背景技术：
在生物制药行业，病毒学安全是很重要的问题。尽管为了减小风险做出了很多努力，但是生物制品的包含大规模病毒污染的事件已经在行业内受到广泛关注。具体描述的事件包含，例如genzyme于2009年在它的cho(中国仓鼠卵巢)细胞培养基中检测到水泡疹病毒属2117污染，该事件阻止了和的生产；以及默克于2010年在疫苗中检测到猪圆环病毒1污染。一个可能的污染源发生于细胞培养阶段。除了对生产企业造成的经济压力(一个报告中，估计每10000l生物反应器遭受的污染加上来自机构的罚款可以导致上亿的损失)，这种事件也会给病人带来风险并中断生物制药产品的制备(liuetal.,biotechnol.prog.2000,16,425-434)。其结果是，监管审查加强，以及对病毒污染的检测、防止和补救技术的需求也在加强。总体而言，病毒污染可以被分为上游病毒污染和下游病毒污染。下游污染可以通过使用封闭系统控制，然而，特别是，上游污染难以控制，其甚至难以通过大量的测试检测。病毒污染也可能源自于在生物制药生产中所使用源自动物的材料。其中，所述生产细胞系没有外源病毒污染物，而且生产不涉及使用源自动物的材料，但病毒污染物仍然可以通过细胞培养基进入。例如，合成培养基中可能添加了由含有血清的系统产生的重组生长因子，然而无蛋白培养基可能包含过滤后的蛋白水解物。然而，病毒污染甚至可发生于整个化合物成分清楚的培养基中，这是因为大量的培养基成分可能保存在未经灭菌的容器中。传统的除菌级滤器既没有设计预防病毒污染物，也不能够防范病毒污染物，所以需要使用其他措施以确保病毒安全性。在生产过程中的一个或多个检查点进行外来病毒的检测是一种标准操作。然而，对于生物制药产品的病毒污染来说，单独的检测是一种不充分的措施，特别是，病毒污染物的存在是未预测的、未知的或是一种新兴病毒制剂。这种病毒制剂甚至能够逃脱精心设计的对大量病毒测序的dna微阵列的检测。该挑战还包含感染细胞培养基所需的低水平的病毒污染物以及目前有限的检测试验灵敏度。高滴度的病毒污染物可能不以改变细胞培养参数(例如，超出它们的正常范围的培养密度、蛋白滴度)的形式而显现。另一方面，感染力试验具有高度特异性，并且每种病毒需要不同的条件。由于病毒污染，下游设备、流体和产品可能被污染，批次装备、废物处理、销售丧失和净化会导致百万美元。由于样品的异质性和涉及的生物制药生产过程的大体积，因此，难以彻底的筛选原材料中的病毒。清除病毒的技术可以被分为两组：灭活和过滤。灭活方法导致病毒感染力不可逆的损失，然而，过滤方法力图机械性地减少病毒污染物。传统的灭活方法使用暴露于紫外线(uv)照射、γ照射、加热、低或高ph、或溶剂/清洁剂的方法。例如，uv照射能够有效地且不可逆地消除病毒活性，但是对于大规模生产可能是无法操作的或者对于成品培养基是不适合的。高压灭菌法虽然对于热稳定液体是可行的，但是可能改变敏感型的培养基。一种已知的替代方法是高温短时(htst)热处理，其虽然不苛刻，但是需要昂贵的设备、自动化程序和验证程序以维持培养基特征。暴露于低或高ph的方法，对于可能的病毒污染物范围是不起作用的，其会不利地影响培养基的质量或渗透性。暴露于溶剂/清洁剂的方法，同样不是一个广谱方法，其仅对含有脂质膜的病毒有效。因此，理想的方法应该在成本考虑和达到清除原材料病毒的需求之间取得平衡，并能提供一种不影响生长速度或产量的广谱解决方案。病毒保留过滤提供了适当的平衡。它不会用化学方法改变培养基成分，也适合用于热敏感型饲料/培养基。此外，由于它以体积排阻原理起作用，因此，病毒保留过滤是一种广谱解决方案。然而，病毒保留滤膜是很昂贵的(大约每平方米约2000至5000欧元)。由于所需膜面积的费用，培养基体积过滤的比流速(specificflowrate)低的特征使得该方法对于适于大规模生物反应器的大规模生产造成了经济负担。例如，其中，病毒过滤以串联形式连接，以进行无菌级培养基过滤，病毒过滤优选在一个工作日内完成，即在制备大批量(bulk)培养基后最长2至10小时，以防止大批量培养基的污染。因此，在此关键时间窗内需要大的过滤面积，但这反过来会增加成本。令人惊异地发现，所述现有技术中的病毒过滤的缺点可通过各自制剂(其为细胞培养基或细胞培养基的至少一个成分)在病毒过滤器上进行至少大约24小时的过滤来克服，其中，该病毒过滤器具有最大75nm的有效孔径。如果各自制剂所需的体积在较长时间范围内过滤，例如至少24小时，那么病毒过滤器的容积需要极大地增加。此外，还令人惊异地发现，通过这种延长时间，可以实现总体病毒滴度的显著降低。这对于细胞培养系统中的上游病毒清除是特别有益的。因此，本发明的方法通过分别增加生产量和容积来加强病毒过滤的经济效率。根据本发明所述的方法在容积为至少2000l/m2时进行，因此，有助于使高容量病毒过滤器的利用最大化，并降低与之相关的实际成本，并提供了一个适于大规模生产和易于融合到现存生产过程的解决方案。本发明所述方法的巨大影响和各自病毒过滤器在无菌生产过程中的创造性使用，特别是无菌制备过程，例如，所使用的细胞培养基和缓冲液可以通过以下实施例的方式来理解。假设每平方米病毒滤膜的成本为平均大约3000欧元，所用细胞培养基的成本为每升培养基大约10欧元，那么1000l病毒滤过的培养基的成本为每升培养基13欧元，这使得培养基制剂的成本增加了30％。如果可以用一个病毒过滤器膜过滤2000l，那么成本降低到11.50欧元。容积的进一步增加，例如超过5000l，则可以把成本降低到每升培养基低于0.6欧元，这使得提供的病毒过滤后的培养基的额外成本相当低。因此，通过增加病毒过滤方法的容积，可显著地降低所使用的病毒过滤器的高成本，特别是对潜在病毒或病毒污染的上游排除污染的成本。本发明分别全面地阐述了病毒过滤器的高成本和低容积问题。可凭借经病毒过滤器进行至少大约24小时的病毒过滤来增加病毒过滤器的容积，其中，该病毒过滤器具有最大75nm的有效孔径。令人惊异地发现，在维持过滤器完整性的同时，所用昂贵的病毒过滤器的容积可以更好地利用至容积增加2～100倍。虽然容积增加2至3倍对生产过程和相关生产成本有很大影响，但是根据本发明所述的方法可以实现容积增加至100倍或甚至更多。这提供了很好的机会，并使得即使使用昂贵的病毒过滤器，病毒清除的成本也变得高效；因此，昂贵的病毒过滤器可以用于进一步改善细胞培养过程中的病毒安全性，特别是用于改善细胞培养过程、制药、诊断和/或化妆品和食品过程中的上游病毒清除。技术实现要素：本发明提供了一种从制剂中清除病毒污染的方法，其中，该制剂为一种细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。该方法包含使所述制剂通过最大有效孔径为75nm的病毒过滤器过滤至少大约24小时。进一步地，本发明涉及使用最大有效孔径为75nm的病毒过滤器用于过滤至少大约24小时，以清除制剂中的病毒污染物，其中，该制剂为一种细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。此外，本发明涉及制剂在细胞培养、制药、诊断和/或化妆品制品以及食品制品中的用途，其中，该制剂为根据本发明的任意一种方法所获得的细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。根据本发明所述的所有方法和用途所使用的容积为至少大约2000l/m2，优选至少大约3000l/m2，最优选至少大约5000l/m2。此外，所述制剂需要经过过滤，并且分别进行过滤至少24小时、或至少大约48小时至大约7个月、或大约72个小时至大约3个月。该过滤在大约2℃至大约60℃的温度之间，或在大约10℃至大约40℃的温度之间，优选在大约15℃至大约37℃之间进行。在本发明所有实施方式中，过滤在压力范围为大约100mbar至大约4000mbar之间，优选在大约200mbar至大约3500mbar之间，最优选在大约1000mbar至大约3000mbar之间进行。在本发明的所有实施方式中，所使用的病毒过滤器为病毒污染物实现至少1log10减少值(lrv)。令人惊异地发现，当过滤程序进行至少大约24小时，病毒过滤器的容积可以大大增加。