本发明涉及生物化学与分子生物学领域，特别涉及一种新的链霉菌生物合成基因簇负调控因子的遗传筛选方法。
背景技术：
过去几个世纪，科学家们从自然界中分离筛选出了数以万计的天然产物。然而近几十年来，科学家发现并分离新天然产物的难度与日俱增。自本世纪初开始蓬勃发展的基因组学，为我们发现新天然产物指明了新的方向。许多蛋白质在生物体内具有调控作用，其中有一类调控蛋白可以参与基因的表达的调控，它们可以激活或者抑制特定基因的转录水平。研究人员们企图通过寻找特异性的调控因子，激活并高表达生物体内新的次级代谢基因簇，从而发现并分离出更多有意思的化合物。然而，我们遏待简单、准确、高效的分子生物学手段，来寻找被沉默基因簇的途径特异性调控因子，以进一步激活并高表达生物体内被沉默或抑制表达的新化合物合成基因簇。
作为一个强而有力的基因组修饰工具，转座子广泛地被应用于真核细胞的基因改造中。转座子可以随机或特异性地插入基因组中的某个位置，从而影响该位置基因后续转录翻译进程，造成生物体内目的基因的功能缺失。
链霉菌属于放线菌，是革兰氏阳性菌。链霉菌具有复杂的生命周期，包括从基质菌丝、气生菌丝到孢子的形态分化。在链霉菌生命周期的不同阶段，其体内的调控蛋白通过激活或者抑制各种基因的转录水平，调控这些生命周期平稳有序地进行。世界上现在使用的大部分的抗生素都是由链霉菌次级代谢生产。因此链霉菌体内次级代谢产物合成基因簇途径特异性调控因子的发掘研究不论是从基础科研还是从工业生产上来说，都具有极其重要的意义。
调控蛋白对其调控的目的基因簇的调控作用是通过调节目的基因簇的启动子活性进行的。基于以上基础，我们发明了一种新的链霉菌生物合成基因簇未知负调控因子的体内遗传筛选方法。该方法高效，准确，操作方便，为链霉菌体内目的基因簇调控因子的筛选提供了一种新的研究方式。
技术实现要素：
本发明的目的是针对链霉菌体内基因簇调控蛋白的遗传筛选研究，提供一种链霉菌生物合成基因簇负调控因子的遗传筛选方法，是一种调控蛋白体内筛选的新方法。
本发明在链霉菌细胞内构建一个以自身目的基因的启动子介导的报告系统，然后使用基于转座子himar1构建的随机突变体系对带有报告系统的链霉菌进行随机突变。接着将随机突变后的链霉菌菌株进行强化筛选，得到目的基因高表达的链霉菌菌株。第四步通过噬菌体包装的方法，对目的基因高表达的链霉菌菌株的基因组进行包装并筛选出带有随机插入片段的cosmid。最后通过对cosmid的dna测序确定目的基因高表达的链霉菌菌株基因组中随机插入片段插入的位置。具体步骤如下：
(1)选定链霉菌基因组中需要筛选调控因子的目的基因，扩增出目的基因的上游启动子序列；
(2)选择链霉菌体内可用的报告基因系统，构建该报告基因系统在该链霉菌体内可遗传操作的质粒体系，并确定质粒体系中，报告基因上游无启动子；
(3)将步骤(1)中的启动子序列整合入步骤(2)中报告质粒系统内报告基因上游；
(4)将步骤(3)得到的报告质粒通过接合转导入野生型链霉菌中，并验证；
(5)根据选择的报告基因系统，对步骤(4)得到的链霉菌菌株进行报告基因表达水平的阈值筛选；
(6)扩增三个dna片段：①潮霉素抗性基因hph；②潮霉素诱导启动子以及转座子tipap-himar1；③中间加入阿泊拉霉素抗性基因的随机插入片段itr-aac(3)iv-itr；
(7)以质粒pkc1139为骨架，将步骤(5)中扩增出来的三个片段分别插入质粒pkc1139中，得到质粒plrm04；
(8)将步骤(6)得到的质粒plrm04，接合转导入步骤(3)得到的含有报告质粒的链霉菌中，并验证；
(9)将步骤(8)得到的链霉菌菌株进行培养，并在培养过程中加入一定浓度的潮霉素，以激活tipap-himar1基因的表达，启动转座子活性，将itr-aac(3)iv-itr片段随机插入链霉菌基因组后，收集到大量的随机突变菌株；
(10)将步骤(9)得到的随机突变菌株，以步骤(5)得到的报告基因阈值进行筛选，筛选出表型高于步骤(5)阈值的菌株；
(11)将步骤(10)得到的链霉菌菌株进行液体培养后抽提高质量的基因组。并均匀打成一定大小的片段；
(12)使用t4dna聚合酶将步骤(11)得到的片段全部补成平末端，并去磷酸化。将线性化后的cosmid去磷酸化后，使用平末端酶酶切，将与本步骤得到的基因组片段相互连接；
(13)使用噬菌体蛋白包裹步骤(12)得到的连接产物，并侵染大肠杆菌后，涂布于带有cosmid抗性相应抗生素和阿泊拉霉素的lb平板上；
(14)将步骤(13)中lb平板上生长出来的大肠杆菌单菌落扩大培养，抽提cosmid，并测序；
