本发明涉及藻类保存领域，尤其是涉及一种小球藻保存方法。
技术背景
小球藻（chlorellavulgaris）绿藻纲，小球藻科。单细胞藻，常单生，也有多细胞聚集。细胞球形、椭圆形，内有一个周生、杯状或片状的色素体。无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。世界各地均有分布，多生活于较小浅水，也有海产种类。天然条件下个体较少，人工培养大量繁殖。细胞内的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量都很高，又有多种维生素，可食用和作为饵料。
在工业方面，日本很早就开始了对小球藻的研发，成功制作小球藻提取液cgf为食品添加剂，因其具有食品添加剂所特有的优点，被快速运用到许多食品中。而在发酵工业也利用小球藻的发酵作用使有利微生物快速繁殖。并且，在水产养殖方面，小球藻还可作为鱼、虾、蟹以及贝类等的饲料，具有良好的投喂效果。随着低温生物学的快速发展，低温保存技术在医学、食品工业及农业上尤其是微生物保存、精子冷冻等多方面均有了广泛的应用。海洋微藻营养丰富，含有大量的蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、多种维生素等营养物质，被广泛的应用于水产养殖，但微藻自身的生长易受环境、气候等因素的影响，往往会给水产养殖业带来很大的不便，故而研究开发低温生物学在微藻中的应用也越来越受到重视。目前，缺乏一种保存效果好的小球藻保存方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种小球藻保存方法，本方法操作简单，有效保存介质金花茶叶提取物与芦荟提取物的纯度与含量较高，具有较高的生物学活性，使得小球藻能够保持完整的细胞结构、高成活率，复活后其生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标无显著下降，是一种长时效、活性高、可持续的小球藻保存方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种小球藻保存方法，包括：培养、浓缩、保存，具体包括以下步骤：
培养：将小球藻接种于培养液中封闭培养，培养光照周期为10～12l:12～14d、温度为20～22℃，接种后及加水扩种后施用无机肥碳酸氢铵与过磷酸钙的质量比为3～4:1，按照每平方米水面泼洒25～35g全池均匀泼洒，每天施肥1次，每天监测试验池的藻细胞密度和水化学指标，将微藻培养至对数生长期，待用；在适宜培养条件下培养微藻菌种，能够促进微藻菌种健康的生长与繁殖，培养至对数生长期后进行浓缩保存有利于保持小球藻较为旺盛的生命力，易于提高其活性与成活率；
浓缩：取对数期小球藻藻液，在500～800r/min转速离心15～35min，去除上清液得小球藻浓缩液，然后置于微波炉中，将微波炉功率调节至最大功率的20～30%，干燥至恒重，得到微波干燥藻粉；使用微波炉干燥小球藻藻液，可以较高效率的实现脱水干燥，使小球藻保持在对数生长期的旺盛生命状态，同时还可以降低处理时间，节约能源；
保存：按照固液比1:2.5～5的比例将干燥藻粉与蒸馏水置于细胞培养瓶中，然后添加甘油、茶叶提取物、芦荟提取物，甘油的质量分数为0.5～0.8%，金花茶提取物的质量分数为1.2～1.5%，芦荟提取物的质量分数为5.5～6.0%，用锡箔纸完全包裹住细胞培养瓶，将细胞培养瓶置于1～2℃、无菌、充氧、黑暗环境中保存；经过优化，小球藻的保存时间得到了大大的延长，处于零上温度的藻细胞内的自由水不会形成冰晶，绝大部分细胞能够保持完整结构、存活率及恢复生长的能力；复活后小球藻生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标无显著下降，且可在常温下进行贮藏与运输，避免低温耗能与运输不便，而且小球藻活力较好，遗传功能完善，因此是一种长时效、活性高、可持续的小球藻保存方法。
