基于适配体磁捕获和直接LAMP的福氏志贺菌可视化检测方法与流程

本发明属于食源性致病菌分子生物学检测技术领域，涉及福氏志贺菌基于核酸适配体的磁性捕获和基于直接lamp反应的可视化检测方法。

背景技术：

志贺氏菌(shigella)为一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性杆菌，也是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通常称为痢疾杆菌。人类对志贺氏菌普遍易感，据报道每年全球有1.6亿人患病，约有110万人死亡，绝大多数为5岁以下儿童。在人群密集区，志贺氏菌引起的痢疾爆发和传播速度很快并且难以控制，常常是群体性食物中毒的罪魁祸首。根据其抗原构造不同，志贺氏菌可分为四个主要类群：痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内氏志贺菌。这四个群中，福氏志贺菌是发展中国家(如中国)的主要流行群。

我国自2005年开始，在全国范围内开展了菌痢的监测，福氏志贺菌的报告病例数一直高居全国法定传染病的前5位，由该菌所引起的痢疾占总发病率的70％。目前，志贺氏菌检测的国家标准为微生物检测法：包含富集、分离、纯化和鉴定等步骤。这种检测方法通常需要将抽查样品带回实验室，通过3-7天甚至更长时间才能完成整套检测，既费时费力，又较繁琐，无法满足大量样品快速筛选的要求；此外，志贺氏菌在人体外的存活力较差，只有小部分志贺氏菌可被检测。为了克服传统检测方法的局限，pcr、荧光定量pcr及分子杂交技术已应用于志贺氏菌的检测。这些分子诊断技术虽具有敏感性及特异性强、可大批量检测及避免主观偏差等优点，部分解决了快速检测的需求，但由于试验过程需要专业技术人员及pcr基因扩增仪、杂交仪等昂贵的仪器设备而造成一定的局限性，在实际现场应用中还存在许多困难，难以在基层或者贫困地区推广。因此，开发简便、快捷、灵敏的福氏志贺菌可视化现场检测技术十分必要。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationmethod，lamp)是2000年由日本notomi等人发明的一种等温扩增技术，它起源于核酸扩增原理，针对目的基因的6个区域设计特异性引物，在链置换dna聚合酶(bstdnapolymeraselargefragment)的作用下，通过65℃保温1h实现靶基因的高效扩增。lamp技术最大的优势还在于摆脱了对贵重仪器设备的依赖，仅仅靠普通水浴锅或金属浴即可完成检测。近年来，人们将lamp技术进行了改良，在反应前加入染料对扩增结果进行显色，不需要开盖检测，可直接通过肉眼判断检测结果，真正实现了可视化检测。这项改进使得lamp技术具有良好的现场、野外检测及资源有限的基层实验室检测应用前景。

虽然lamp技术大大简化了食源性致病菌的检测过程，但大部分检测(1)仍需要增菌富集步骤，该过程需要8-18h且要在实验室完成，使得检测时间延长；(2)需要繁琐的致病菌dna提取步骤，增加试验流程和时间，快速检测并不“快”。近年来出现的核酸适配体技术可实现病原菌的快速富集和分离。核酸适配体是利用体外筛选selex技术，从核酸分子文库中得到的单链寡核苷酸序列。它能够特异性地和靶物质结合，具有与单克隆抗体相媲美的亲和力与特异性，与单抗相比核酸适配体还具有靶分子范围广，分子量较低，没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、改造与标记，化学稳定性好，操作方便快捷等优点。本发明人所在实验室利用selex技术，筛选得到了对福氏志贺菌具有较高亲和特异性的核酸适配体序列，这为后续利用适配体对福氏志贺菌进行分离和纯化奠定了基础。简单、有效的dna提取步骤将大大简化分子检测的流程和时间。有研究报道称可简单地通过沸水浴来裂解菌体细胞并释放dna。但是由于食品原料来源广泛、成分复杂，大量的杂质和非目标dna分子会严重影响后续的dna扩增和检测。因此，可利用核酸适配体先对食品基质中的靶标菌(福氏志贺菌)进行特异性的吸附和分离，然后通过热裂解的方式释放菌体dna，可有效去除样品中的dna扩增抑制因子和非目标dna分子，加深检测进程。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种基于核酸适配体磁性捕获的福氏志贺菌富集和分离技术，以及基于直接lamp反应的福氏志贺菌可视化检测试剂盒。利用该技术灵敏准确、操作简便的特性，可视化检测食品样品中的福氏志贺菌，旨在为食源性致病菌的现场检测提供参考。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于适配体磁性捕获和直接lamp反应的福氏志贺菌可视化检测方法：适配体磁性捕获时，所用核酸适配体(特异性吸附福氏志贺菌的核酸适配体)的序列为：5′-ccggactagggctggttagcttcaatactgctgggcgagg-3′。

