，经浓度为80wt％的乙醇沉淀得到粗多糖；粗多糖经过阴离子交换树脂柱纯化，最终得到高纯度的多聚葡萄糖醛酸。所述的多聚葡萄糖醛酸的制备方法，包括以下步骤：(1)热水提取除去水溶性多糖：将赤灵芝粉碎过60目筛，加入蒸馏水，加热提取1～3次，每次1～3h，除去水溶性多糖，过滤脱水后，赤灵芝的药材残渣烘干；(2)提取多聚葡萄糖醛酸粗品水溶液：将步骤(1)所得药材残渣，加入碱溶液提取1～3次，以4000～5000r/min离心10～30min后，合并收集上清液，加入摩尔浓度0.5～1.5m的hcl水溶液，中和至上清液ph值为中性，将上清液真空减压浓缩至原体积的1/2～1/5；(3)乙醇沉淀得多聚葡萄糖醛酸粗提物：向步骤(2)所得溶液中，加入2～5倍体积的95％纯度的乙醇，室温放置24～72h，以9000～11000r/min离心5～15min分离得固体沉淀，收集沉淀复溶冻干，即得多聚葡萄糖醛酸粗提物；(4)粗品纯化得精制多聚葡萄糖醛酸：将步骤(3)所得多聚葡萄糖醛酸粗提物用蒸馏水溶解，以氯化钠水溶液为流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，经硫酸苯酚法检测，合并收集含有多聚葡萄糖醛酸的组分，经过蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到高纯度多聚葡萄糖醛酸。所述的多聚葡萄糖醛酸的制备方法，步骤(1)中热水提取的料液质量比1:5～1:20，提取温度为60～90℃。所述的多聚葡萄糖醛酸的制备方法，步骤(2)中碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或氢氧化铵的水溶液中至少一种，其摩尔浓度为：0.05～2m，碱提取的料液质量比为：1:3～1:20，提取温度为：-20℃～60℃，提取时间为：0.5～4h。所述的多聚葡萄糖醛酸的制备方法，步骤(4)中氯化钠水溶液的摩尔浓度为0.1～2.5m；阴离子交换树脂为二乙基氨基乙基纤维素(deae-cellulose)、deae-葡聚糖(deae-sephadex)、deae-琼脂糖(deae-sepharose)及qsephadexfastflow中的至少一种。所述的多聚葡萄糖醛酸在制备免疫调节药物中的应用，多聚葡萄糖醛酸通过细胞实验证明能显著促进raw264.7细胞吞噬中性红，用于制备免疫调节的药物，且免疫调节活性与其样品浓度呈正相关。与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：(1)本发明原料为赤灵芝水提残渣，原料来源丰富，安全可靠，可以提高其生物利用率。(2)本发明采用的制备工艺简单，粗多糖产率可达1.5～5％。(3)采用本发明方法制备的多聚葡萄糖醛酸，产品纯度高，分子量为5～500kda，单糖组成以葡萄糖醛酸(glca)和葡萄糖(glc)为主，其中葡萄糖醛酸的含量在50％～95％之间，葡萄糖含量在5％～50％之间，主链连接方式为→3)glca(β1→，glc以支链形式连接在glca主链上。(4)采用本发明所制备的多聚葡萄糖醛酸通过细胞实验证明能显著促进raw264.7细胞吞噬中性红的能力，可用于制备免疫调节的药物。附图说明图1为本发明多聚葡萄糖醛酸的gpc图。图中，横坐标time代表时间(min)，纵坐标relativescale代表相对峰面积。图2(a)-(d)为本发明多聚葡萄糖醛酸的核磁共振谱图。其中，图2(a)为该多聚葡萄糖醛酸1hnmr图谱；图2(b)为该多聚葡萄糖醛酸13cnmr图谱；图2(c)为该多聚葡萄糖醛酸1h-1hcosy图谱；图2(d)为该多聚葡萄糖醛酸1h-13chsqc图谱。图3为本发明多聚葡萄糖醛酸二糖esi-cid-ms2图。图中，横坐标m/z代表质荷比，纵坐标relativeabundance代表各碎片相对丰度。图4为本发明多聚葡萄糖醛酸三糖esi-cid-ms2图。图中，横坐标m/z代表质荷比，纵坐标relativeabundance代表各碎片相对丰度。图5为本发明多聚葡萄糖醛酸对小鼠raw264.7细胞吞噬中性红能力的影响。图中，纵坐标od540nm代表540nm处测各孔吸光度值。注：与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于是实施例表述的范围。实施例1：多聚葡萄糖醛酸的制备本发明多聚葡萄糖醛酸的制备方法具体包括以下步骤：(1)热水提取除去水溶性多糖：将赤灵芝粉碎过60目筛，按料液质量比1:10加入蒸馏水，60℃加热提取2次，每次2h，除去水溶性多糖，赤灵芝的药材残渣烘干。(2)提取多聚葡萄糖醛酸粗品：将步骤(1)所得药材残渣，按料液质量比1:5加摩尔浓度0.05m的naoh水溶液，60℃加热提取4h，提取两次，离心(4500r/min，20min)合并收集上清液，加摩尔浓度4m的hcl水溶液，中和上清液，真空减压浓缩至原体积的1/3。