通常地，在大批量制剂制备之后，用于细胞培养的制剂例如大批量细胞培养基或缓冲液在大约2至大约10小时以内分批过滤，以避免制剂被细菌或病毒污染。其结果是，在实践中，过滤程序中所使用的病毒过滤器的最大容积几乎没有被利用，所述过滤程序在时间框架为大约2至大约10小时内过滤各自制剂。因此，需要使用过多的过滤面积。相比之下，已经发现，由于使用本发明所述的方法，在维持过滤完整性的同时，所用昂贵的病毒过滤器的容积可以被利用至容积增加2～100倍。虽然容积增加2至3倍对生产过程和相关生产成本有很大影响，但是根据本发明所述的方法可以实现容积增加至100倍或甚至更多。这提供了很好的机会，并使得即使使用昂贵的病毒过滤器，病毒清除的成本也变得高效；因此，昂贵的病毒过滤器可以用于进一步改善细胞培养过程中的病毒安全性，特别是用于改善细胞培养过程、制药、诊断和/或化妆品和食品加工中的上游病毒清除。本发明提供了一种从制剂中清除病毒污染物的方法，所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分，所述方法包含步骤：a)使所述制剂通过最大有效孔径为75nm的病毒过滤器过滤至少大约24小时。根据本发明提供的方法，在容积为至少大约2000l/m2、优选至少大约3000l/m2、最优选至少5000l/m2下进行所述过滤。根据本发明提供的方法，其中，使所述制剂进行至少大约48小时至大约7个月、优选大约72小时至大约3个月的过滤。本发明提供的方法还包含步骤：b)将滤液供给至细胞培养或供给至作为细胞培养基成分的其它成分。根据本发明提供的方法，其中，所述过滤是连续过滤。根据本发明提供的方法，其中，过滤在大约2℃至大约60℃、优选大约10℃至大约40℃、最优选大约15℃至大约37℃的温度下进行。根据本发明提供的方法，其中，所述病毒过滤器为病毒污染物实现至少1log10减少值(lrv)，优选为病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)，最优选为病毒污染物实现至少6log10减少值(lrv)。根据本发明提供的方法，其中，使用两个或两个以上的过滤器以串联、并联或两者组合的方式进行过滤。根据本发明提供的方法，其中，使用在含有y型结点的管系统中并联的两个过滤器进行过滤，其中每个过滤器与y型结点的分支和制剂供应源处于流体相通。根据本发明提供的方法，其中，在大约100mbar至大约4000mbar、优选大约100mbar至大约3500mbar、最优选大约1000mbar至大约3000mbar的压力范围内进行过滤。根据本发明提供的方法，其中，所述病毒过滤器是耐高温高压型病毒过滤器。根据本发明提供的方法，其中，所述细胞培养基包含大豆水解液。本发明还涉及最大有效孔径为75nm的病毒过滤器的应用，用以至少24小时的过滤以从制剂中清除病毒污染物，所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。根据本发明涉及的上述应用，其中，在容积为至少2000l/m2、优选至少3000l/m2、最优选至少5000l/m2下进行所述过滤。根据本发明涉及的上述应用，其中，所述过滤进行至少大约48小时至大约7个月，优选大约72小时至大约3个月。根据本发明涉及的上述应用，其中，所述过滤为连续过滤。根据本发明涉及的上述应用，其中，在大约2℃至大约60℃、优选大约10℃至大约40℃、最优选大约15℃至大约37℃的温度范围内进行过滤。根据本发明涉及的上述应用，其中，所述病毒过滤器为病毒污染物实现至少1log10减少值(lrv)，优选为病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)，最优选为病毒污染物实现至少6log10减少值(lrv)。根据本发明涉及的上述应用，其中，使用两个或两个以上的过滤器以串联、并联或两者组合的方式进行过滤。根据本发明涉及的上述应用，其中，使用在含有y型结点的管系统中并联的两个过滤器进行过滤，其中每个过滤器与y型结点的分支和制剂供应源处于流体相通。根据本发明涉及的上述应用，其中，在大约100mbar至大约4000mbar、优选大约100mbar至大约3500mbar、最优选大约1000mbar至大约3000mbar的压力范围内进行过滤。根据本发明涉及的上述应用，其中，所述病毒过滤器是耐高温高压型过滤器。根据本发明涉及的上述应用，其中，所述细胞培养基包含大豆水解液。本发明还涉及一种制剂在细胞培养、制药、诊断和/或化妆品制品以及食品制品中的应用，其中所述制剂为根据本发明提供的上述方法所获得的细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。根据以下特定实施方式和权利要求项的更具体描述，会使本发明特别优选的实施方式更加明显。附图说明本发明进一步特别优选的说明可参考如附图所示的特定典型实施方式。这些附图构成说明书的一部分。然而，需要注意的是，这些附图是为了举例说明本发明的实施方式，因此，不能将其理解为是对实施方式范围的限制。图1表明使用不同的过滤器进行流速可控的病毒过滤的病毒过滤动力学(图1c)，其中，所述过滤器都结合添加了3批不同大豆水解液的细胞培养基(kerryhypep1510#1、domose50mafuf#1和#2)。所使用的过滤器和实验条件(同样见实施例1至实施例4)如下：过滤器a：sartoriusvirosartcpv，180cm2；在30℃下，流速为大约30l/(m2×hr)；过滤器b：；在30℃下，流速为大约40-60l/(m2×hr)。过滤进行最多9天或直到超过最大压力2000mbar。图1a表明每单位膜表面积的过滤体积相对于时间的容积，在大约最低4000l/m2至大约12000l/m2的范围内。取决于过滤器类型，过滤终点的最大压力在大约600mbar至2400mbar(图1b)之间。一般而言，大豆水解液之间的区别对于容积和最大压力的影响非常地低。图2表明使用不同的过滤器和结合添加了3批不同大豆水解液的细胞培养基(kerryhypep1510#1、domose50mafuf#1和#2)，进行流速可控的病毒过滤的病毒过滤动力学(图2c)。所使用的过滤器和实验条件(同样见实施例1至实施例4)如下：过滤器a：sartoriusvirosartcpv，180cm2；在30℃下，流速为大约30l/(m2×hr)；过滤器d：asahibioex10cm2；室温(大约22℃)，流速为大约20l/(m2×hr)。和图1中的实验相比，该过滤进行了更长的时间跨度长达81天或直至达到2000mbar的压力。图2a表明每单位膜表面积的过滤体积相对于时间的容积，在大约最低16000l/m2(过滤器a及domose50maf#2)至大约35000l/m2(过滤器d及3组不同的水解液)的范围内。取决于过滤器类型，过滤终点的最大压力在大约1200mbar至2000mbar之间(图2b)。一般而言，大豆水解液之间的区别对于容积和最大压力的影响非常地低。图3是显示使用过滤器a(sartoriusvirosartcpv180cm2)和包含大豆水解液domose50mafuf批次#2时在大约22℃观察到的流量和压差之间的关系(见实施例5)的图。达到可检测到的最低比流速的所需最低压力差为大约100mbar，然后，比流速和压差之间逐渐增长呈明显的线性比例关系。图4表明了使用过滤器a(sartoriuscpv180cm2)和包含大豆水解液kerryhypep1510#2时，过滤中可控压力和可控流速之间的区别(见实施例1至实施例4)。过滤进行19天，在该时间时，过滤的容积达到6000-7000l/m2。流速可控过滤的最终压力与压力可控过滤的压力相当(见图4b)，压力可控过滤的最终比流速和流速可控过滤的流速相当(见图4c)。这表明病毒过滤的两种控制策略都能导致相当的容积。图5表明了实施例6中所述的在10l生物反应器实验中分别使用病毒过滤的培养基和未进行病毒过滤的培养基的结果。在开始实验之前，使用过滤器a分批进行细胞培养基的病毒过滤。