作为本发明的福氏志贺菌可视化检测方法的改进：lamp反应所用的引物由f3、b3、fip和bip组成；

f3：5′-acagcagtctttcgctgtt-3′

b3：5′-atcccgggcaatgtcctc-3′

fip：5′-accaggagggttttccggagatgctgctgatgccactgag-3′

bip：5′-aggcatcagaaggccttttcgaagaatttcgaggcggaacat-3′。

作为本发明的福氏志贺菌可视化检测方法的进一步改进，依次进行以下步骤：

1)、制备偶联适配体的磁珠溶液：

对核酸适配体的5′端进行生物素标记(可委托上海生工生物工程有限公司)；

取标记的适配体50±2pmol，90±5℃变性5±0.2min、冰浴10±0.5min后，加入到50±2μg地高辛标记的磁珠中(直径约0.8～1.0μm,promegacorp.,madison,wi)，室温放置10～15min；然后，将其放置于磁力架(invitrogen,shanghai,china)上至溶液澄清(约3min)；弃上清，沉淀(即，偶联适配体的磁珠)用te缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)清洗(3次，每次约100±10μl)，最后，将清洗后的偶联适配体的磁珠悬浮到50μlpbs缓冲液(ph7.4)中，得偶联适配体的磁珠溶液；

备注说明：上述清洗的目的是通过磁场吸附去除与磁珠结合不紧密的适配体(上清液)；

2)、目标菌的磁性捕获(即，利用与磁珠相偶联的核酸适配体，通过外加磁场，对福氏志贺菌进行特异性的吸附和分离)：

取1ml待测菌液(约10⁷cfu/ml)，加入50±5μl偶联适配体的磁珠溶液并室温结合45±5min；利用磁分离器分离并收集偶联适配体的磁珠；并将其悬浮到200±10μlpbs缓冲液(ph7.4)中；

备注说明：当待测菌液中含有福氏志贺菌时，适配体的捕获物为福氏志贺菌；若待测菌不是福氏志贺菌，适配体捕获不到其他菌体；

即，上述步骤1)和步骤2)为：先将适配体序列偶联到直径0.8～1.0μm的磁珠上(可通过生物素-地高辛之间的反应偶联)，然后通过外加磁场(磁分离器)分离并收集与磁珠偶联的适配体所捕获到的福氏志贺菌；

3)、菌体dna模板的制备(福氏志贺菌dna提取方法)；

将步骤2)的所得物加ddh2o补足1ml后，放置于100±5℃(金属浴)中加热10±1min后，冰上放置直至冷却至室温(时间约为10min)，得菌体热裂解液；随后，将上述菌体热裂解液转入dna吸附离心柱(所述dna吸附离心柱购于takara大连宝生物公司，货号9763-10)中，离心(12000±2000r/min离心1±0.1min)，得到dna提取液，作为dna模板(4℃保存备用)；

4)、lamp反应：

lamp反应体系(20μl)含有20mmtris-hcl,10mmkcl,8mmmgso4,10mm(nh4)2so4,0.1％tween-20,0.4mbetaine,2mmdntpsmix，0.2μmf3/b3,1.6μmfip/bip,0.64ubstdna聚合酶；