作为优选，藻液培养步骤中的培养液为nano378～80mg/l、nah2po4·h2o3～4mg/l、na2sio3·9h2o22～25mg/l、na2edta4.36～4.4mg/l、fecl3·6h2o3.16～3.2mg/l、cuso4·5h2o0.01～0.015mg/l、znso4·7h2o0.023～0.025mg/l、cocl2·6h2o0.012～0.015mg/l、mncl·4h2o0.18～0.2mg/l、na2moo4·2h2o0.07～0.08mg/l、维生素b10.1～0.12μg/l、维生素b120.5～0.6μg/l、生物素0.8～1μg/l，余量为无菌室，在121℃下灭菌20min。
作为优选，培养期间主要水化学指标为：水温为10.0～12.5℃，盐度为19～21，ph为8.55～9.33，溶解氧为15.2～20.0mg/l，氨态氮为24.29～70.95mg/l，活性磷为0.71～2.37mg/l，透明度为11～18cm。
作为优选，金花茶提取物的制备方法为：按照1:2.1～2.5的重量比将金花茶叶粉以75～90%乙醇溶液渗滤提取得浸膏，将浸膏置于3～4倍2,2-二苯基环戊醇与正丁醇的混合溶剂中萃取，2,2-二苯基环戊醇的含量为0.85～0.88‰，萃取物即为金花茶叶正丁醇提取物，经真空干燥制成浸膏待用；金花茶叶的提取物因含大量的黄酮、茶多酚、茶多糖以及皂苷类成分，具有广泛的药理作用，其与芦荟苷协同作用可以有效抑制保存期间小球藻的细胞活性，降低新陈代谢，降低低温保存期间小球藻生物量、多糖与叶绿素等物质的分解与代谢，维持其内容物含量，并在复活后使小球藻迅速恢复活性与生机；将金花茶叶浸膏置于2,2-二苯基环戊醇与正丁醇的混合溶剂中萃取可以大大提升萃取效率，2,2-二苯基环戊醇与正丁醇协同作用于金花茶叶的纤维组分与蛋白成分，使其纤维降解变性，释放出黄酮、茶多酚、茶多糖、皂苷与萜类等药理成分，同时降低酶对药理组分的分解，提高金花茶叶正丁醇提取物中有效药用成分的含量与纯度，并进一步提高金花茶叶提取物对小球藻的保存效果。
作为优选，芦荟提取物的制备方法为：将芦荟药材研磨成300～360目的微小颗粒，置于容器中，按照料液比1:15～18加入去离子水，调节ph为7.4～7.6，加入芦荟药材重量3～12%的复合酶，复合酶为重量比为1:3～5的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶，再加入复合蛋白酶重量15～18‰的戊二醇与3～3.6‰的t-亮氨酸叔丁酯，在42～45℃温度下酶解提取，酶解25～45min后灭酶，酶解液过0.35～0.45μm的滤膜过滤，取滤液干燥至相对密度为1.05～1.08即得芦荟提取液；以复合蛋白酶可以将芦荟蛋白进行酶解，酶解更彻底，酶解体系中加入特殊配比的戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯可以作用并活化木瓜蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，降低酶解成本与能量消耗，同时使酶解更加彻底，大大削弱芦荟蛋白对芦荟苷的包覆，加速芦荟苷的释放，极大提高芦荟提取液中芦荟苷的含量与纯度，提高其生物学功效。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）使用微波炉干燥小球藻藻液，可以较高效率的实现脱水干燥，使小球藻保持在对数生长期的旺盛生命状态，同时还可以降低处理时间，节约能源；
2）2,2-二苯基环戊醇与正丁醇协同作用于金花茶叶的纤维组分与蛋白成分，使其纤维降解变性，释放出黄酮、茶多酚、茶多糖、皂苷与萜类等药理成分，同时降低酶对药理组分的分解，提高金花茶叶正丁醇提取物中有效药用成分的含量与纯度，并进一步提高金花茶叶提取物对小球藻的保存效果；