(15)根据步骤(14)的测序结果，使用dna序列比对技术，在链霉菌基因组数据库中比对，精确定位随机插入片段itr-aac(3)iv-itr在链霉菌基因组中插入的位置，以及链霉菌基因组中被破坏的基因；
(16)设计基因敲除方案，对步骤(15)定位的基因进行敲除。并验证该基因对目的基因的调控机制。
本发明中所用到的链霉菌是在实验室条件下可以进行稳定遗传操作的链霉菌。
步骤(2)中选取的报告基因系统为抗性基因报告系统，荧光蛋白报告系统，底物显色报告系统等链霉菌可用的报告基因系统。
步骤(5)中所筛选的阈值对应的是相应的报告系统，抗性基因报告系统对应抗生素浓度上限，荧光蛋白报告系统对应荧光显示强度，底物显色报告系统对应显色强度等。
步骤(12)中使用的cosmid是可以用于噬菌体包装的cosmid。
步骤(13)中所选取的大肠杆菌是可以被噬菌体侵染的大肠杆菌。
步骤(16)中所使用的基因敲除体系是同源重组敲除体系，cosmid敲除体系，crispr/cas9介导的链霉菌敲除体系等可以稳定敲除目的基因的敲除体系。
本发明与现有技术相比具有的优势为：
1)本发明将目的基因启动子在链霉菌体内进行负调控因子的筛选，筛选环境稳定，出来的负调控因子假阳性低，可以极大减少后续调控因子的验证工作，高效，准确，操作方便。
2)本发明对目的基因启动子调控因子在链霉菌基因组上进行全局筛选，筛选通量高，理论上可以筛选出所有目的基因的负调控因子。
3)本发明在链霉菌中应用广泛，所有可以进行遗传操作的链霉菌都可以使用本发明进行目的基因的负调控因子筛选。
4)本发明可以广泛用于工业用链霉菌代谢产物高产筛选改造领域，筛选改造出来的链霉菌代谢产物产量高，遗传稳定性好，适用于工业生产应用。
附图说明
图1：实施例1中使用crispr/cas9体系敲除phar基因：图中1，2，3，4，5为敲除菌株的pcr扩增片段；
图2：实施例1中phar蛋白与dptep启动子的emsa实验结果；
图3：实施例1中phar敲除菌株(δphar)和玫瑰孢链霉菌l30(wt)dpte基因qrt实验结果；
图4：实施例1中phar基因敲除菌株(δphar)与玫瑰孢链霉菌l30(wt)达托霉素摇瓶发酵产量对比；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步详细描述本发明。
实施例1
以使用本方法筛选达托霉素生产菌种玫瑰孢链霉菌l30中dpte基因的负调控蛋白为例。玫瑰孢链霉菌l30是工业生产达托霉素的链霉菌菌株。其基因组序列也被测定并且定位了达托霉素合成基因簇。整个达托霉素合成基因簇中，达托霉素直接合成蛋白由dpte，dptf,dpta，dptbc，dptd等5个基因编码。这五个基因组成一个顺反子，而dpte基因的启动子dptep调控整个顺反子的转录翻译步骤。已有的研究表明，高表达dpte，dptf,dpta，dptbc，dptd等5个基因，可以有效地提高达托霉素的工业发酵产量。因此，我们通过本方法筛选玫瑰孢链霉菌l30基因组中启动子dptep的负调控因子并敲除，以实现该菌株在工业发酵的过程中对达托霉素的高产。具体实施步骤如下：
(1)选定达托霉素生产菌株玫瑰孢链霉菌l30基因组中基因dpte(seqidno:1)，扩增出dpte基因的上游启动子序列dptep(seqidno:2)；
(2)选定玫瑰孢链霉菌l30体内可用的报告基因为卡那霉素抗性基因neo，构建该报告基因系统在该链霉菌体内可遗传操作的质粒体系。以pij8660为骨架质粒，在saci酶切微点将apra抗性基因转换为壮观霉素抗性基因spec，在ndei和noti酶切位点之间插入卡那霉素抗性基因neo；
(3)将步骤(1)中的启动子序列dptep，整合入步骤(2)中报告质粒系统内报告基因上游bamhi和bglii酶切为点之间；
(4)将步骤(4)得到的报告质粒通过接合转导入野生型玫瑰孢链霉菌l30中，并验证；
(5)根据选择的neo卡那霉素抗性基因报告系统，对步骤(4)得到的玫瑰孢链霉菌菌株进行报告基因表达水平的阈值筛选。筛选结果为，在ymg平板上，步骤(4)得到的菌株卡那霉素最高抗性浓度为300μg/ml；
(6)扩增三个dna片段：①潮霉素抗性基因hph；②潮霉素诱导启动子以及转座子tipap-himar1；③中间加入阿泊拉霉素抗性基因的随机插入片段itr-aac(3)iv-itr；
(7)以质粒pkc1139为骨架，将步骤(5)中扩增出来的三个片段分别插入质粒pkc1139中，得到质粒plrm04；