每组使用添加了3批不同大豆水解液(kerryhypep1510,批次#1；domose50mafuf，批次#1和domose50mafuf,批次#2)中的一种的细胞培养基平行地进行实验。数据由4周连续细胞培养中的最后3周计算得到。在各自的病毒过滤的培养基(未过滤大豆1、未过滤大豆3和未过滤大豆2)相比它们未经过滤的对照(大豆1、大豆3和大豆2)，其单位生产率(图5a)、体积生产率(图5b)和比生长速率(图5c)没有检测到区别。图6表明了实施例7中所述的在120l生物反应器实验中分别使用病毒过滤的培养基和未进行病毒过滤的培养基的结果。交替使用过滤器e(sartoriusvirosartcpv,2000cm2)和过滤器f(milliporeviresolvenfp850cm2)，对生物反应器的培养基供应管线和细胞培养基进行病毒过滤，以连续模式进行大约58天。病毒过滤后的培养基给料的时间间隔和容积如图6a所示。使用不同的过滤器计算时间间隔。在各自的病毒过滤后的培养基与未经滤的对照之间，比生长速度(图6b)和体积生长率(图6c)没有检测到区别。图7表明了在使用过滤器g(asahiplanova15n)病毒过滤器对包含大豆水解液domose50maf#5uf的mmv加标(spiked)培养基进行过滤期间取得的顺序滤液样品中发现的mmv感染力滴度[tcid50/ml]的变化(见实施例8)。在2至3天内，观察到低水平病毒的漏出(break-through)。然而，病毒清除看起来是有效的。图8表明了在使用过滤器d(asahibioex)病毒过滤器过滤包含大豆水解液(运行#1含大豆水解液dmvse50mafuf#5；运行#2含大豆水解液dmvse50mafuf#4))的mmv加标(spiked)培养基期间取得的顺序滤液样品中发现的mmv感染力滴度[tcid50/ml]的变化(见实施例9)。没有观察到病毒的漏出(break-through)，因此，病毒清除被认为是有效的和彻底的。图9表明实施例10中所述的mmv-加标(spiked)培养基过滤期间取得的顺序滤液样品中发现的mmv感染力滴度[tcid50/ml]变化。运行#1和#2(过滤器d)中没有观察到病毒的漏出(break-through)，这说明包含大豆水解液的培养基的病毒清除是有效的和彻底的。在运行#3和#4(过滤器i)与运行#5和#6(过滤器g)中，观察到低水平的病毒漏出(break-through)，这说明包含大豆水解液的培养基的病毒清除是有效的但不够彻底的。在运行#7(过滤器b)和运行#8(过滤器h)中，观察到更加显著的病毒漏出，这表明减少的病毒清除因素在一个显著性的极限。然而，至少一个实验中的所有过滤器可以实现最低总体滴度的降幅超过大约1logtcid50/ml。表1：加标实验中使用的病毒过滤器和大豆水解物的组合图10表明根据实施例11的描述所进行的病毒过滤的动力学。除了模拟操作环境中最坏的情况例如蓄意压力和流动中断，压力维持在0.8至1.2bar之间(平均为1.1bar)。可以达到大约38l/(m2×hr)的初始流速，随后逐渐降低直到实验结束，然而，最低流速需要维持在4l/(m2×hr)。包含压力中断的总持续时间为30天。大约6500l/m2流经过滤器。图11表明实施例11中所述的mmv加标培养基过滤期间取得的顺序滤液样品中发现的mmv感染力滴度[log10(tcid50/ml)]变化。在20个测试的成分中都没有观察到病毒的漏出。根据成分的体积，病毒载量在小于0.9[log10(tcid50)]至小于2.8[log10(tcid50)]之间。滤液中的总体病毒载量小于3.0[log10(tcid50)]，当其从加标材料的初始病毒载量(即8.5[log10(tcid50)])减去时，导致整体病毒下降因子大于5.5log10。这被认为是有效的和彻底的。发明具体描述本发明提供了一种从制剂中清除病毒污染的方法，其中，所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。该方法包含使所述制剂通过最大有效孔径为75nm的病毒过滤器过滤至少大约24小时。进一步地，本发明涉及使用最大有效孔径为75nm的病毒过滤器过滤至少24小时，以清除制剂中的病毒污染物，其中，所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。此外，本发明涉及制剂在细胞培养、制药、诊断和/或化妆品制品以及食品制品中的用途，其中，该制剂为根据本发明的任意一种方法所获得的一种细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。在本发明所有实施例中，所述制剂都要进行病毒过滤，所述病毒过滤或病毒过滤器的使用进行至少大约24小时、大约48小时、大约72小时、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约1周、大约2周、大约3周、大约4周、大约1个月、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大约5个月、大约6个月或大约7个月。进一步地，在一个实施方式中，所述制剂进行病毒过滤或所述病毒过滤进行大约1周至3周、大约2周至大约3周、大约1周至大约4周、大约2周至大约4周、大约1周至大约7个月、大约1个月至大约5个月、大约2个月至大约5个月、大约2个月至大约4个月、大约2个月至大约3个月，或至少大约24小时至最长大约7个月、或大约48小时至最长大约5个月、或大约72小时至长达大约3个月。进一步地，在一个实施方式中，所述制剂经过病毒过滤，或病毒过滤进行长于大约48小时至长达大约7个月、优选大约1周至大约5个月，或大约3周至大约3个月、或大约2个月至大约3个月。根据本发明所述的方法可以在以下容积下进行：至少为大约2000l/m2、或至少大约3000l/m2、或至少大约4000l/m2、或至少大约5000l/m2、至少大约7500l/m2、至少大约10000l/m2、或至少大约20000l/m2。其中“容积”是指在因滤膜堵塞引起过滤流量降低或回压升高至不理想的操作环境之前，可以通过病毒过滤膜特定面积过滤的溶液体积。预期包含所有实施例的本发明可以单独或联合其他本领域已知的方法用于使病毒污染最低化，例如筛选、分类(sourcing)、检测、病毒灭活、吸附保留等。本发明所述的方法针对早在生产阶段时通过制剂进入的不期望的病毒试剂，以及提供一种病毒清除机理，其中，所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。本发明的优点包含易于在大规模生产中实施、减少处理给定体积的制剂所需的过滤膜面积、和相应的成本下降，其中，所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。特别地，根据本发明所述制剂的病毒过滤很容易并入连续生产过程中，例如连续细胞培养过程如灌注培养或恒华器如生物反应器系统。此处用到的术语“温度”涉及根据本发明滤过的制剂，例如，细胞培养基或缓冲液在通过病毒过滤器时的温度。根据本发明的一个实施方式，所述温度在大约2℃至大约60℃的范围之间。在一个实施方式中，所述温度范围的下限为大约2℃、大约4℃、大约8℃、大约10℃、大约15℃、大约20℃、大约22℃、大约25℃、大约30℃、大约37℃或大约40℃。根据本发明，所述温度范围的上限为大约10℃、大约20℃、大约22℃、大约25℃、大约30℃、大约37℃、大约40℃、大约50℃或大约60℃。在一个实施方式中，所述温度范围在大约4℃至大约45℃之间、或温度范围在大约10℃至大约40℃之间、或从大约20℃至大约40℃之间、或从大约30℃至大约37℃之间。同样在一个实施方式中，所述温度为室温即在从大约20℃至大约30℃的范围之间。当然，实施方式优选那些经过过滤而没有进行进一步加热或冷却的制剂的实施方式。因此，在进一步的实施方案中，根据各自进行过滤的地方的温度，使用的温度在大约10℃至大约30℃之间。