本发明涉及一种检测细胞内cys（半胱氨酸）的双光子荧光探针及其应用，属于生物硫醇荧光探针领域。
背景技术：
细胞内硫醇如半胱氨酸（cys），高半胱氨酸（hcy）和谷胱甘肽（gsh）是在生理上起重要作用基质，包括氧化还原稳态和细胞生长。cys的缺乏会导致许多综合征，例如头发脱色、嗜睡、肝损伤、肌肉酸痛、皮肤损伤和无力。因此，开发在生物样品中识别和检测硫醇生物分子是具有前景和意义的。
尽管生物硫醇与很多疾病息息相关，但是现在医学工作者对cys在体内的代谢机理和致病机制仍不是很清楚。这主要是现阶段缺乏能够在复杂的生理环境中简单、快捷的监测cys的方法。现在常用的检测硫醇的方法有液相色谱、质谱、电化学方法、毛细管电泳和比色测定。这些方法大多需要复杂昂贵的仪器和艰难的预处理程序，比如分离和纯化。此外，由于它们在样品制备过程中操作繁琐的局限性，它们中很少适用于细胞内检测体内研究。因此使用这些方法，不能实现在生物样品中实时监测cys浓度变化这一生理过程。因此，发展一种简单快捷的测试活生物样品中的cys含量的方法尤为重要。荧光探针具有操作简单，拥有高灵敏度和选择性，抗干扰能力强等优点，加上本身的毒性很低，因此具有在或生物样品中实时监测cys浓度动态变化的潜在应用价值。
现阶段，所报道的cys荧光探针并不是很多，尤其是缺乏能够进行深层次穿透的双光子cys荧光探针。因此，现阶段，开发一些背景干扰小、散射干扰小、灵敏度和选择性更高，能够避免光漂白和光致毒现象产生的双光子cys荧光探针尤为重要。
技术实现要素：
针对现有技术中缺乏深层次穿透的双光子cys荧光探针的问题，本发明提供一种背景干扰小、散射干扰小、灵敏度和选择性高，能够避免光漂白和光致毒现象的双光子cys荧光探针。
本发明的另一目的是提供一种简便地合成上述区分荧光探针的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测cys的双光子荧光探针，化学名称为7-（二乙基氨基）-2-氧代-2h-色烯-3-基丙烯酸酯，简称co-cys，其结构式如式（i）所示：
式（i）。
一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
（1）7-二乙胺基-4-羟基香豆素（1）在hcl溶液中加热反应，合成7-二乙氨基-3-羟基香豆素（2）；
（2）将7-二乙氨基-3-羟基香豆素（2）与丙烯酰氯（3）在二氯甲烷中搅拌反应得终产物，即7-（二乙基氨基）-2-氧代-2h-色烯-3-基丙烯酸酯。
7-二乙胺基-4-羟基香豆素与hcl的摩尔比为1:30。
所述hcl溶液为浓度为1-1.5mol/l。
步骤（1）中，反应温度为100℃；反应时间为3-4h。
7-二乙氨基-3-羟基香豆素与丙烯酰氯的摩尔比为1:2。
步骤（2）中，反应温度为25℃，反应时间为12h。
步骤（2）中还包括对产物分离提纯的步骤：反应液减压蒸出溶剂，干燥后的固体过硅胶柱层析，淋洗剂为二氯甲烷/石油醚（v/v=5:1）。
合成路线如下：
一种上述荧光探针用于单光子或双光子检测溶液和细胞中cys的应用。
本发明中荧光探针的识别机理如下：
本发明的检测cys的荧光探针co-cys本身由于丙烯酸甲酯基和香豆素结构的强拉电子能力导致分子荧光的淬灭，当探针与cys分子作用后，化合物co-cys被还原成7-二乙氨基-3-羟基香豆素，由于羟基和香豆素结构的强推拉电子作用使ict效果变强，导致荧光强度得到大幅度提升，以荧光增强方式实现对cys的识别。
识别反应如下：
本发明具有以下优点：
本发明的co-cys荧光探针可灵敏的检测溶液尤其是细胞中cys的存在；在低浓度下即可与细胞中cys反应，抗多种活性氧、氨基酸及含巯基化合物的干扰。本发明的co-cys荧光探针具有双光子性质，能够避免光漂白和光致毒现象；可穿透组织进行深层成像，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为co-cys的1hnmr谱图；
图2为co-cys的13cnmr谱图；
图3为co-cys荧光探针对不同分子或离子的选择性；
图4为不同浓度的cys下co-cys的荧光强度；
图5为与cys不同反应时间时co-cys的荧光强度；
图6为co-cys对外源cys细胞成像图；
图7为co-cys对活组织切片外源cys成像图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1co-cys荧光探针的合成
（1）在100ml圆底烧瓶中，加入7-二乙氨基-3-氨基香豆素（1）1mmol，在20ml浓度为1.5mol/l的盐酸水溶液中加热至100℃，反应完成后抽滤，滤饼即为7-二乙氨基-3-羟基香豆素（2）。其中盐酸水溶液为；反应时间为4小时，产率：91%；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.51(s,1h),7.29(d,j=8,8hz,1h),7.02(s,1h),6.65(dd,j1=8.8hz,j2=2.3hz,1h),6.51(d,j=2.3hz,1h),3.38(dd,j1=14.4hz,j2=7.4hz,5h),7.62(t,j=7.0hz,6h);13cnmr(126mhz,dmso)δ159.50,152.02,148.10,137.47,127.55,117.53,109.67,108.86,97.41,44.33,12.79；产物不经提纯直接进行下一步：
（2）将上步获得的化合物7-二乙氨基-3-羟基香豆素（2）与丙烯酰氯（3）2mmol在10ml二氯甲烷中搅拌，反应温度为25℃，反应时间为12h，减压蒸馏，真空干燥，以二氯甲烷/石油醚（v/v=5:1）为淋洗剂进行硅胶柱层析，得到化合物7-（二乙基氨基）-2-氧代-2h-色烯-3-基丙烯酸酯（4）；产率：67%。其1hnmr和13cnmr谱图如图1和图2所示：