即，20μllamp反应体系为2.0μl10×lamp缓冲液,0.4μlf3(10μm),0.4μlb3(10μm),0.64μlfip(50μm),0.64μlbip(50μm),0.8μlbstdna聚合酶(8u·μl^-1),1μldna模板，加ddh2o至20μl；

并在反应体系(反应液)表面加入石蜡油抑制其蒸发(每20μl的lamp反应体系一般滴加16μl石蜡油)；

反应条件为：65℃保温40min，85℃保温5min；

lamp反应结束后，使所得的反应液与sybri指示剂相混合；如果反应液颜色变为绿色，可判定结果为阳性(有福氏志贺菌)；如果反应液颜色变为橙色，可判定结果为阴性(无福氏志贺菌)。

实际操作时：反应前在管盖内壁滴加0.8μlsybri指示剂；lamp反应结束后，摇晃反应管，使反应液和指示剂混合，肉眼观察反应液颜色变化并判断结果。

在本发明中：

特异性吸附福氏志贺菌的核酸适配体是利用selex技术，使用新鲜福氏志贺菌atcc12022全菌和其他对照菌株，经20轮筛选获得。对照菌株包括大肠杆菌atcc25922、沙门氏菌atcc15611、金黄色葡萄球菌atcc6538、单增李斯特菌atcc19112、宋内氏志贺菌atcc25931、鲍氏志贺菌bncc173713。

具体而言，本发明提供的实验步骤如下：

1)利用与磁珠相偶联的核酸适配体，通过外加磁场，对福氏志贺菌进行特异性的吸附和分离；

2)简单有效的福氏志贺菌dna提取方法；

3)特异性检测福氏志贺菌的lamp引物组；

4)福氏志贺菌的lamp检测试剂盒。

步骤1)，所述利用适配体对福氏志贺菌进行特异性的吸附和分离的具体方法为：体外合成对福氏志贺菌具有较高特异性亲和能力的核酸适配体序列，并对其5′端进行生物素标记(上海生工生物工程有限公司)。取标记的适配体序列50pmol，90℃变性5min、冰浴10min后，加入到50μg地高辛标记的磁珠中(直径约0.8-1.0μm,promegacorp.,madison,wi)，室温放置10-15min。然后，将离心管放置于磁力架(invitrogen,shanghai,china)上3min至溶液澄清。弃上清，沉淀用100μlte缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)清洗3次，通过磁力架去除不与磁珠结合适配体(上清液)。最后，将偶联适配体的磁珠溶解到50μlpbs缓冲液中(ph7.4)。

取1ml待测菌液(约10⁷cfu/ml)，加入50μl偶联适配体的磁珠并室温结合45min。利用磁分离器分离并收集适配体所捕获的福氏志贺菌(沉淀)，并将其溶解到200μlpbs缓冲液中。

所述福氏志贺菌核酸适配体的序列为：5′-ccggactagggctggttagcttcaatactgctgggcgagg-3′。该适配体是通过selex技术，使用福氏志贺菌atcc12022全菌和其他对照菌株，经20轮筛选获得。

步骤2)所述简单有效的福氏志贺菌dna提取方法具体为：取适配体所捕获的福氏志贺菌菌体，ddh2o补足1ml后，放置于100℃的金属浴中加热10min后，冰上放置10min冷却。随后，将菌体热裂解液转入dna吸附离心柱中，12000r/min离心1min，得到dna提取液，4℃保存备用。

步骤3)所述特异性检测福氏志贺菌的lamp引物组：包括外引物f3/b3，内引物fip/bip,具体引物序列如下：

f3：5′-acagcagtctttcgctgtt-3′

b3：5′-atcccgggcaatgtcctc-3′

fip：5′-accaggagggttttccggagatgctgctgatgccactgag-3′

bip：5′-aggcatcagaaggccttttcgaagaatttcgaggcggaacat-3′

步骤4)所述福氏志贺菌的lamp检测试剂盒包括：

①10×lamp缓冲液；配方为：200mmtris-hcl,100mmkcl,80mmmgso4,100mm(nh4)2so4,1％tween-20,4mbetaine,20mmdntpsmix；

