本发明涉及一种提高雨生红球藻生物量和虾青素含量的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
天然虾青素是迄今为止人类发现自然界中最强的抗氧化剂，其抗氧化活性远远超过现有的抗氧化剂，被誉为“超级氧化剂”。由于天然虾青素具有良好的生物活性和生物安全性，因此在食品、医药化妆品、保健品、软饮料加工及水产品、家禽和家畜(鸡、猪和牛)饲料添加剂等行业具有广阔的市场前景。
目前，虾青素的主要生产方法包括人工合成和生物获取两种方式。人工合成虾青素不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功能、应用、稳定性、吸收效果和生物安全性等方面差别显著。而天然虾青素的生物来源最适宜大规模生产的利用雨生红球藻积累虾青素。雨生红球藻中虾青素含量高达1.0％～3.0％，因此被看作是天然虾青素的“浓缩品”和最佳生物来源。
虽然雨生红球藻是目前最好的虾青素工业生产来源，但它生长缓慢，培养过程中容易被其他生物污染，为了优化工业生产过程，提高虾青素的产量，需要为天然虾青素的生产提供优良培养方法，以提高工业产量。
目前，在国内已经有雨生红球藻生产虾青素的相关专利技术，如专利名为“一种培养雨生红球藻生产虾青素的建议方法”发明专利(cn：cn581016140)，公开了控制调节培养温度、ph值、添加矿盐实现虾青素的积累；山东鸣惠生物科技股份有限公司“一种利用植物激素促进雨生红球藻生长及虾青素含量的方法”（cn107338194a），公开了利用植物激素萘乙酸和乙烯利提高雨生红球藻中虾青素的产率；山东理工大学发明专利“利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法”(cn：101974599b)，公开了利用无水乙醇溶解油菜素内酯，再将用二甲基亚砜配置好的油菜素内酯母液添加到雨生红球藻培养基中，提高虾青素含量。天津大学的“用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法”（cn1480524a），公开了一种利用酵母发酵残液生产虾青素的方法，是向酵母发酵残液中加入无机盐配成培养基，在特定的容器内培养雨生红球藻，经过分离提取虾青素。上述相关专利中雨生红球藻生物量和虾青素积累量虽然有所提高，但不是很显著或者技术工艺较为复杂，不易操作。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高雨生红球藻生物量和虾青素含量的方法，该方法操作简单，可以一定程度上缩短雨生红球藻的生长周期并提高其生物量和虾青素含量，具体包括以下步骤：
（1）培养基的制备及灭菌：配制氮充足的bbm培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌；醋酸钠的加入量为0.5~2g/l，醋酸镁的加入量为0.05~0.5g/l；
（2）藻液的制备：将培养到对数生长期后期的雨生红球藻种子液接种到步骤（1）中制备的培养基中进行培养，使藻浓度为2.0×105-2.5×105cells/ml；每隔一天进行取样测其生物量；做培养基中雨生红球藻的生长曲线并将生物量最大时的雨生红球藻进行收集；
（3）将配制的褪黑素母液添加至高压湿热灭菌过的缺氮bbm培养基中，培养基中褪黑素的浓度为5~15μmol/l，在无菌条件下将步骤（2）中收集的雨生红球藻用缺氮bbm培养基稀释至浓度为2.0×105-2.5×105cells/ml；
（4）在高光照条件下培养，每隔一天进行取样测虾青素含量。
优选的，本发明所述高压湿热灭菌的条件为121℃，20min。
优选的，本发明所述步骤（2）中培养条件为：温度25℃，光照强度3500lx，摇床转速150r/min。
本发明所述雨生红球藻为雨生红球藻菌株haematococcuspluvialislugu，按常规方法培养。