3）酶解芦荟体系中加入特殊配比的戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯可大大降低酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，加快酶解反应的进行，降低酶解成本与能量消耗，大大削弱芦荟蛋白对芦荟苷的包覆，加速芦荟苷的释放，极大提高芦荟提取液中芦荟苷的含量与纯度，提高其生物学功效；
4）保存温度处于零上，小球藻细胞内的自由水不会形成冰晶，绝大部分细胞能够保持完整结构、存活率及恢复生长的能力；复活后小球藻生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标无显著下降；
5）可在常温下进行贮藏与运输，避免低温耗能与运输不便，而且小球藻活力较好，遗传功能完善，因此是一种长时效、活性高、可持续的小球藻保存方法。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种小球藻保存方法，具体包括以下步骤：
s1：将小球藻接种于培养液中封闭培养，培养光照周期为10l:14d、温度为20℃，接种后及加水扩种后施用无机肥碳酸氢铵与过磷酸钙的质量比为3:1，按照每平方米水面泼洒25g全池均匀泼洒，每天施肥1次，每天监测试验池的藻细胞密度和水化学指标，将微藻培养至对数生长期，待用；
s2：取对数期小球藻藻液，在500r/min转速离心15min，去除上清液得小球藻浓缩液，然后置于微波炉中，将微波炉功率调节至最大功率的20%，干燥至恒重，得到微波干燥藻粉；
s3：按照固液比1:2.5的比例将干燥藻粉与蒸馏水置于细胞培养瓶中，然后添加甘油、茶叶提取物、芦荟提取物，甘油的质量分数为0.5%，金花茶提取物的质量分数为1.2%，芦荟提取物的质量分数为5.5%，用锡箔纸完全包裹住细胞培养瓶，将细胞培养瓶置于1℃、无菌、充氧、黑暗环境中保存。
藻液培养步骤中的培养液为nano378mg/l、nah2po4·h2o3mg/l、na2sio3·9h2o22mg/l、na2edta4.36mg/l、fecl3·6h2o3.16mg/l、cuso4·5h2o0.01mg/l、znso4·7h2o0.023mg/l、cocl2·6h2o0.012mg/l、mncl·4h2o0.18mg/l、na2moo4·2h2o0.07mg/l、维生素b10.1μg/l、维生素b120.5μg/l、生物素0.8μg/l，余量为无菌室，在121℃下灭菌20min。
培养期间主要水化学指标为：水温为10℃，盐度为19，ph为8.55，溶解氧为15.2mg/l，氨态氮为24.29mg/l，活性磷为0.71mg/l，透明度为11cm。
金花茶提取物的制备方法为：按照1:2.1的重量比将金花茶叶粉以75%乙醇溶液渗滤提取得浸膏，将浸膏置于3倍正丁醇的混合溶剂中萃取，萃取物即为金花茶叶正丁醇提取物，经真空干燥制成浸膏待用；金花茶叶的提取物因含大量的黄酮、茶多酚、茶多糖以及皂苷类成分，具有广泛的药理作用，其与芦荟苷协同作用可以有效抑制保存期间小球藻的细胞活性，降低新陈代谢，降低低温保存期间小球藻生物量、多糖与叶绿素等物质的分解与代谢，维持其内容物含量，并在复活后使小球藻迅速恢复活性与生机。