②8000u/mlbstdna聚合酶；

③福氏志贺菌的lamp引物组；

④ddh2o；

⑤显色液：sybri指示剂；

⑥密封液：石蜡油；

⑦阳性对照：含有福氏志贺菌ipah基因460bp的dna片段插入pmd18-t载体后形成的质粒，该质粒可在大肠杆菌dh5α中增值；

ipah基因的序列为：5′-cttcgacagcagtctttcgctgttgctgctgatgccactgagagctgtgaggaccgtgtcgcgctcacatggaacaatctccggaaaaccctcctggtccatcaggcatcagaaggccttttcgataatgataccggcgctctgctctccctgggcagggaaatgttccgcctcgaaattctggaggacattgcccgggataaagtcagaactctccattttgtggatgagatagaagtctacctggccttccagaccatgctcgcagagaaacttcagctctccactgccgtgaaggaaatgcgtttctatggcgtgtcgggagtgacagcaaatgacctccgcactgccgaagccatggtcagaagccgtgaagagaatgaatttacggactggttctccctctggggaccatggcatgctgtactgaagcgtacggaagctgaccgctgggcgctgg-3′。

实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pmd18-t-ipah，该质粒转化大肠杆菌dh5α，dh5α增值后碱裂法提取质粒，经质粒纯化试剂盒纯化后，-20℃保存备用。

⑧阴性对照：ddh2o；

lamp检测试剂盒的反应体系(20μllamp反应体系)为：2.0μl10×lamp缓冲液,0.4μlf3(10μm),0.4μlb3(10μm),0.64μlfip(50μm),0.64μlbip(50μm),0.8μlbstdna聚合酶(8u·μl^-1),1μldna模板，加ddh2o至20μl。此外，加入16μl石蜡油覆盖在反应液表明，抑制其蒸发。并在反应管盖内壁滴加sybri指示剂0.8μl。

lamp检测试剂盒的工作原理为：在恒温条件下(65℃)保温40min，85℃保温5min即可完成lamp扩增反应。反应结束后摇晃反应管，使反应液和指示剂混合，肉眼观察反应液颜色变化并判断结果，即绿色为阳性，橙色为阴性。

本发明检测福氏志贺菌具有以下优点：

1)快速高效：整个检测过程可在2h内完成(含菌体富集和样品dna制备时间)，得到定性检测结果；

2)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊的试剂；

3)特异性强：本发明的特异性来自于①与磁珠偶联的适配体对福氏志贺菌的特异性吸附和②lamp特异性引物对福氏志贺菌靶标区域的特异性扩增，故特异性极高；

4)灵敏度高：该检测体系的最低检测极限可达10cfu/ml，比普通pcr高1-2个数量级；

5)适合现场检测：lamp反应结束后，肉眼根据反应液颜色变化判断结果，绿色为阳性，橙色为阴性。

本发明的福氏志贺菌检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高、适合现场检测等优点，为福氏志贺菌的现场检测提供了新的技术支撑，可用于食品生产、销售单位，各级食品安全监管单位和疾病预防控制中心的现场筛查和检测，具有广阔的市场前景，适合于推广应用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为使用本发明的方法对福氏志贺菌检测的特异性考察结果图；从左到右依次为：1.阳性对照；2.福氏志贺菌atcc12022；3.大肠杆菌atcc25922；4.沙门氏菌atcc15611；5.金黄色葡萄球菌atcc6538；6.单增李斯特菌atcc19112；7.宋内氏志贺菌atcc25931；8.鲍氏志贺菌bncc173713。上述管1、管2为绿色，其余为橙色。

图2为使用本发明的方法对福氏志贺菌检测的灵敏度考察结果图；所测福氏志贺菌atcc12022的浓度从左到右依次为：1.10⁷cfu/ml；2.10⁶cfu/ml；3.10⁵cfu/ml；4.10⁴cfu/ml；5.10³cfu/ml；6.10²cfu/ml；7.10cfu/ml；8.1cfu/ml；9.0.1cfu/ml；10.空白对照。上述管1～管7为绿色，管8～管10为橙色。