在另一个实施方式中，使用的温度在大约30℃至大约37℃之间，例如，通过在过滤之前对液体制剂进行预热。制剂过滤形成的滤液连续用于供料生物反应器。在本发明的一个实施方式中，过滤在压力范围为大约100mbar至大约4000mbar内进行，或在大约200mbar至大约3500mbar之间。在一个实施方式中，病毒过滤在一定的压力范围内进行，其中，下限为大约100mbar、大约200mbar、大约500mbar、大约1000mbar、大约1200mbar、大约1500mbar、大约2000mbar、大约2500mbar或大约2800mbar。上限为大约1200mbar、大约1500mbar、大约2000mbar、大约2500mbar、大约2800mbar或大约3000mbar。在一个实施方式中，过滤在下述压力范围内进行：大约1000mbar至大约4000mbar之间、大约1500mbar至大约3500mbar之间，大约1700mbar至大约3300mbar或大约1000mar至大约2000mbar。在本发明进一步的实施方案中，利用调整温度和压力以调控比流速和容积。通过调整其他过程参数，例如过滤压力和温度，得到容积和病毒过滤器使用时间跨度的进一步改善。例如，已经证明在一些实施方式中，优选将制剂在大约10℃至大约40℃的温度之间以及在大约1000mbar至大约2000mbar的压力之间的条件下进行过滤。初步过滤实验已经证明待过滤制剂的温度对比流速的影响。当保存温度为大约4℃的本发明所述的制剂的过滤温度增加至温度为大约18℃至大约37℃，可以观察到流速增加了大约50至大约100％。然而，所有这些实施方式都过滤了至少大约24小时，且在维持过滤器完整性的同时，所用昂贵的病毒过滤器的容量可以更好地被利用至容积增加2～100倍。在一个优选的实施方式中，从制剂(所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分)中清除病毒污染物的方法包含以下步骤：将所述制剂在压力为大约1000mbar至大约2000mbar、温度为10℃至40℃、容积为至少2000l/m2的条件下，通过最大有效孔径为75nm的病毒过滤器过滤至少大约10天至大约2个月。当然，该实施方式也可以结合其他参数。此外，作为进一步优选的实施方式，所述方法以连续过滤的模式进行，其中所述制剂优选为细胞培养基，例如，包含大豆水解液的细胞培养基或包含源自动物成分的细胞培养基，其中，滤液连续供给生物反应器，特别是恒化反应器。在另一个实施方式中，该实施方式可以使用至少2个并联或串联排列的病毒过滤器进行。我们预计，此处所述的病毒过滤方法可以用于减少任意制剂中的病毒污染物，其中，所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分，即在体外细胞培养中适于动物细胞生长的培养基和缓冲液，所述动物细胞优选哺乳动物细胞。典型地，培养基包含缓冲液、盐、能源、氨基酸、维他命和必需微量元素。术语“制剂”也包含根据本发明的含义可能构成细胞培养基的可能部分的任意成分，以及能够支持培养的适当细胞生长的成分。所述制剂包含：例如至少一种氨基酸或蛋白质的缓冲液或溶液；至少一种维他命溶液；至少一种有机或无机盐溶液；或者包含碳水化合物或糖中的至少一种来源的溶液。根据本发明，“log10减少值”(lrv)是对膜保留颗粒例如细菌或病毒的效率的测量，其被定义为原料流中所述颗粒的个数与病毒过滤膜透过液中的颗粒数的比值的(基于10)对数。lrv值对于给定类型的颗粒是特定的。根据本发明的一个实施方式，病毒过滤器为病毒污染物实现至少1log10减少值(lrv)，或为病毒污染物实现至少2log10减少值(lrv)，或为病毒污染物实现至少3log10减少值(lrv)，或为病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)，或为病毒污染物实现至少5log10减少值(lrv)，或为病毒污染物实现至少6log10减少值(lrv)，或为病毒污染物实现至少7log10减少值(lrv)，或为病毒污染物实现至少8log10减少值(lrv)，优选病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)。当然，本领域技术人员显然知道，需要被过滤的制剂的病毒或潜在的病毒污染物的任意log10减少值(lrv)对于改善生产过程的安全性都是有益的。因此，该参数可以联合其他本发明所述的方法中使用的参数。此处用到的“流量”和所用的“比流速”或“流速”是可以互换的，其是用于表征膜的测量，指过滤流速(其以每单位过滤器面积和时间透过病毒过滤膜的溶液体积或重量来表示，如l/(m2×hr))。根据本发明的上下文，术语“比”是指在特定的时间内，然而，当仅使用“流速”时，也是该参数的单位，很显然是“比流速”的意思。作为“体积”数量单位“升”的缩写，“l”和“l”可以交换使用。本发明所述方法中的比流速在使用给定病毒过滤器的过滤过程期间可在一定范围内变化或保持基本固定。在本发明的一个实施方式中，所述比流速范围为大约5l/(m2×hr)至大约500l/(m2×hr)，过滤至少24小时至大约7个月。流量(flux)的下限可为大约5l/(m2×hr)或大约10l/(m2×hr)。上限可为大约25l/(m2×hr)、大约75l/(m2×hr)、大约100l/(m2×hr)、大约200l/(m2×hr)、大约250l/(m2×hr)、大约300l/(m2×hr)或大约500l/(m2×hr)。进一步地，流量的范围为大约5l/(m2×hr)至大约100l/(m2×hr)、大约10l/(m2×hr)至大约100l/(m2×hr)或大约10l/(m2×hr)至大约25l/(m2×hr)。“批过滤”或“分批过滤”或以分批模式过滤，此处均指一种程序，其中，根据病毒过滤器的容量，一个批次的特定总量或体积的制剂(所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分)通过病毒过滤器过滤；其中，过滤程序在滤液流向或供给到其被使用或消耗的程序之前完成。术语“连续过滤”或“在线过滤”或“在线型过滤”均指过滤程序，其中，根据病毒过滤器的容量，一个批次的特定总量或体积的制剂(所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分)连续地通过病毒过滤器过滤；其中，当滤液已经流向或供给到其被使用或消耗的程序之时，过滤程序仍然继续进行。本发明的所有实施方式均可使用分批过滤或连续过滤进行。本发明的有益效果已经通过所述制剂(所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分)经病毒过滤器过滤至少24小时来实现，其中，所述病毒过滤器的最大有效孔径为75nm，以从所述制剂清除病毒污染物。在一个优选的实施方式中，根据本发明所述的从制剂(所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分)中清除病毒污染物的方法，其中，所述制剂通过最大有效孔径为75nm的病毒过滤器连续过滤至少大约24小时。该操作模式的优点为该制剂生成的滤液可直接和连续地供给到其被使用或消耗的程序。在一个进一步优选的实施方式中，所述病毒过滤后的制剂(所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分)，可直接地或连续地供给生物反应器，更优选在连续供给细胞培养程序中所使用的大规模生物反应器，例如恒化程序、灌注程序或批次供给程序。在一个实施方式中，所使用的压力为大约1000mbar至2000mbar，温度为10℃至40℃，其中，容积为至少2000l/m2或至少5000l/m2。此外，所述制剂的病毒过滤进一步优选进行至少大约24小时或大约48小时至大约7个月，更优选至少1周至大约5个月，以及最优选至少1至大约3周，或大约3周至大约3个月，甚至最优选至少大约2至3个月。当然，该实施方式也可以结合其他参数。