1hnmr(400mhz,dmso)δ=7.93(s,1h),7.45(d,j=8.9,1h),6.77(dd,j1=8.9hz,j2=2.3hz,1h),6.61(m,1h),5.99(ddd,j1=22.6hz,j2=10.7hzj3=5.5,1h),5.42(dd,j1=17.2hz,j2=1.4hz,1h),5.32(dd,j1=10.5hz,j2=1.0hz1h),4.75(m,2h),3.44(q,j=7.0,4h),1.12(m,6h)；
13cnmr(126mhz,dmso)δ=157.35,154.94,152.61,150.84,133.00,131.95,130.40,129.91,119.46,110.09,106.45,97.13,69.63,44.53,40.48,40.31,40.15,39.98,39.81,39.64,39.48,12.72；
实施例2co-cys荧光探针对不同分子或离子的选择性
将实施例1中co-cys荧光探针配制成浓度为1mm的母液。
将下列物质：氯化钙、氯化镁、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸氢钠、硫化钠、硫酸钠、硫酸亚铁、碘化钾、溴化钠、次氯酸钠、过氧化氢、叔丁基过氧化氢、丙酮酸钠、甲醛、乙醛、三氯乙醛、乙二醛、cys、hcy和gsh以磷酸缓冲液（0.01mm，ph=7.4）配制成5ml浓度为40mm的母液。
取22支试管，分别加入25μl探针母液、1mldmso和各离子或分子的母液，对照以等量水代替干扰物质；用磷酸缓冲液（0.01mm，ph=7.4）定容至5ml，使干扰物质的终浓度为0.1mm。各溶液摇匀后50min进行荧光检测（λex=400nm,λem=496nm）。以荧光强度为纵坐标，以不同分子或离子为横坐标作图3；其中，1-22分别为探针co-cys、氯化钙、氯化镁、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸氢钠、硫化钠、硫酸钠、硫酸亚铁、碘化钾、溴化钠、次氯酸钠、过氧化氢、叔丁基过氧化氢、丙酮酸钠、甲醛、乙醛、三氯乙醛、乙二醛、cys、hcy和gsh。由图3可以发现，其他离子或分子的加入荧光强度几乎没有影响，而含硫醇类的氨基酸（hcy、cys、gsh）的加入使化合物co-cys的荧光显著增强，其中加入cys时增强最显著。
实施例3不同浓度的cys下co-cys的荧光强度
配制10ml浓度为100mmcys的母液，并用水稀释为0-55μm共18个浓度，以水为对照。将实施例2中co-cys母液稀释为5μm，分别加入不同浓度的cys，反应50min后进行荧光检测（λex=400nm,λem=496nm），检测各体系中荧光强度，以荧光强度-cys浓度作曲线，如图4所示。由图可知，随着cys浓度的增加，反应体系荧光强度增强，cys浓度为2.5-50μm时，有较好荧光强度-浓度线性关系；当cys浓度达到55μm时，反应体系荧光强度达到饱和状态。
实施例4与cys不同反应时间时co-cys的荧光强度
配制10ml浓度为100mmcys的母液。取将实施例2中co-cys母液和上述cys母液，稀释为含探针5μm；cys浓度分别为0、10、25和55μm的溶液，进行荧光检测（λex=400nm,λem=496nm），每隔5min测试各体系中荧光强度，测试50min，以荧光强度-作用时间作曲线，如图5所示。由图可知，随着cys反应时间的增加，反应体系荧光强度增强，大约反应45min，反应体系荧光强度达到饱和状态。
实施例5co-cys荧光探针对外源性cys细胞成像
将本发明荧光探针co-cys应用于hela细胞中进行荧光成像，得图6，第1-3列小图分别为明场、单光子、两者叠加图像，具体操作步骤如下：
（1）将3份密度为3×105个/ml的hela细胞在温度为37℃，co2浓度为5%的培养箱中培养至细胞贴壁；
（2）一份细胞在原条件下孵育30min后制样成像；
（3）取一份细胞，加5μmco-cys孵育30min，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜下分别明场、单光子、两者叠加成像，激发波长为405nm，发射波段为450-500nm；
（4）取另一份细胞，加5μmco-cys孵育30min，加入cys孵育30min后，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜成像，条件同上。
由图6可知，荧光探针co-cys可以与细胞内外源性cys反应使细胞发出强烈荧光。
实施例6co-cys荧光探针对活组织切片外源性cys成像
将本发明荧光探针co-cys应用于小鼠肝脏中进行双光子荧光成像，得图7，其中图a为探针孵育成像，图b为探针与cys共孵育成像；孵育具体操作步骤如下：
（1）昆明小鼠脱颈椎处死后，解剖取肝脏，制成肝脏切片；
（2）将一部分肝脏切片浸泡在含有浓度为30μm探针溶液的组织培养液中，培养箱培育90min；
（3）另一部分肿瘤切片浸泡在含有浓度为30μm探针溶液的组织培养液中，培养箱培育；30min后，将组织培养液吸走，更换成含有100μmcys的组织培养液再孵育60min；
（4）将两组实验组的组织培养液吸走，用pbs缓冲液冲洗3次，依次在双光子条件下进行荧光成像（激发波长：760nm，发射波段：500-550nm）。
由图7可知，加入cys培养液浸泡的实验组的组织切片发出的荧光明显较强，其穿透能力达到了130μm。