图3为使用本发明的方法对人工污染牛奶样本中福氏志贺菌的检测结果图，牛奶样品中福氏志贺菌的终浓度从左到右依次为：1.10⁶cfu/ml；2.10⁵cfu/ml；3.10⁴cfu/ml；4.10³cfu/ml；5.10²cfu/ml；6.10cfu/ml；7.1cfu/ml；8.0.1cfu/ml；9.空白对照。上述管1～管6为绿色，管7～管9为橙色。

备注说明：由于提供为非彩色图，因此颜色无法进行有效体现；阳性扩增有白色絮状沉淀物，阴性和空白对照无沉淀。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、福氏志贺菌核酸适配体的筛选：

1.菌体准备：

(1)利用胰酪大豆胨液体(tsb)培养基，37℃培养福氏志贺菌14h，将菌液稀释至1×10⁷cfu/ml；

(2)培养反筛菌，包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、宋内氏志贺菌和鲍氏志贺菌，培养条件与福氏志贺菌相同(即，也将菌液稀释至1×10⁷cfu/ml)。

2.适配体文库的构建和引物合成：

(1)由上海生工生物工程有限公司合成81nt的适配体随机ssdna文库5′-agtatacgtattacctgcagc-n40-cgatatctcggagatcttgc-3′；

(2)由上海生工生物工程有限公司合成文库两端的固定序列作为selex筛选过程中pcr的上下游引物，即fp:5′-agtatacgtattacctgcagc-3′，rp:5′-gcaagatctccgagatatcg-3′；

(3)适配体文库和引物序列用te缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)稀释到100μmol/l，4℃保存备用。

3.适配体筛选过程

(1)取新鲜培养的福氏志贺菌菌液1ml(10⁷cfu/ml)，3500r·min^-1离心5min收集菌体，沉淀用结合缓冲液(0.85％nacl，10mmtris-hcl，ph8.0)洗涤1次后，重新悬浮于100μl结合缓冲液中；

(2)取适配体文库30μl(10μmol/l)，85℃变性5min、冰浴10min后，加入到菌悬液中，30℃与菌体结合1h；

(3)结合反应结束后，3500r·min^-1离心5min，收集沉淀，随后沉淀用结合缓冲液清洗2次；

(4)沉淀中加入100μlte缓冲液，并于85℃加热5min，冰浴10min，使适配体序列与菌体分离；

(5)15000r/min离心10min，收集含适配体序列的上清液；

(6)以上述上清液为模板进行不对称pcr扩增，反应体系为：2μl模板，10μl2×primestarmaxpremix(takara大连宝生物公司)，1μl上游引物(10μmol/l)，0.2μl下游引物(1μmol/l)，6.8μlddh2o。热循环参数为：98℃10s，58℃10s，72℃10s，35个循环；

(7)pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，作为ssdna文库接着用于下一轮的selex筛选；

(8)每2轮正筛后进行1轮反筛，即分别在第3,6,9,12,15,18轮用大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、宋内氏志贺菌和鲍氏志贺菌进行反向筛选。反筛过程与正筛相同，但在结合反应结束后，离心收集不与反筛菌结合的上清液，直接作为模板进行随后的不对称pcr扩增步骤。

4.适配体的克隆测序

(1)以20轮筛选得到的ssdna产物为模板，利用上下游引物进行普通pcr扩增；所述普通pcr扩增的体系为10μl2×primestarmaxpremix(takara大连宝生物公司)，1μl上游引物(10μmol/l)，1μl下游引物(10μmol/l)，模板2μl，6.0μlddh2o。热循环参数为：98℃10s，58℃10s，72℃10s，35个循环。扩增产物经pcr清洁试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)纯化后，与pmd18-t载体相连；

(2)将连接产物(10μl)转入jm109感受态细胞；

(3)随机挑选60个阳性克隆菌落(能在含x-gal(20mg/ml)、iptg(200mg/ml)、amp(20μg/ml)的lb-琼脂平板培养基上生长，且菌落颜色为白色，为阳性克隆菌落)，送上海英骏生物技术有限公司测序；