此外，所述待过滤制剂优选为细胞培养基，所述过滤模式优选为连续过滤模式。当然，本领域技术人员明了，根据本发明任意方法得到的病毒过滤后的制剂可流向或供给其他与细胞培养、诊断和/或化妆品制备和食品制备有关的生产程序。同样地，在那些实施方式中，制剂优选连续过滤。因此，本发明也涉及制剂在细胞培养、制药、诊断和/或化妆品制品以及食品制品中的用途，其中，所述制剂为根据本发明任意一种方法所获得的细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分。在一些实施方式中，该待病毒过滤的细胞培养基是无菌的，或者预先处理过的。在一些实施方式中，该细胞培养基包含动物蛋白或血清或其他源自动物的成分，或不含动物蛋白、或不含血清、或不含源自动物的成分、或上述特征的任意组合。在其他实施方式中，该细胞培养基包含的不同浓度和种类的源自植物或微生物的水解液，尤其是大豆水解液。在一个优选的实施方式中，所述细胞培养基是包含至少一种不同浓度的大豆水解液的不含动物蛋白的培养基。然而，需要强调的是，根据本发明所述的方法尤其适用于含动物蛋白或血清或其他源自动物的成分的制剂的病毒过滤，以进一步改善那些制剂的病毒安全性，特别是当其应用在细胞培养过程、制药、诊断和/或化妆品制品以及食品制剂时。根据本发明的目的，“细胞培养基”被定义为细胞在体外细胞培养中适于生长的培养基，所述细胞优选为动物细胞，更优选哺乳动物细胞。可以使用任何能支持适当的细胞在细胞培养中的生长的培养基。根据本发明的细胞培养基可基于任何基础培养基例如本领域技术人员通常所知的dmem、ham’sf12、199培养基、mccoy或rpmi。该基础培养基可能包含很多成分，包含氨基酸、维他命、有机盐和无机盐、以及碳水化合物源，每种成分的含量为可支持细胞的培养的量，这对于本领域技术人员是已知的。该培养基可包含辅助物质，例如缓冲物质如碳酸氢钠、抗氧化剂、可抵消机械应力的稳定剂，或蛋白酶抑制剂。如果需要，非离子型表面活性剂如聚乙二醇和聚丙二醇的混合物(例如普兰尼克f68.rtm.，serva)可以作为消泡剂而添加。如此处所用的“包含动物蛋白的培养基”是一种包含任何源自人类或动物的蛋白的细胞培养基。如此处所用的“无蛋白培养基”是一种不含任何源自人类或动物的蛋白的细胞培养基。根据本发明，术语“无动物蛋白的细胞培养基”指不含任何源自多细胞非植物真核生物的蛋白和/或蛋白成分的培养基。需要避免的代表性蛋白是那些从血清中发现的蛋白或源自血清物质的物质，例如，白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和其他生长因子。不含动物蛋白的细胞培养基也不含任何纯化的源自动物的产品和源自重组动物的产品，以及蛋白分解物(digests)和其提取物或其脂质提取物或其纯化的成分。不同于动物蛋白和蛋白成分，非动物蛋白、植物中可获取的小肽和寡肽(通常为10-30个氨基酸长度)，例如大豆和低级真核生物，例如酵母可能被包含在根据本发明的无动物蛋白的细胞培养基中。术语“水解液”包含任何源自动物或源自植物的材料或源自酵母或细菌提取物的降解物。根据本发明的细胞培养基可包含“大豆水解液”，所述“大豆水解液”可为高度纯化的大豆水解液、纯化的大豆水解液或大豆水解液的粗产物。用于培养基的术语“包含血清”包含任何含血清的细胞培养基。用于培养基的术语“无血清”包含任何不含血清的细胞培养基。对于“无血清”，可以被理解成培养基中的血清优选低于0.1％，更优选低于0.01％。术语“血清”指血液清除纤维蛋白凝块和血细胞之后的液体部分。在一些实施方式中，过滤程序中得到的滤液或滤液流分别供给大规模细胞培养和生物反应器。此处用到的“大规模”细胞培养指具有以下规模的细胞培养：至少大约100l、至少大约200l、至少大约300l、至少大约400l、至少大约500l、至少大约1000l、至少大约1500l、至少大约2000l、至少大约2500l、至少大约3000l、至少至少大约4000l、至少大约5000l、至少大约7500l、至少大约10000l或至少大约20000l。在一个优选的实施方式中，根据本发明任何方法得到的滤液流供给恒化过程、灌注过程或分批供给过程中所使用的生物反应器，优选连续过滤。此处设想的细胞培养可以使与所培养的细胞的种类和特征以及所培养细胞的生长阶段无关的任何细胞培养，例如粘附细胞或非粘附细胞；生长型细胞或生长阻滞型细胞。根据本发明所使用的术语“无菌”指不含或基本不含微生物和/或病毒污染物的物质。在此，“污染物”指与制剂(所述制剂为细胞培养基或细胞培养基的至少一种成分)中所期望的成分不同的材料。在“无菌过滤”情况下，术语无菌过滤是一种功能性描述，其指制剂通过无菌过滤器过滤以清除细菌和/或支原体污染物。此处使用的术语“病毒过滤”可以与术语“纳米过滤”交换使用，意思是指使用具有确定有效孔径的病毒过滤器的过滤程序。一般而言，那些过滤器用于清除病毒。本发明的所有方法中所述的过滤要清除的目标病毒污染物可以是本领域目前已知的或未来将要发现的任何病毒。该定义也包含通过过滤所清除的潜在病毒污染物和本发明所述的方法所清除的一种以上的病毒。例如，病毒污染物或潜在的病毒污染物可以是下述病毒科的一种：正粘病毒科、沙粒病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、小核糖核酸病毒科、披膜病毒科、动脉炎病毒科、retparvoviridae、布尼亚病毒科、杯状病毒科、逆转录病毒科、呼肠孤病毒科、环病毒科、腺病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、虹彩病毒科或呼肠孤病毒科。更具体地，所述病毒污染物可以是由下述病毒构成的组中的任意一个：犬细小病毒(cpv)、鼠微小病毒(mvm)、卡希谷病毒、布尼奥罗病毒、northway脑炎病毒、流感病毒a/b、胡宁病毒、副流感病毒1/2/3、猿猴病毒5、腮腺炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、仙台病毒、新城鸡瘟病毒、小鼠肺炎病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、牛冠状病毒、鼠肝炎病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、登革病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、水泡疹病毒属2117、脑心肌炎病毒、柯萨奇病毒b-3、蒂勒鼠脑炎病毒、口蹄疫病毒、牛肠病毒、猪肠病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、日本脑炎病毒、东部马脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、泡沫病毒、呼肠孤病毒1/2/3、禽呼肠孤病毒、轮状病毒、猪圆环病毒1、腺病毒、伪狂犬病病毒、鼠γ疱疹病毒68、1型单纯疱疹病毒、蛙毒素3、mice-cutter细小病毒(mvmc)、蓝舌病病毒(btv)、流行性出血病病毒(ehdv)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、猪细小病毒(ppv)、脑心肌炎病毒(emcv)、呼肠孤病毒3、以及白血病病毒(mulv)、甲型肝炎(a)、小儿麻痹症病毒或细小病毒科b19。此处术语“病毒过滤器”和术语“病毒滞留过滤器”、“病毒性过滤器”和“纳米过滤器”是可交换使用的，一般均指一种过滤器，其特征在于它适用于保留病毒和具有实现该功能的有效孔径。这些特征包含：例如膜的属性例如形态、孔的形状、孔的密度和均匀性、有效孔径、膜的厚度等。用于本发明的病毒过滤器膜包含通过体积排阻和电荷并能结合吸附保留起作用的膜。体积排阻和吸附保留机制之间并不必然排斥另一个，一个过滤器很可能使用一种或多种机制。本发明所述的病毒过滤器和本发明实施方案中使用的病毒过滤器的特征在于具有最大有效孔径为75nm的膜。