芦荟提取物的制备方法为：将芦荟药材研磨成300目的微小颗粒，置于容器中，按照料液比1:15加入去离子水，调节ph为7.4，加入芦荟药材重量3%的复合酶，复合酶为重量比为1:3的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶，再加入复合蛋白酶重量15‰的戊二醇与3‰的t-亮氨酸叔丁酯，在42℃温度下酶解提取，酶解25min后灭酶，酶解液过0.35μm的滤膜过滤，取滤液干燥至相对密度为1.05即得芦荟提取液；以复合蛋白酶可以将芦荟蛋白进行酶解，酶解更彻底，酶解体系中加入特殊配比的戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯可以作用并活化木瓜蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，降低酶解成本与能量消耗，同时使酶解更加彻底，大大削弱芦荟蛋白对芦荟苷的包覆，加速芦荟苷的释放，极大提高芦荟提取液中芦荟苷的含量与纯度，提高其生物学功效。
经过优化，小球藻的保存时间得到了大大的延长，处于零上温度的藻细胞内的自由水不会形成冰晶，绝大部分细胞能够保持完整结构、存活率及恢复生长的能力；复活后小球藻生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标无显著下降，且可在常温下进行贮藏与运输，避免低温耗能与运输不便，而且小球藻活力较好，遗传功能完善，因此是一种长时效、活性高、可持续的小球藻保存方法。
实施例2：
一种小球藻保存方法，具体包括以下步骤：
培养：将小球藻接种于培养液中封闭培养，培养光照周期为12l:12d、温度为22℃，接种后及加水扩种后施用无机肥碳酸氢铵与过磷酸钙的质量比为4:1，按照每平方米水面泼洒35g全池均匀泼洒，每天施肥1次，每天监测试验池的藻细胞密度和水化学指标，将微藻培养至对数生长期，待用；在适宜培养条件下培养微藻菌种，能够促进微藻菌种健康的生长与繁殖，培养至对数生长期后进行浓缩保存有利于保持小球藻较为旺盛的生命力，易于提高其活性与成活率；
浓缩：取对数期小球藻藻液，在800r/min转速离心35min，去除上清液得小球藻浓缩液，然后置于微波炉中，将微波炉功率调节至最大功率的30%，干燥至恒重，得到微波干燥藻粉；使用微波炉干燥小球藻藻液，可以较高效率的实现脱水干燥，使小球藻保持在对数生长期的旺盛生命状态，同时还可以降低处理时间，节约能源；
保存：按照固液比1:5的比例将干燥藻粉与蒸馏水置于细胞培养瓶中，然后添加甘油、茶叶提取物、芦荟提取物，甘油的质量分数为0.8%，金花茶提取物的质量分数为1.5%，芦荟提取物的质量分数为6.0%，用锡箔纸完全包裹住细胞培养瓶，将细胞培养瓶置于2℃、无菌、充氧、黑暗环境中保存；经过优化，小球藻的保存时间得到了大大的延长，处于零上温度的藻细胞内的自由水不会形成冰晶，绝大部分细胞能够保持完整结构、存活率及恢复生长的能力；复活后小球藻生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标无显著下降，且可在常温下进行贮藏与运输，避免低温耗能与运输不便，而且小球藻活力较好，遗传功能完善，因此是一种长时效、活性高、可持续的小球藻保存方法。
藻液培养步骤中的培养液为nano380mg/l、nah2po4·h2o4mg/l、na2sio3·9h2o25mg/l、na2edta4.4mg/l、fecl3·6h2o3.2mg/l、cuso4·5h2o0.015mg/l、znso4·7h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.015mg/l、mncl·4h2o0.2mg/l、na2moo4·2h2o0.08mg/l、维生素b10.12μg/l、维生素b120.6μg/l、生物素1μg/l，余量为无菌室，在121℃下灭菌20min。
培养期间主要水化学指标为：水温为12.5℃，盐度为21，ph为9.33，溶解氧为20.0mg/l，氨态氮为70.95mg/l，活性磷为2.37mg/l，透明度为18cm。