(4)筛选测序过程中出现频率较高的适配子，送上海生工生物工程有限公司合成；

5.适配体特异性的检测

(1)上海生工生物工程有限公司合成高频适配体序列，并对其5′端进行生物素标记：

5′-biotin-ccggactagggctggttagcttcaatactgctgggcgagg-3′；

5′-biotin-cgtaggcaccggtacgacacagctggtcaggttgggatgg-3′；

5′-biotin-gcgcggagtgagctgcccagtcgtcctcgtactgctcaat-3′；

5′-biotin-cctgggatgcagctcacccacaggtaaggggcgtacgtgg-3′；

(2)准备新鲜培养的福氏志贺菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、宋内氏志贺菌和鲍氏志贺菌；

(3)取生物素标记的适配体序列10pmol，与1ml待测菌液(约10⁷cfu/ml)结合1h；

(4)离心收集菌体并用ddh2o清洗2次；

(5)沉淀中加入100μl辣根过氧化物酶标记的兔抗地高辛抗体igg:hrp(1:1000)，反应10min，离心弃上清；

(6)ddh2o清洗沉淀3次，加入100μlte缓冲液重悬沉淀，并加入200μl新配的显色底物(1mg/mltmb:底物缓冲液：30％h2o2＝100:900:1)；其中底物缓冲液的配方为(0.2m磷酸氢二纳溶液25.7ml，0.1m柠檬酸溶液24.3ml，ddh2o50ml，ph5.0-5.4)。

(7)避光反应10min，加入50μl2mh2so4终止反应，然后测得各个反应管在450nm的吸光度值a450；

(8)各个待测菌同时做一个不加适配体的空白对照；

(9)同时设置阳性对照组，即不加菌液直接以适配体(10pmol)进行地高辛-抗地高辛抗体-过氧化物酶显色反应。该试验共重复3次；

(10)亲和力＝(a450(实验组平均值)-a450(对照组平均值))/a450(阳性对照组平均值)。亲和力越高，表示适配体与所测菌株的亲和特异性越高。

所得的特异性吸附福氏志贺菌的核酸适配体为：5′-ccggactagggctggttagcttcaatactgctgggcgagg-3′。

实施例2、福氏志贺菌可视化检测方法

一、核酸适配体磁珠的制备：

(1)取实施例1制备而得的生物素标记的适配体(5′-biotin-ccggactagggctggttagcttcaatactgctgggcgagg-3′)500pmol，90℃变性5min、冰浴10min；

(2)取500μg(500μl)地高辛标记的磁珠(直径0.8～1.0μm的磁珠)于1.5ml离心管中，加入500pmol适配体，混匀，室温放置10～15min；

(3)将离心管放置于磁力架上3min使溶液澄清，待磁珠完全吸附在磁场一侧后，弃上清；

沉淀用te缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)清洗3次(每次1ml)，通过磁力架去除上清液；

(4)将获得的磁珠(偶联适配体的磁珠)溶解到500μlpbs缓冲液(ph7.4)中，作为偶联适配体的磁珠溶液；4℃保存备用；

二、目标菌的磁性捕获(应用核酸适配体对福氏志贺菌的富集捕获)：

(1)取1ml待测菌液(约10⁷cfu/ml)于1.5ml离心管中，加入50μl偶联适配体的磁珠溶液，室温结合45min；

(2)将离心管放置于磁力架上3min，待偶联适配体的磁珠完全吸附在管壁一侧后，弃上清；再将该磁珠悬浮200μlpbs缓冲液(ph7.4)中；

备注说明：

当待测菌液中含有福氏志贺菌时，适配体的捕获物为福氏志贺菌，即，沉淀为磁珠和菌体细胞复合物；

若待测菌不是福氏志贺菌，适配体捕获不到其他菌体，即，沉淀仅仅为磁珠。

三、菌体dna模板的制备：

(1)取步骤二的所得物，ddh2o补足1ml；

(2)放置于100℃的金属浴中加热10min后，冰上放置10min冷却至室温，得菌体热裂解液；

(3)将全部菌体热裂解液(1ml)转入dna吸附离心柱(takara大连宝生物公司,货号9763-10)中，12000r/min离心1min，得到dna提取液，作为dna模板4℃保存备用；