本发明的原理：雨生红球藻属于一种单细胞绿藻，它具有特殊的生物学性质，其生长周期分为快速生长繁殖的游动细胞阶段和虾青素积累的不动细胞（孢子）阶段，这两个阶段所需的适宜培养条件差别较大。在游动细胞阶段，藻体生长繁殖快，需要充足的营养、弱光和适宜的温度，本发明采用两阶段培养的方法；采用兼养促进雨生红球藻生物量的提高再结合诱导的策略来提高虾青素含量；醋酸镁和醋酸钠作为雨生红球藻在生长繁殖阶段可利用的碳源，为藻体的生长提供了充足的营养。因此在基础培养基中添加醋酸镁或醋酸钠来提高雨生红球藻的生物量。另外褪黑素作为一种广谱生理调节剂，可以通过提高植物各种与抗氧化胁迫有关的酶活性及增加体内抗氧化物质，抑制ros的产生，避免氧化损伤，因此有可能会对雨生红球藻产虾青素有一定积极影响。
本发明的有益效果是：
本发明操作简单易行，培养周期短，大幅提高了雨生红球藻的生物量和虾青素含量，实验证明，添加2.0g/l的醋酸钠的诱导组比对照组生物量提高了大约50％，达到了1.36g/l；添加0.5g/l的醋酸镁的诱导组比对照组生物量提高了大约35％，达到了1.30g/l；在添加醋酸钠组中结合褪黑素诱导，当添加褪黑素浓度为10μmol/l时诱导组比对照组虾青素含量提高了大约183.6％，达到了32.9mg/g；在添加醋酸镁组中结合褪黑素诱导，当添加褪黑素浓度为10μmol/l时诱导组比对照组虾青素含量提高了大约190.2％，达到了34mg/g。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
本发明实施例所述方法按以下步骤实现：
（1）培养基的制备及灭菌：配制氮充足的bbm培养基，配制氮充足的bbm培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌（灭菌条件为121℃，20min；）；醋酸钠的加入量0.5~2g/l，醋酸镁的加入量为0.05~0.5g/l；
（2）藻液的制备：雨生红球藻种子液在24-26℃、光强2000-2500lx，持续光照条件下培养，培养到对数生长期后期，离心，利用步骤（1）中配制的培养基将雨生红球藻种子液稀释到2.5×105cells/ml作为试验藻液；试验藻液在温度24-26℃，光强2000-2500lx的条件下进行常规培养，每隔一天用无菌水进行补液，进行取样测其生物量；生物量的测量方法为：在每个浓度的试验瓶中取10ml藻液，3500r/min离心5min，弃上清得藻细胞沉淀，加1ml蒸馏水混匀，吸入ep管中，5000r/min离心3min，弃上清得藻细胞沉淀，放入真空冷冻干燥机，称其干重。
（3）生长曲线的制作：找出培养基中生物量达到最大的时间点，并在生物量达到最大时，在无菌条件下将雨生红球藻离心收集到无菌离心管中。
（4）将配制的褪黑素母液（利用二甲基亚砜充分溶解褪黑素所得溶液）添加至高压湿热灭菌过的缺氮bbm培养基中，使培养基中褪黑素的浓度为分别为0、5、10、15μmol/l。
（5）在无菌条件下，利用步骤（5）中配制的培养基将步骤（3）中收集的湿藻体在超净环境中稀释至5×105cells/ml。
（4）在高光照条件下培养，培养的适宜条件为：温度26-28℃，光强12000-14000lx，每隔一天进行取样测虾青素含量。
采用hplc方法测定虾青素含量，具体方法为：
每隔一天用无菌水进行补液，并取5ml藻细胞培养液，3000×g低温（4℃）离心15min，弃去上清液，藻细胞沉淀用超纯水洗3次，3000×g离心，加入5ml甲醇-二氯甲烷（体积比3:1）提取液，在低温环境下（试管外冰水冷却）用高速组织匀浆机2800r/min匀浆20s，匀浆液10000×g低温离心15min，将上清液转移至另一试管中；重复以上色素提取步骤3-4次，直至藻细胞中色素提取完全，细胞沉淀物变为灰白色为止。将所有收集的提取液低温离心（10000×g）15min，取上清液保存于-20℃，待用。准确称取9.5g虾青素标准品（sigma），用甲醇-二氯甲烷（体积比3:1）溶液配制成100mg/l的储备液（超声波促进溶解），存放于棕色瓶中，保存在4℃冰箱，使用前配成合适含量的工作液用于液相色谱标准曲线制作。色谱柱为c18柱(waters,25cm×4.6mmol/l，5μmol/l)；流动相a为丙酮，流动相b为甲醇-水（9:1），洗脱梯度为：25minb80%-20%，10minb20%，5minb20%-80%，流速为1.25ml/min；检测器为waters996光电二极管阵列检测器，进样量20μl；光谱扫描波长范围为250-700nm，检测波长为476nm；通过标准曲线得到虾青素浓度c(mg/l)；最终得到虾青素含量：p(mg/g)=c(mg/l)/dbw(g/l)。