金花茶提取物的制备方法为：按照1:2.5的重量比将金花茶叶粉以90%乙醇溶液渗滤提取得浸膏，将浸膏置于4倍2,2-二苯基环戊醇与正丁醇的混合溶剂中萃取，2,2-二苯基环戊醇的含量为0.88‰，萃取物即为金花茶叶正丁醇提取物，经真空干燥制成浸膏待用；金花茶叶的提取物因含大量的黄酮、茶多酚、茶多糖以及皂苷类成分，具有广泛的药理作用，其与芦荟苷协同作用可以有效抑制保存期间小球藻的细胞活性，降低新陈代谢，降低低温保存期间小球藻生物量、多糖与叶绿素等物质的分解与代谢，维持其内容物含量，并在复活后使小球藻迅速恢复活性与生机；将金花茶叶浸膏置于2,2-二苯基环戊醇与正丁醇的混合溶剂中萃取可以大大提升萃取效率，2,2-二苯基环戊醇与正丁醇协同作用于金花茶叶的纤维组分与蛋白成分，使其纤维降解变性，释放出黄酮、茶多酚、茶多糖、皂苷与萜类等药理成分，同时降低酶对药理组分的分解，提高金花茶叶正丁醇提取物中有效药用成分的含量与纯度，并进一步提高金花茶叶提取物对小球藻的保存效果。
芦荟提取物的制备方法为：将芦荟药材研磨成360目的微小颗粒，置于容器中，按照料液比1:18加入去离子水，调节ph为7.6，加入芦荟药材重量12%的复合酶，复合酶为重量比为1:5的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶，在45℃温度下酶解提取，酶解45min后灭酶，酶解液过0.45μm的滤膜过滤，取滤液干燥至相对密度为1.08即得芦荟提取液；以复合蛋白酶可以将芦荟蛋白进行酶解，酶解更彻底。
实施例3：
一种小球藻保存方法，包括：培养、浓缩、保存，具体包括以下步骤：
培养：将小球藻接种于培养液中封闭培养，培养光照周期为12l:12d、温度为20℃，接种后及加水扩种后施用无机肥碳酸氢铵与过磷酸钙的质量比为3.5:1，按照每平方米水面泼洒32g全池均匀泼洒，每天施肥1次，每天监测试验池的藻细胞密度和水化学指标，将微藻培养至对数生长期，待用；在适宜培养条件下培养微藻菌种，能够促进微藻菌种健康的生长与繁殖，培养至对数生长期后进行浓缩保存有利于保持小球藻较为旺盛的生命力，易于提高其活性与成活率；
浓缩：取对数期小球藻藻液，在600r/min转速离心20min，去除上清液得小球藻浓缩液，然后置于微波炉中，将微波炉功率调节至最大功率的25%，干燥至恒重，得到微波干燥藻粉；使用微波炉干燥小球藻藻液，可以较高效率的实现脱水干燥，使小球藻保持在对数生长期的旺盛生命状态，同时还可以降低处理时间，节约能源；
保存：按照固液比1:4的比例将干燥藻粉与蒸馏水置于细胞培养瓶中，然后添加甘油、茶叶提取物、芦荟提取物，甘油的质量分数为0.6%，金花茶提取物的质量分数为1.4%，芦荟提取物的质量分数为5.5%，用锡箔纸完全包裹住细胞培养瓶，将细胞培养瓶置于1℃、无菌、充氧、黑暗环境中保存；经过优化，小球藻的保存时间得到了大大的延长，处于零上温度的藻细胞内的自由水不会形成冰晶，绝大部分细胞能够保持完整结构、存活率及恢复生长的能力；复活后小球藻生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标无显著下降，且可在常温下进行贮藏与运输，避免低温耗能与运输不便，而且小球藻活力较好，遗传功能完善，因此是一种长时效、活性高、可持续的小球藻保存方法。
藻液培养步骤中的培养液为nano378mg/l、nah2po4·h2o3.5mg/l、na2sio3·9h2o24mg/l、na2edta4.4mg/l、fecl3·6h2o3.2mg/l、cuso4·5h2o0.012mg/l、znso4·7h2o0.024mg/l、cocl2·6h2o0.014mg/l、mncl·4h2o0.18mg/l、na2moo4·2h2o0.07mg/l、维生素b10.11μg/l、维生素b120.5μg/l、生物素0.8μg/l，余量为无菌室，在121℃下灭菌20min。
培养期间主要水化学指标为：水温为12℃，盐度为20.5，ph为8.85，溶解氧为18.2mg/l，氨态氮为45.0mg/l，活性磷为1.2mg/l，透明度为15cm。