根据本发明的一个实施方式，有效孔径的下限为大约5nm、大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约25nm、大约30nm、大约35nm、大约50nm或大约60nm。根据本发明的一个实施方式，所述有效孔径的上限为大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约25nm、大约35nm、大约50nm、大约60nm或大约75nm。在本发明的一些实施方式中，所述病毒过滤器的有效孔径为大约5至大约75nm，或大约10至大约75nm，或大约15至大约75nm，或大约20至75nm，或大约15至大约50nm或大约15至大约35nm。此处用到的有效孔径是一种膜的特征，其指能够被膜有效保留的颗粒的尺寸，其有效程度通过该颗粒尺寸的对数减缩因子来描述。本发明方法所使用的病毒过滤器可以是任何其构造足以支持下述容积或能进行下述时间跨度的过滤器：至少大约2000l/m2、或至少大约3000l/m2、或至少大约4000l/m2、或至少大约5000l/m2、或至少大约7500l/m2、或至少大约10000l/m2、或至少大约20000l/m2；大约24小时至大约7个月或优选至少大约48小时、大约72小时、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约1周、大约2周、大约3周、大约4周、大约1个月、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大约5个月、大约6个月或大约7个月。当然，如果根据本发明的方法使用一种以上过滤器，可以在过滤程序中使用和结合不同类型的病毒过滤器，优选并联或串联方式排列。代表性的病毒过滤器包含一个单层膜和多层膜，其由下述材料构成：例如聚偏二氟乙烯(pvdf)、纤维素、改性纤维素，例如铜氨液再生的纤维素中空纤维或聚醚砜。所述病毒过滤器的膜可能是电荷中性的、带有负电荷或正电荷。所述膜可以是离子膜，即它们可包含阳离子或阴离子基团，但是根据ph条件可优选中性膜。所述病毒过滤器膜可能选自疏水性和亲水性膜。在一个优选的实施方式中，根据本发明所述的方法使用的病毒过滤器的膜由聚偏二氟乙烯(pvdf)或聚醚砜制成。已经证实具有清除病毒能力的典型过滤器的制造商包含但不排除其他的：asahi/planova、pall、millipore、sartorius、gambro以及amersham/ag技术。适用于本发明的过滤器包含但不限于：asahi’splanova15n过滤器(asahikaseicorporation,planovadivision)、planova20n过滤器(asahikaseicorporation,planovadivision)、planova35n过滤器(asahikaseicorporation,planovadivision)以及bioex过滤器(asahikaseicorporation,planovadivision)。当然，理想的情况是本发明所述的方法中用到的过滤器为耐高温高压型(autoclavable)和/或高压蒸汽处理型(autoclaved)和/或使用前灭菌的过滤器。然而，其他可以确保所用病毒过滤器无菌的方法均适用于本发明。而且，理想情况下，使用前和/或使用后可以检测所述过滤器的完整性。在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法使用高压蒸汽处理型(autoclaved)、经过完整性测试的病毒过滤器，其中，所述过滤器具有聚偏二氟乙烯(pvdf)膜或聚醚砜膜。此处用到的“滤液”和术语“渗透液”均指通过过滤器或膜的溶液，以及已经通过过滤器或膜的溶液。此处用到的“保留物”指被保留的和不能通过过滤器或膜以及已未通过过滤器或膜的溶液成分。本发明用到的病毒过滤设备包含至少一种病毒过滤膜元素，其将供料分为过滤器前和过滤器后两个部分。所述过滤设备一般也包含控制压力和流量的工具，例如泵和阀，及流量计、压力表和密度表。所述设备也包含若干种不同组合的滤膜元素，其呈并联或串联或两者组合的方式排列。所述过滤流量根据压力而变化。一般而言，在正常操作范围内，压力越高，流量越高。流量也随温度改变。操作温度的增加会增加流量。然而，温度越高压力越高，这使得膜的破裂有增加的趋势。相比高分子膜，无机膜可以使用更高的温度、压力越高以及更大的ph范围。本领域技术人员显然明白，可以使用截留分子量低于大约5000道尔顿或低于大约1000道尔顿的过滤器来代替本发明的的病毒过滤器，以清除病毒。此处，“截留分子量”(mwco)是一个过滤器的膜特征，其指定了溶质、不能透过该过滤器膜的颗粒或病毒的平均分子量。在本发明的病毒过滤程序的ph值可以设定为对保留待过滤制剂、优选细胞培养基或缓冲液的稳定性和功能性必须的任何范围。例如，ph值设定为大约1至大约10，优选大约2至大约8或大约3至大约7，优选大约6.8至大约8或最优选大约7.0至大约7.45(生理ph值)。已经设想，根据本发明的方法可以被整合到清除细菌污染物的无菌级过滤器的系统下游，因此，形成无菌的制剂供料流，其作为“开始制剂”，即用于根据本发明的任何方法中使用的制剂。在一个实施方式中，本发明的方法可以使用两个或两个以上串联排列的过滤器。这具有增加病毒清除能力和防止病毒过滤器失灵或漏出的优点。在另一个实施方式中，使用两个或两个以上并联的病毒过滤器进行过滤，因此，允许病毒过滤器的替换而不会打断连续过程和防止未预见的培养基阻滞如由于阻塞。在另一个实施方式中，所述过滤使用在含有y型结点的管系统中并联的至少两个过滤器，其中，每个过滤器与y型结点的分支和制剂供应源处于流体相通。在一些实施方式中，所述y型结点包含连接器。在其他实施方式中，使用包含多个按串联或并联的过滤器的装备进行过滤。根据本发明的上下文，一种特别有用的排列方式如下：至少第二个过滤器以并联方式排列并和其他并联的过滤器相连通，或和串联的过滤器相连通，使得取代一个过滤器而不会因维修原因中断过滤程序。在一些实施方式中，所述过滤器在使用之前进行完整性测试。所述完整性测试可采取基于空气-水扩散的形式测试，其中，将空气导入过滤器中，然后，将所述过滤器浸没在无菌水中，并检测表征过滤器渗漏的气泡。在一个实施方式中，所述病毒过滤器或所述病毒过滤器膜可以在病毒过滤程序之前进行预先处理，例如通过洗涤剂冲洗，特别是用酸性洗涤剂、碱性洗涤剂和/或乙醇冲洗。在本发明的一个实施方式中，在本发明所述方法中也可进行正切流动过滤。根据本发明的上下文“正切流动过滤”此处可以和术语“错流过滤”交换使用。在正切流动过滤模式中，过滤器上游一侧的液体流动路径大概平行地或沿正切方向或横跨流经过滤器表面。通过限制保留物相对于供料的流量可以促进渗透的通过，使得对系统产生反压及允许渗透迁移通过所述过滤膜。通过膜表面的稳定的扫描电流具有使得在进行过滤的产品中污染物造成的阻塞最小化的作用。能够达到下述效果的任何病毒过滤器都是适合的：病毒污染物实现至少1log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少2log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少3log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少5log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少6log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少7log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少8log10减少值(lrv)、优选病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)。所有对数减少因子均适用于最大有效孔径为75nm的任何病毒过滤器。