(3)乙醇沉淀得多聚葡萄糖醛酸粗提物：向步骤(2)所得溶液中，加入4倍体积的95wt％纯度乙醇，室温放置48h，离心(10000r/min，10min)，收集沉淀复溶冻干，即得灵芝多聚葡萄糖醛酸粗提物；(4)粗品纯化：将步骤(3)所得多聚葡萄糖醛酸粗提物用蒸馏水溶解，以摩尔浓度0.2m的氯化钠水溶液为流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有多聚葡萄糖醛酸组分，经过蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到高纯度多聚葡萄糖醛酸。实施例2：多聚葡萄糖醛酸的结构表征本发明多聚葡萄糖醛酸的结构表征具体包括以下步骤：(1)绝对分子量测定与纯度分析：采用高效凝胶渗透色谱(hpgpc)-十八角激光光散射法(malls)联用测定多聚葡萄糖醛酸的绝对分子质量并分析纯度。色谱条件：色谱柱：shodexohpaksb804hq色谱柱与shodexohpaksb802.5hq色谱柱串联；流动相：0.1mol·l-1na2so4水溶液；示差检测器与十八角激光光散射仪串联在线检测测定多聚葡萄糖醛酸的分子量；样品在gpc谱图中程单一对称峰(如图1所示，30min之后的峰为nacl)，样品纯度较高，测得其绝对分子质量为42kda。(2)核磁共振谱图分析：取20mg该种多聚葡萄糖醛酸样品进行重水交换后转移到核磁管中，以氘代丙酮为内标，在25℃进行核磁共振谱分析。结果如图2(a)-(d)所示，该种多聚葡萄糖醛酸主要为β-(1→3)连接的葡萄糖醛酸，残基片段主要包括三种形式，a：β-(1→3)-glcap，b：β-t-glcap，c：β-t-glcp。三种残基的化学位移值归纳如表1所示。表1三种糖残基的化学位移值归纳表coderesiduesc1/h1c2/h2c3/h3c4/h4c5/h5c6/h6abaβ-1,3-glcap102.56/4.4172.82/3.2480.74/3.5269.61/3.9675.82/3.65175.14bβ-t-glcap103.07/4.4273.28/3.2773.69/3.5169.29/3.9774.93/3.74175.73cβ-t-glcp101.26/4.7968.09/3.5778.24/3.9178.61/3.5975.38/3.3762.33/3.49，3.43(3)esi-cid-ms2分析：将该种多聚葡萄糖醛酸在加热搅拌下用5～20倍量(w/v，重量体积比)浓度0.01mol/l～2.0mol/l稀酸降解6～8h，反应液冷却后用碱中和，浓缩，离心后上清液减压浓缩得到酸水解寡糖混合物。该混合物经过二级质谱分析，其中含量最高的寡糖片段为两个葡萄糖醛酸组成的二糖，其比例高达66.9wt％，该寡糖esi-cid-ms2图谱如图3所示，质荷比(m/z)369.28处为[m-h]-峰，309.88处为葡萄糖醛酸a0,2断裂片段峰，证明葡萄糖醛酸2位没有被取代，192.99处为两个葡萄糖醛酸之间糖苷键断裂所产生片段的峰，174.92处的峰为片段b脱除一分子水所产生。经计算分子量(mw)＝370.07，为两个葡萄糖醛酸组成的二糖实测分子量，与其理论分子量370.26道尔顿一致，其结构序列为glca-glca。另外还发现少量的两个葡萄糖醛酸和一个葡萄糖组成的三糖，该寡糖esi-cid-ms2图谱如图4所示，质荷比(m/z)369.10处为葡萄糖醛酸与葡萄糖之间糖苷键断裂产生的片段峰，192.98处为两个葡萄糖醛酸之间糖苷键断裂所产生片段的峰。175.03和351.03处的两个峰分别为片段b和片段a脱除一分子水所产生。经计算分子量(mw)＝532.12，为两个葡萄糖醛酸和一个葡萄糖组成的三糖实测分子量，与其理论分子量532.13道尔顿一致，其结构序列为glc-glca-glca。实施例3：多聚葡萄糖醛酸的免疫调节活性测定本发明多聚葡萄糖醛酸的免疫调节活性测定具体包括以下过程：培养raw264.7细胞，种96孔板，每孔细胞数为2万，加药培养24h。24h后，弃上清，pbs洗细胞3次，每孔加入浓度为0.075wt％的中性红100μl，孵育20min后，弃上清，pbs洗细胞3次，每孔加入细胞裂解液200μl，540nm处测各孔吸光度值。同时，mtt法测受试物对raw264.7细胞增殖的作用，吞噬能力以raw264.7细胞吞噬中性红实验吸光度与mtt法测细胞增殖实验的吸光度的比值表示。多聚葡萄糖醛酸对小鼠raw264.7细胞吞噬中性红能力的影响如图5所示，以lps作为阳性对照，结果表明，与模型组相比lps阳性对照组吞噬中性红比率为117％(p＜0.05)，经过多聚葡萄糖醛酸处理后raw264.7细胞吞噬中性红比率分别为119％、125％以及154％。综上，本发明通过将灵芝药材经过热水提取除去水溶性多糖后，再用碱液进行提取，提取液用盐酸中和后，浓缩，经浓度为80wt％的乙醇沉淀得到粗多糖。粗多糖经过阴离子交换树脂柱纯化，最终得到高纯度的多聚葡萄糖醛酸，本发明得到的多聚葡萄糖醛酸分子量为5～500kda，单糖组成以葡萄糖醛酸(glca)和葡萄糖(glc)为主，葡萄糖醛酸含量在50％～95％之间，葡萄糖含量在5％～50％之间，其主链连接方式为→3)glca(β1→，glc以支链形式连接在glca主链上。本发明所制备的多聚葡萄糖醛酸通过细胞实验证明能显著促进raw264.7细胞吞噬中性红，可用于制备免疫调节的药物。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页12