金黄色葡萄球菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法与流程

本发明属于生物芯片领域，具体涉及一种SA夹心DNA杂交技术快速检测用探针、试剂及其检测方法。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛分布于环境、动物和人体的表面，很难被清除。常引起皮肤、组织、器官的化脓性炎症，还可在食品如乳制品、肉制品、鱼类、罐头食品中生长和繁殖，分泌与毒力和致病力有关的肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SETs)，导致食物中毒发生，可造成人和多种动物的感染、死亡。除此之外，金黄色葡萄球菌其还与川崎病、中毒性休克综合征(toxic shock syndrome)密切相关。随着抗生素的不规范使用甚至滥用，已经出现了许多金黄色葡萄球菌耐药性菌株，尤其甲氧西林抗性菌株(MRSA，Methicillin-Resistant S.aureus)已经在全世界范围内流行。根据全国耐药细菌监测网2015年全国细菌耐药监测报告，2012～2015， MRSA检出率均在35％以上，耐药菌株的出现使得抗生素作为医疗手段的效果大大降低。

目前，金黄色葡萄球菌的检测方法主要有生化鉴定方法、免疫学方法、PC R技术和基因芯片技术等。传统生化检测方法应用最广泛，结果准确可靠，但操作耗时费力，不适合大批量样品的检验；酶联免疫吸附试验(ELISA)不稳定，具有可变性和易变形性；PCR易受到样品种类干扰，影响检测灵敏度；基因芯片技术在检测中敏感性高、特异性强，但操作复杂，对于低浓度菌检测效果较差，假阳性率也较高，而且需要需要昂贵的芯片点样仪和扫描仪。

目前国内外尚无利用夹心DNA杂交技术检测SA的试剂盒。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种金黄色葡萄球菌夹心DNA杂交技术快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供上述检测用探针的试剂盒的使用方法。

为了实现上述第一个目的本发明采用如下技术方案：金黄色葡萄球菌夹心 DNA杂交快速检测用探针，包括SA捕获探针和SA检测探针，其中SA捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，SA检测探针的DNA序列为SEQ ID NO.2。

为了实现上述第二个目的本发明提供一种金黄色葡萄球菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，包括包被了poly dT的96孔板、前处理液、菌液裂解液、裂解缓冲液、核酸杂交液、探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液，其中一个微孔反应的用量为：

所述探针液由以下成分组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的6μmol/L的SA捕获探针16μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的6μmol/L的SA检测探针16μL；

合计32μL；

所述前处理液，体积为30μL；

裂解液由所述菌液裂解液与裂解缓冲液裂解获得，体积为30μL(所述两瓶浓的菌液裂解液，为干粉状，每瓶需用6mL裂解缓冲液裂解；所述裂解缓冲液，体积为12mL)；

所述核酸杂交液，体积为96μL；

所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；

所述显色液，体积为150μL；

所述终止液，体积为100μL。

进一步，在上述试剂盒中，所述阳性对照液，为SA菌液，体积为5mL；所述阴性对照液，为非SA菌液，体积为5mL。

为了实现本法明的第三个目的，本发明提了一种金黄色葡萄球菌夹心DNA 杂交快速检测方法，包括如下步骤：

(1)增菌用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养待测液48h，获得待检样品液；

(2)菌液裂解反应将待检样品液、前处理液和裂解液按体积比4﹕1 ﹕1的比例在玻璃管中混合，放入37℃水浴锅中培养5分钟。

(3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT 的微孔中，再按体积比2:1比例混合核酸杂交液和探针液，吸取125μL加到含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育；温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。

(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值- 空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深待测菌浓度越高。

本发明的原理是：根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因特性，分别设计特异性的捕获探针和检测探针两种探针，由捕获探针将靶标核酸片段锚定，在检测探针末端标记辣根过氧化物酶，两种探针与目标菌靶基因特异性结合，确保检测结果的准确性。结果检测可通过催化颜色反应，进行OD值的测定，检测灵敏度可达到55CFU/mL。

夹心DNA杂交是一种简便、快速、高度特异性的核酸分子杂交技术。将夹心DNA杂交技术与PCR技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，假阳性和假阴性率低，结果准确，最大程度地降低样品基质对分析结果的影响；增菌培养时间短，无需提取核酸，样品处理程序简单，减少试验操作及其带来的误差，结果直观。现有的SA检测周期较长，约1～2天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需2小时。本发明应用夹心DNA杂交探针将核酸分子杂交技术运用于SA的快速检测，特异性、准确性比普通PCR方法更高，同时可以免除昂贵的仪器投入，便于出入境和食品安全病原菌检测的推广应用。

本发明的优点是(1)、样品预处理简单，无需提取核酸，直接将菌液作为模版；(2)、高特异性：两条探针特异性地与目标致病菌靶基因结合，根据辣根过氧化物酶是否显色就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高：最低检出限为55CFU/mL；(5)、鉴定简便：只需通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果，显色液加入微孔后变为蓝色且(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性(6)、用途广：可广泛用于SA的安全快速检测。