根据本发明的一个实施方式，所述病毒过滤器的有效孔径的下限为大约5nm、大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约25nm、大约30nm、大约35nm、大约50nm或大约60nm。根据本发明的一个实施方式，所述病毒过滤器的有效孔径的上限为大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约25nm、大约35nm、大约50nm、大约60nm或大约75nm。在本发明的一些实施方式中，所述病毒过滤器的有效孔径为大约5至大约75nm，或大约10至大约75nm，或大约15至大约75nm，或大约20至75nm，或大约15至大约50nm或大约15至大约35nm。在本发明的一些实施方式中，使用正向过滤。此处“正向过滤”和术语“全量过滤”、“单向过滤”和“直流过滤”可以交换使用，其均指病毒过滤器的过滤程序，其中所述液体流动路径通常和过滤器表面垂直，根据过滤器模块的构造，所述液体流也可以正切方向流过过滤器膜；然而，和错流过滤相比，不再进行保留物的再循环，这意味着过滤器之前和之后的比流速是相似的。可以达到下述效果的任何病毒过滤器都是适合的：病毒污染物实现至少1log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少2log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少3log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少5log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少6log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少7log10减少值(lrv)、或病毒污染物实现至少8log10减少值(lrv)、优选病毒污染物实现至少4log10减少值(lrv)。所有对数减少因子均适用于最大有效孔径为75nm的任何病毒过滤器。根据本发明的一个实施方式，所述病毒过滤器的有效孔径的下限为大约5nm、大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约25nm、大约30nm、大约35nm、大约50nm或大约60nm。根据本发明的一个实施方式，所述病毒过滤器的有效孔径的上限为大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约25nm、大约35nm、大约50nm、大约60nm或大约75nm。在本发明的一些实施方式中，所述病毒过滤器的有效孔径为大约5至大约75nm，或大约10至大约75nm，或大约15至大约75nm，或大约20至75nm，或大约15至大约50nm或大约15至大约35nm。本领域普通技术人员可以理解，本发明的所有实施方式均可以借助于任何在技术上有用的已知系统实施，所述系统例如为速度可变或速度固定的蠕动泵、离心泵等。可以使用任何类型的压力容器或其他容器形成在过滤程序期间具有稳定或可变压力的流经病毒过滤器的流体。本领域普通技术人员可以理解过滤器类型和模式的选择(全量过滤或正切流动过滤)取决于下述因子例如组合物、蛋白含量、分子量分布、杂质/颗粒负荷或待处理的供料的任何其他生物化学或物理学性质、处理要求和限制(允许的压力、处理时间、用于过滤的体积)或潜在病毒污染物的特征，例如病毒大小。同样需要考虑中间完整性测试的实用性和病毒清除研究的物流。全量过滤通常被用于具有高纯度的供料流以产生合理的处理流量，其中，在一些实施方式中，正切流动过滤适于颗粒负荷高的原料流。在一些优选的实施方式中，优选将正向过滤和连续过滤模式相结合，所述连续过滤模式使用至少一个最大有效孔径为75nm的病毒过滤器。当然，该实施方式也可以结合本发明的其他所有参数。当然，应该理解的是，本发明不限于所描述的特定实施方式及其变形。同样应该理解的是，此处用到的术语仅仅是为了描述特定的实施方式，而不在于限制，因为本发明的保护范围仅通过所附权利要求书进行限制。提供一定范围的数值时，应当理解除非上下文中清楚地指示，否则，在该范围的上限和下限之间的每个居中值和下限单位的十分之一，以及该范围的其他设定的数值或居中值都包含在本发明中。这些小范围的上限和下限可能独立地包含在更小的范围内，其同样也包含在本发明中，属于所述范围中任何特别排除的界值。其中所述范围包含一个或2个界值和范围，所述范围排除了本发明包含的那些界值或其中之一。除非已经定义，否则此处用到的所有技术和科学术语具有本发明所属
技术领域：
普通技术人员理解的含义。虽然任何与此处所述类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实施和测试，但提供下述代表性方法和材料。说明书中引用的全部出版物和专利通过引用包含在此处，被认为如同每种出版物或专利通过引用特异地或单独地被包含在此处，说明书中引用的全部出版物和专利通过引用包含在此处以公开和描述所引出版物相关的方法和/或材料。引用的任意出版物都是为了其在申请日之前公开的内容，而不应该被理解为是由于在先发明，承认本发明没有先于这些出版物。进一步地，提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期需要独立地确认。已经注意到，除非上下文已经清楚地指出，否则此处和所附权利要求书中使用的单数“一个”或“一种”和“该”包含多个引用物。进一步注意到，权利要求书可写成排除任何可选的元素。如此，该声明用作下述排他性术语例如“单独地”“仅”和引用的权利要求元素相关的类似用语或使用“阴性”限制的在先基础。阅读上述公开之后，本领域技术人员显然清楚此处所述的每一个实施方式都有离散的成分和特征，其可容易地与其他任何实施方式的特性相分离或结合，而不会偏离本发明的范围或精神。任何引用的方法可以引用情况的顺序或任何其他逻辑上可行的顺序进行。具体实施方式下述实施例用于具体描述本发明。这些实施例并不意味着把本发明限制为任何特定的应用或操作理论。实施例1：使用不同的病毒过滤器和细胞培养基按比例减小病毒过滤规模在不同过滤器尺寸和细胞培养基中，评估来自不同生产商(见表2)的病毒过滤膜的过滤动力学，其中，细胞培养基包含来自不同批次和供应商(见表3)的浓度为4g/l的大豆水解液。细胞培养基组合物和制剂如实施例2所示。通过加压容器控制压力(图3、图4、图5以及图7、图8和图9中的加标实验)或通过例如蠕动泵控制流速(图1、图2、图3和图6)进行过滤实验。用于控制实验中的温度和压力的其他设备如表4所示。表2：病毒过滤器列表表3：大豆水解液列表附图/实施例的内部大豆水解液代码生产商/产品名称/内部批号大豆水解液1kerryhypep1510#1大豆水解液2domose50mafuf#1大豆水解液3domose50mafuf#2大豆水解液4domose50mafuf#3大豆水解液5kerryhypep1510#2大豆水解液6domose50mafuf#4大豆水解液7domose50mafuf#5表4：设备列表wmmarpreneboremm×wallmm3.2×1.6和1.6×1.6(watsonmarlow)蠕动泵watsonmarlow101u/r(watsonmarlow)压力容器sartoriusmodel17532(sartorius-stedim)压力传感器:pascalcicl1010(labom)和krosfloacpm-499-03n(spectrumlabs)平衡仪sartoriusfbg64ede-soce(sartoriusstedim)水浴槽haakedc10(thermoscientific)温度传感器cemir-68flexibleinfraredthermometer实施例2：细胞培养基制剂细胞培养基组合物的基本描述如下表5所示，其为含有上表3中所列的不同大豆水解液的组合物。