四、lamp反应及检测结果判定：

(1)配制lamp反应体系：10×lamp反应缓冲液2μl，f3和b3(各10μm)各0.4μl，fip和bip(各50μm)各0.64μl，bst聚合酶(8000u/ml)0.8μl，dna模板1μl，补ddh2o至20μl；

所述10×lamp反应缓冲液：200mmtris-hcl,100mmkcl,80mmmgso4,100mm(nh4)2so4,1％tween-20,4mbetaine,20mmdntpsmix；

引物序列如下：

f3：5′-acagcagtctttcgctgtt-3′

b3：5′-atcccgggcaatgtcctc-3′

fip：5′-accaggagggttttccggagatgctgctgatgccactgag-3′

bip：5′-aggcatcagaaggccttttcgaagaatttcgaggcggaacat-3′

(2)加入作为密封液的石蜡油16μl覆盖反应液(抑制其蒸发)，并滴加0.8μl指示剂(sybri指示剂)加在管盖内壁；

(3)设定反应温度：65℃40min；85℃5min；

(4)反应结束后，混匀指示剂和反应液，静置1min，观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。

实验1、福氏志贺菌可视化检测特异性考察

采用实施例2的方法对5株福氏志贺菌、2株大肠杆菌、1株沙门氏菌、1株金黄色葡萄球菌、1株单增李斯特菌、1株宋内氏志贺菌和1株鲍氏志贺菌进行检测，同时设置了阳性对照；结果显示5株福氏志贺菌均为阳性反应，5株非志贺菌和2株其他志贺菌均为阴性反应，表明本发明对福氏志贺菌的检测特异性强。

阳性对照：含有福氏志贺菌ipah基因460bp的dna片段插入pmd18-t载体后形成的质粒，浓度为100ng/μl，以此作为dna模板(1μl)。

具体如下：

(1)上述福氏志贺菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、宋内氏志贺菌、鲍氏志贺菌均为新鲜培养的菌液，培养条件为：胰酪大豆胨液体(tsb)培养基，37℃培养14h。

(2)上述菌液的预处理方式为：取新鲜培养的菌液1ml(约10⁷cfu/ml)，3500r·min^-1离心5min收集菌体。沉淀用ddh2o洗涤1次后，重新悬浮于1mlddh2o中。然后，利用与磁珠相偶联的福氏志贺菌核酸适配体，通过外加磁场，对靶标菌进行特异性的吸附和分离。

(3)lamp扩增体系为：20μl反应体系中含有10×反应缓冲液2μl，f3和b3各0.4μl，fip和bip各0.64μl，bst聚合酶0.8μl，dna模板1μl(约100ng)，补ddh2o至20μl，加入石蜡油16μl。并将0.8μl指示剂加在管盖内壁后盖紧管盖。反应在水浴锅中进行，维持65℃反应40min。反应结束85℃保温5min使酶失活，并震荡反应管使指示剂与反应液混合，观察颜色变化(石蜡油不参与反应，也不与反应液、染料互溶)。

(4)上述每个样品的lamp扩增均设置了3个重复。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图中得以体现，但平行结果均符合以下条件，即：除阳性对照外，仅福氏志贺菌atcc12022检测样品的lamp反应结果为绿色(阳性扩增)，三平行结果完全一致。

实验2、福氏志贺菌检测灵敏度考察

一、纯培养的菌液中福氏志贺菌灵敏度检测

取1ml新鲜培养的福氏志贺菌至1.5ml离心管中，用无菌生理盐水进行梯度稀释。按照实施例2的方法，取1ml各稀释度菌液(10^-1-10⁷cfu/ml)，加入50μl偶联适配体的磁珠，进行富集分离反应。反应结束后，热裂解提取菌体dna，进行lamp反应并观察反应液颜色变化。同时，以无菌生理盐水为空白对照。检测结果表明，利用本发明的方法对纯培养的福氏志贺菌的检测灵敏度为10cfu/ml(如图2所示)。