附图说明

图1：SA的夹心DNA杂交扩增特异性试验结果；

图2：SA的夹心DNA杂交扩增灵敏性试验结果；

图3：阴阳性对照夹心DNA杂交扩增结果；

图1中：1-17分别为：绿脓杆菌、阪崎肠杆菌、河流弧菌、福氏志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弗氏柠檬酸杆菌、创伤弧菌、肺炎克雷伯菌、痢疾志贺氏菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、粪链球菌、β-溶血性链球菌、英诺克李斯特菌、沃氏葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌；18：金黄色葡萄球菌

图2中：1、5.5×10⁷CFU/mL SA菌液，2、5.5×10⁶CFU/mL SA菌液，3、5.5×10⁵ CFU/mL SA菌液，4、5.5×10⁴CFU/mL SA菌液，5、5.5×10³CFU/mL SA菌液， 6、5.5×10²CFU/mL SA菌液，7、5.5×10¹CFU/mL SA菌液，8、5.5CFU/mL SA菌液。

具体实施方式

本发明中无特别说明的反应液，均为市售产品。

实施例1，SA夹心DNA杂交技术快速检测试剂盒包括一块包被了poly dT 的96孔板、一瓶前处理液、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶核酸杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：

探针液由以下成分组成：DNA序列为SEQ ID NO.1的6μmol/L的SA捕获探针16μL；DNA序列为SEQ ID NO.2的6μmol/L的SA检测探针16μL；前处理液，体积为30μL；菌液裂解液，体积为30μL；核酸杂交液，体积为96μL；洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；显色液，体积为150μL；终止液，体积为100μL；以上为一个微孔反应的用量。

所述阳性对照液，管内为SA菌液，体积为5mL；

所述阴性对照液，管内为非SA菌液，体积为5mL。

实施例2，探针的设计

金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)是引起食物中毒的首要原因，而耐热核酸酶能够与肠毒素在基本相同的条件下合成，都会在加热后的食物中存在，并且在食物储存与加工的各种条件下都能保持和肠毒素相似的稳定性，检测食品中的耐热核酸酶可以了解金黄色葡萄球菌及肠毒素的污染情况，从而判定是否有引发食物中毒的可能性。编码耐热核酸酶的nuc基因是金黄色葡萄球菌所特有的基因，而且在不同菌株之间具有较高的保守性。因此根据GenBank公布的SA 的nuc基因参考序列，用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区。采用探针设计软件Primer 5，设计特异性探针，分别标记为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2。其中探针组中捕获探针:SEQ ID NO.1；检测探针:SEQ ID NO.2；体积比为1:1；在捕获探针3’端标记poly dA，在检测探针5’端标记辣根过氧化物酶；所有探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。探针序列如下：

实施例3，阳性对照品的制备

用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养标准阳性SA菌液48h。利用平板菌落计数法测定菌液的浓度，使其浓度控制在1.0×10⁷～1.0×10⁸CFU/mL，一瓶5mL。

实施例4，阴性对照品的制备

用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养大肠杆菌48h，取出分装，一瓶5mL。

实施例5、制备待检样品的菌液模板

取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 培养48h，即为菌液模板。

实施例6、杂交条件的优化

以相同浓度金黄色葡萄球菌菌液为检测对象，分别对探针液浓度(2μM、3μM 、4μM、5μM)、探针杂交液配比(1:2、1:3、1:4、1:5)、杂交温度(35℃、45℃、55℃、65℃)、杂交时间(50min、60min、70min、80min)设计四因素四水平正交试验，确定本检测方法的最优条件。如实施例8所示。

实施例7、特异性和灵敏度

采用上述优化的杂交条件，对标准阳性金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、阪崎肠杆菌、河流弧菌、福氏志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弗氏柠檬酸杆菌、创伤弧菌、肺炎克雷伯菌、痢疾志贺氏菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、粪链球菌、β-溶血性链球菌、英诺克李斯特菌、沃氏葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌等菌液进行扩增，除金黄色葡萄球菌外，其余均无非特异性杂交，参见图1。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。

用灭菌生理盐水梯度稀释阳性SA菌液，采用上述优化的杂交条件进行反应，本发明的最低检测限分别约为55CFU/mL。

实施例8、试剂盒的组装

一块包被了poly dT的96孔板、一瓶前处理液、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶核酸杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。

实施例9、SA夹心DNA杂交技术快速检测方法，包括如下步骤：

(1)增菌用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养SA菌液或待检样品48h，获得SA检测菌液或待检样品液。

(2)菌液裂解反应将SA检测菌液或待检样品液与前处理液和裂解液按体积比4﹕1﹕1的比例在玻璃管中混合，放入37℃水浴锅中培养5分钟。

(3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT 的微孔中，再按体积比3﹕1的比例混合核酸杂交液和探针液(捕获探针和检测探针以1﹕1的比例混合)，吸取125μL加到含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于45℃培养箱中温育70min。温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取 450nm处的吸光度。

(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值- 空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明病原菌浓度越高。

参见图3可以明显得出+含有SA。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 金黄色葡萄球菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

<160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.1

gcgattgatg gtgatacggt ta 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.2

aatatggtcc tgaagcaagt gc 22