在进行实施例中所述的不同的病毒过滤之前，不同批次的细胞培养基先使用无菌级过滤器例如palliidjlmembranefiltercartridge0.1μ进行无菌过滤。此处描述的培养基制剂用于图1至图11中所示的所有实验中。表5：培养基组合物成分浓度[g/kg]dmem/hamsf1211.76乙醇胺0.00153lutrolf680.25大豆水解液4.0微量元素–储备溶液最高4μg/ll-谷氨酰胺0.6nahco32.0净化水添加1kg实施例3：准备过滤器：根据病毒过滤器生产商的产品手册准备病毒过滤器。除非过滤器在无菌环境下运送和装备，否则过滤器在高于121℃条件下高压蒸汽处理20分钟。实施例4：完整性测试使用之后，分别根据生产商的推荐，洗涤尺寸适合的过滤器(表2的过滤器a、c、e和f)。根据生产商提供的使用说明，使用palltronicflowstarxc(pall,us)进行顺流测试。在过滤实验符合指定限值之后，进行所有完整性测试。实施例5：压差和流量之间的比例关系为了研究压差和体积流速之间的关系，使用高压蒸汽处理的病毒过滤器在室温下对细胞培养基进行过滤。将培养基充满压力容器，并将病毒过滤器与压力容器连接，然后，对压力容器加压到不同水平。使用平衡仪和压力传感器测量具体流速和压差，并记录其随着时间的变化(图3)。实施例6:按比例减小的10l发酵系统模型使用表达重组蛋白的cho细胞发酵系统进行含/不含病毒过滤步骤的细胞培养基的对比试验(图6)。研究其生长速度和产量的性能。制备如实施例2中所示的细胞培养基。仅使用无菌过滤后的培养基进行该实验的一部分，其中使用相同的但经过sartoriusvirosartcpv180cm2进行了额外病毒过滤的培养基进行该实验的另一部分。在2-8℃下进行过滤。所述发酵实验在rushtontypeagitated10l台式生物反应器中进行，所述生物反应器具有可在线控制的ph、po2和温度。用于发酵的所述参数设定值和范围如下所示：ph:7.05(6.8-7.3)t:37.0℃(35-39℃)do:20％(空气饱和)(10-60％)含/不含额外的病毒过滤步骤的培养基经过恒化培养之后，细胞分批进行培养。细胞连续培养四周后得到恒化培养模式的数据(生长速度和生产率)。通过casy测试确定细胞数量。在恒化培养中，通过下式计算具体生长速度(μ)：μ＝d+in(xt1/xt0)/(t1–t0)其中，d为稀释速率，其通过计算培养基每天供应速度和工作体积的比例而得到[1/d]。根据csay均质化细胞计数计算生长速度。针对生物化学分析，均质化的悬浮液在heraeusmultifuge1s-r中以400×g的速度离心10分钟，使用eppendorf管制备1.0ml等分，并储存于≤-20℃。根据标准操作程序，通过显色实验，分析无细胞上清液中表达的重组蛋白的活性。该实验的体积生产率p通过下式进行计算：p[u/(l×d)]＝活性[mu/ml]*稀释速率[d-1]细胞特异性生产率qp通过下式计算：qp[mu/(10e06细胞×天)]＝p[u/(升×天]/细胞数量[10e06细胞/毫升]实施例7：按比例减小的120l发酵系统模型在添加到表达重组蛋白的cho细胞发酵系统之前，对含有120l工作体积的培养基进行连续病毒过滤，研究其对生长速度和产量的影响(图6a、图6b和图6c)。该研究对比了带有下述3处变化的相同培养基的生产过程：a)标准培养基；b)使用virosartcpv病毒过滤器过滤的标准培养基；和c)使用milliporeviresolvenfp病毒过滤器过滤的标准培养基。在连续生产过程中，在不同的时间间隔交替使用两种不同的病毒过过滤器(virosartcpvmidicapsize2000cm2和milliporeviresolvenfpsize850cm2)。从k00-k14、k23-k30和k39-k63培养之日使用sartoriuscpv过滤器，并从k14-k23和k30-k39培养之日使用milliporenfp过滤器。用于发酵的参数设定值和范围如下所示：ph:7.05(6.8-7.3)t:37.0℃(35-39℃)do:20％(空气饱和)(10-60％)取样和分析使用细胞计数器和分析系统确定细胞数量。对于生物化学分析而言，所述均质化的悬浮液使用heraeusmultifuge1s-r(thermoscientific,usa)以400×g的速度离心10分钟。通过显色实验分析无细胞上清液中表达的重组蛋白活性。根据下式计算恒化培养中的特定生长速度(μ)：μ＝d+ln(xt1/xt0)/(t1–t0)其中，d为稀释速率，其通过计算培养基每天供应速度和工作体积的比例而得到[1/d]。通过casy均质化细胞计数计算生长速度。该实验的体积生产率p通过下式进行计算：p[u/(l*d)]＝活性[mu/ml]*稀释速率[d-1]通过下式计算细胞比生产率qp：qp[mu/(10e06细胞×天)]＝p[u/(升×天)]/细胞数[10e06细胞/毫升]实施例8：使用asahiplanova15n病毒过滤器进行病毒过滤包含大豆水解液的培养基(domose50maf#5)中加入标准mmv并放入与加压氮气的供应源相连的槽中。加入标准mmv的材料在1100mbar(设定值)的恒定压力下通过在线设置为全量模式的10cm2asahiplanova15n病毒过滤器。连续测量和记录下述参数的最小值和最大值：供料压力；供料、滤液和环境温度和滤液重量(其变化被用于计算滤液流速)。每天取样，连续7天，并分析样品的mmv病毒滴度(图7)。实施例9：使用asahiplanovabioex病毒过滤器进行病毒过滤包含大豆水解液的培养基(运行#1含有大豆水解液dmvse50mafuf#5；运行#2含有大豆水解液sdmvse50mafuf#4)中加入标准mmv，并放入与加压氮气的供应源相连的槽中。加入标准mmv的材料在2000mbar(设定值)的恒定压力下通过在线设置为全量模式的10cm2asahiplanovabioex的病毒过滤器。连续测量和记录下述参数的最小值和最大值：供料压力、供料、滤液和环境温度和滤液重量(其变化被用于计算滤液流速)。每天取样，连续5天，并分析样品的mmv病毒滴度(图8)。实施例10：病毒过滤总结包含不同大豆水解液的细胞培养基中加入标准mmv并放入与加压氮气的供应源相连的槽中。不同的病毒过滤器和不同的大豆水解液的组合如表6所示：表6：加标实验中使用的病毒过滤器和大豆水解液的组合过滤设置为全量模式，除了实验#5和6在恒定压力为1-1bar(设定值)下进行，其他实验均在2bar(设定值)的恒定压力下进行。连续测量和记录下述参数的最小值和最大值：供料压力；供料、滤液和环境温度以及滤液重量(其变化被用于计算滤液流速)。在实验进行期间取样并用于分析mmv病毒滴度。根据滤液中的总体病毒感染力负荷以及过滤之前的总体病毒感染力负荷的区别来计算总体对数减少值(图9)。实施例11：加入标准mmv病毒的长期过滤实施例2中所述的细胞培养基中加入标准mmv达到滴度为5.0[log10(tcid50/ml)]，并在孔径为20nm的病毒过滤器(sartoriusvisrosartcpv5cm2)中进行30天的长期过滤。使用与实施例9和10相似但是其恒定压力为1.1bar(特定范围：0.8bar至1.2bar)的装置在常压下并伴有流量中断的方式进行过滤，以挑战病毒过滤器。记录实验期间的流速并维持在4l/(m2×hr)以上(图10)。取20个滤液样品(多达每周5次)，并测定mmv病毒滴度和负荷。在测试的20个组分中没有观察到病毒漏出。根据体积分数，病毒负荷值小于0.9[log10(tcid50)]至小于2.8[log10(tcid50)]。滤液中的总体病毒负荷小于3.0[log10(tcid50)]，当从加标材料(spikedmaterial)的初始病毒负荷值(即8.5[log10(tcid50)])减去时，导致总体病毒降低因子小于5.5log10。这被认为是有效的和彻底的(图11)。为了清楚地理解，虽然已经通过描述和举例的方式介绍了上述发明，根据本发明的教导做出特定改变和修饰对本领域普通技术人员而言是非常显而易见的，而且其没有脱离本发明所附权利要求的精神和范围。当前第1页12