金花茶提取物的制备方法为：按照1:2.2的重量比将金花茶叶粉以85%乙醇溶液渗滤提取得浸膏，将浸膏置于3倍2,2-二苯基环戊醇与正丁醇的混合溶剂中萃取，2,2-二苯基环戊醇的含量为0.88‰，萃取物即为金花茶叶正丁醇提取物，经真空干燥制成浸膏待用；金花茶叶的提取物因含大量的黄酮、茶多酚、茶多糖以及皂苷类成分，具有广泛的药理作用，其与芦荟苷协同作用可以有效抑制保存期间小球藻的细胞活性，降低新陈代谢，降低低温保存期间小球藻生物量、多糖与叶绿素等物质的分解与代谢，维持其内容物含量，并在复活后使小球藻迅速恢复活性与生机；将金花茶叶浸膏置于2,2-二苯基环戊醇与正丁醇的混合溶剂中萃取可以大大提升萃取效率，2,2-二苯基环戊醇与正丁醇协同作用于金花茶叶的纤维组分与蛋白成分，使其纤维降解变性，释放出黄酮、茶多酚、茶多糖、皂苷与萜类等药理成分，同时降低酶对药理组分的分解，提高金花茶叶正丁醇提取物中有效药用成分的含量与纯度，并进一步提高金花茶叶提取物对小球藻的保存效果。
芦荟提取物的制备方法为：将芦荟药材研磨成300目的微小颗粒，置于容器中，按照料液比1:16加入去离子水，调节ph为7.5，加入芦荟药材重量10%的复合酶，复合酶为重量比为1:4的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶，再加入复合蛋白酶重量16‰的戊二醇与3.5‰的t-亮氨酸叔丁酯，在44℃温度下酶解提取，酶解30min后灭酶，酶解液过0.4μm的滤膜过滤，取滤液干燥至相对密度为1.06即得芦荟提取液；以复合蛋白酶可以将芦荟蛋白进行酶解，酶解更彻底，酶解体系中加入特殊配比的戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯可以作用并活化木瓜蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，降低酶解成本与能量消耗，同时使酶解更加彻底，大大削弱芦荟蛋白对芦荟苷的包覆，加速芦荟苷的释放，极大提高芦荟提取液中芦荟苷的含量与纯度，提高其生物学功效。
对比例1：
取正常培养的小球藻藻液，经120r/min离心20min，弃去上清得小球藻浓缩液，控制小球藻浓缩液中小球藻的浓度为0.2g/100ml；取小球藻浓缩液，加入3倍重量的无菌水，再加入0.5%的甘油、0.03%的山梨酸钠，然后将混合物置于15℃保存。
实验例：
分别采用以下测量方法测量小球藻的生物量、多糖含量与叶绿素含量：
a生物量测定方法：取5ml量的胶球，加入5ml的5％柠檬酸钠，涡旋2～3min至藻珠全部溶解，离心(8000r/min，5min)弃去上清液，加入适量纯水重悬，清洗数遍。将藻泥重新定容至5ml，测其a667值，计算其生物量；
b多糖含量：取1ml藻液，先用水稀释10倍，再使用苯酚硫酸法测多糖，按照标准曲线计算多糖含量；
c叶绿素含量：取5ml藻液，0.45μm滤膜抽滤，吸干水分，用少量无水乙醇洗下，研磨至无水乙醇挥发，继续用液氮研磨10min，用无水乙醇定容至5ml，避光静置于4℃冰箱，24h后将提取液以4000r/min、10min离心，取上清液测定a645、a663，计算叶绿素含量，按照公式计算c=20.3a645+8.04a663，公式中a645、a663分别代表在波长为645nm、663nm下的od值。
将对比例1与实施例1-3中的小球藻的测量结果整理成表1所示。由表1可知，本发明方法中的实施例1-3中的小球藻无论在存活率还是生物量、多糖含量与叶绿素含量等方面均显著优于对比例1，说明本小球藻的保存方法是适用且高效的，同时还应看到，实施例3中小球藻的各项测量指标均明显好于实施例2、实施例3。
表1小球藻的测量数据
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。