具体如下：

(1)福氏志贺菌atcc12022的浓度通过平板计数的方法获得，即取1ml新鲜培养的菌液于灭菌平皿中，平皿中注入15ml凉至46℃营养琼脂培养基，转动平皿使其混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平板，37℃培养48h统计平板内菌落数目。

(2)上述福氏志贺菌atcc12022的各稀释梯度，通过10倍梯度稀释得到。即取1ml原菌液，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，得到1：10稀释菌液，以此类推，得到各个稀释梯度的菌液。

(3)上述每个样品的lamp扩增均设置了3个重复。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图中得以体现，但三平行结果完全一致。

(4)图2的结果显示，利用本发明的检测方法，福氏志贺菌的最低检测限可达10cfu/ml。即当福氏志贺菌的浓度大于或等于10cfu/ml时，lamp反应为阳性，呈绿色；当福氏志贺菌的浓度小于10cfu/ml时，lamp反应为阴性，呈橙黄色。

二、人工污染牛奶样中福氏志贺菌的灵敏度检测

取1ml新鲜培养的福氏志贺菌，用无菌生理盐水梯度稀释到10^-1-10⁷cfu/ml。分别取1ml各稀释度的菌液接种于10ml无菌牛奶脱脂样品中，混匀样本，使牛奶样品中福氏志贺菌浓度为10^-1-10⁶cfu/ml。吸取1ml样本，按照实施例2的方法进行福氏志贺菌的吸附和直接lamp检测。同时，以无菌生理盐水为空白对照。检测结果表明，利用本发明的方法对纯培养的福氏志贺菌的检测灵敏度为10cfu/ml(如附图3所示)，牛奶样品中的成分对福氏志贺菌的检测没有影响。

具体如下：

(1)上述福氏志贺菌atcc12022的各稀释梯度，通过灭菌生理盐水和无菌脱脂牛奶10倍梯度稀释得到。

(2)上述每个样品的lamp扩增均设置了3个重复。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图中得以体现，但三平行结果完全一致。

图3的结果显示，利用本发明的检测方法，福氏志贺菌的最低检测限可达10cfu/ml。即牛奶样品中的成分对福氏志贺菌的检测没有影响。

对比例1、将实施例2中所用的特异性吸附福氏志贺菌的核酸适配体的序列改为如下：

no1、5′-ccggactagggctggttaggaacaatactgctgggcgagg-3′

no2、5′-ccggactagggctggtatccttcaatactgctgggcgagg-3′

no3、5′-ccggactagggcaccttagcttcaatactgctgggcgagg-3′

其余等同于实施例2。

对比例2、将实施例2中lamp反应所用的引物改为如下：

no1、

f3：5′-acagcagaacttcgctgtt-3′

b3：5′-atcccgggcaactacctc-3′

fip：5′-accaggagggttttccggagatgctgctgatgccactgag-3′

bip：5′-aggcatcagaaggccttttcgaagaatttcgaggcggaacat-3′

no2、

f3：5′-acagcagtctttcgctgtt-3′

b3：5′-atcccgggcaatgtcctc-3′

fip：5′-accaggagcaagttccggagatgctgctgatgccactgag-3′

bip：5′-aggcatcagaaggattgttcgaagaatttcgaggcggaacat-3′。

对比实验、按照上述对比例所述方法对实验1进行实验，所得结果如下表1所述：

表1

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的优选实施案例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江工商大学

<120>基于适配体磁捕获和直接lamp的福氏志贺菌可视化检测方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccggactagggctggttagcttcaatactgctgggcgagg40

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

acagcagtctttcgctgtt19

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atcccgggcaatgtcctc18

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

accaggagggttttccggagatgctgctgatgccactgag40

<210>5

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aggcatcagaaggccttttcgaagaatttcgaggcggaacat42