(8)将步骤(6)得到的质粒plrm04，接合转导入步骤(3)得到的含有报告质粒的玫瑰孢链霉菌中，并验证；
(9)将步骤(8)得到的玫瑰孢链霉菌菌株进行培养，并在培养过程中加入4μg/ml的潮霉素，以激活tipap-himar1基因的表达，启动转座子活性。将itr-aac(3)iv-itr片段随机插入链霉菌基因组序列后，收集到大量的随机突变玫瑰孢链霉菌菌株；
(10)将步骤(9)得到的随机突变菌株，以步骤(5)得到的报告基因阈值进行筛选，卡那霉素的筛选浓度为900μg/ml，筛选出高卡那霉素抗性的菌株；
(11)将步骤(10)得到的高卡那霉素抗性菌株进行tsb液体培养后抽提出高质量的基因组，并均匀打成40kb左右的片段；
(12)使用t4dna聚合酶将步骤(11)得到的片段全部补成平末端，去磷酸化。将cosmidphaq31使用限制性内切酶nhei线性化后去磷酸化，再用stui酶切成两段，以分开两个cos位点。将本步骤得到的基因组片段使用t4连接酶相互连接；
(13)使用噬菌体蛋白包裹步骤(12)得到的连接产物，并侵染大肠杆菌dh10b后，涂布于带有氨苄青霉素和阿泊拉霉素的lb平板上；
(14)将步骤(13)中lb平板上生长出来的大肠杆菌单菌落液体扩大培养，抽提cosmid，并测序；
(15)根据步骤(14)的测序结果，使用dna序列比对技术，在玫瑰孢链霉菌sw0702基因组数据库中比对，精确确定随机插入片段itr-aac(3)iv-itr在链霉菌基因组中插入的位置。确定被插入突变的基因为phar(seqidno:3)；
(16)设计crispr/cas9介导的基因敲除方案，对phar基因进行敲除(图1)；
(17)体外表达纯化phar蛋白，使用emsa实验验证phar蛋白与dptep可以相互结合(图2)；
(18)将phar基因敲除菌株和玫瑰孢链霉菌l30进行液体培养，再抽提rna，进行荧光定量pcr分析。结果表明phar基因敲除菌株中dpte基因的表达量是野生型玫瑰孢链霉菌中dpte基因的表达量的2-3倍(图3)；
(19)将步骤(16)得到的phar基因敲除菌株与玫瑰孢链霉菌l30进行发酵(发酵条件见表1)；
(20)将phar基因敲除菌株与玫瑰孢链霉菌l30发酵产物进行hpcl检测(检测结果见图4)。两个菌株的发酵结果表明，phar基因敲除菌株的达托霉素产量明显上升，进一步证明phar基因敲除菌株中达托霉素合成基因簇的高表达。
所述玫瑰孢链霉菌l30，分类命名为：玫瑰孢链霉菌(streptomycesroseosporus)l30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmccno.15745，保藏日：2018年5月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
以上实验结果证明，phar蛋白是dpte基因的负调控因子，其基因敲除菌株中dpte，及其下游基因得到了高表达。从而证明本发明的有效性。
表1：实施例1中玫瑰孢链霉菌的发酵工艺
序列表
<110>浙江大学
<120>一种链霉菌生物合成基因簇负调控因子的遗传筛选方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1794
<212>dna
<213>玫瑰孢链霉菌(streptomycesroseosporusl30)
<400>1
gtgagtgagagccgctgtgccgggcagggcctggtgggggcactgcggacctgggcacgg60
acacgtgcccgggagactgccgtggttctcgtacgggacaccggaaccaccgacgacacg120
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<210>2
<211>407
<212>dna
<213>玫瑰孢链霉菌(streptomycesroseosporusl30)
<400>2
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<210>3
<211>213
<212>dna
<213>玫瑰孢链霉菌(streptomycesroseosporusl30)
<400>3
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