实施例1
（1）在氮充足的bbm培养基中添加醋酸钠，使其浓度分别为0g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l。
（2）雨生红球藻采用雨生红球藻菌株haematococcuspluvialislugu，利用bbm培养基，在温度为（24-26℃之间的任意温度）、光强为（2000-2500lx之间的任意值），持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长期，利用（1）中配制的的bbm培养基稀释到2.5×105cells/ml作为试验藻液；然后将上述藻液在（24-26℃之间的任意温度）、光强（2000-2500lx之间的任意值）条件下进行常规培养；每隔一天定时取样，然后离心冻干，称量细胞干重。
发现在第5天，添加醋酸钠浓度为2g/l时，细胞干重达到最大即生物量达到最大，大约是对照组的1.5倍。
（3）在添加醋酸钠浓度为2g/l的培养基中将雨生红球藻培养至第五天时，离心收集藻细胞。
（4）在缺氮的bbm培养基中添加褪黑素母液，使其浓度分别为0、5、10、15μmol/l，然后利用此培养基将（3）中离心收集的藻细胞稀释至浓度为2.5×105cells/ml；上述藻液在温度为（26-28℃之间的任意温度）、光强为（12000-14000lx之间的任意值）条件下进行诱导培养；每隔一天定时取样，然后提取虾青素，采用hplc方法测得虾青素含量。
发现诱导培养至第13天，虾青素含量达到最大，且褪黑素浓度为10μmol/l时，虾青素含量最高，大约是对照组的3倍。
表1（a）不同醋酸钠浓度条件下雨生红球藻生物量(g)
表1（b）醋酸钠浓度为2g/l时不同褪黑素浓度条件下雨生红球藻虾青素积累量(mg/g)
本实施例的结果如表1(a)、表1(b)所示，由表可以看出在第5天，添加醋酸钠浓度为2g/l时，细胞干重达到最大即生物量达到最大，大约是对照组的1.5倍。褪黑素诱导培养至第13天，虾青素含量达到最大，且褪黑素浓度为10μmol/l时，虾青素含量最高，大约是对照组的3倍。
实施例2
（1）在氮充足的bbm培养基中添加醋酸镁，使其浓度分别为0、0.05、0.1、0.5g/l。
（2）雨生红球藻采用雨生红球藻菌株haematococcuspluvialislugu，利用bbm培养基，在温度为（24-26℃之间的任意温度）、光强为（2000-2500lx之间的任意值），持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长期，利用（1）中配制的的bbm培养基稀释到2.5×105cells/ml作为试验藻液。然后将上述藻液在（24-26℃之间的任意温度）、光强（2000-2500lx之间的任意值）条件下进行常规培养。每隔一天定时取样，然后离心冻干，称量细胞干重。
发现在第7天，添加醋酸镁浓度为0.5g/l时，细胞干重达到最大即生物量达到最大，大约是对照组的1.3倍。
（3）在添加醋酸镁浓度为0.5g/l的培养基中将雨生红球藻培养至第七天时，离心收集藻细胞。
（4）在缺氮的bbm培养基中添加褪黑素母液，使其浓度分别为0、5、10、15μmol/l，然后利用此培养基将（3）中离心收集的藻细胞稀释至浓度为2.5×105cells/ml。上述藻液在温度为（26-28℃之间的任意温度）、光强为（12000-14000lx之间的任意值）条件下进行诱导培养；每隔一天定时取样，然后提取虾青素，采用hplc方法测得虾青素含量。
发现诱导培养至第13天，虾青素含量达到最大，且褪黑素浓度为10μmol/l时，虾青素含量最高，大约是对照组的3.1倍。
表2（a）不同醋酸镁浓度条件下雨生红球藻生物量(g)
表2（b）醋酸镁浓度为0.5g/l时，不同褪黑素浓度下雨生红球藻虾青素积累量(mg/g)
本实施例的结果如表2(a)、表2(b)所示，由表可以发现在第7天，添加醋酸镁浓度为0.5g/l时，细胞干重达到最大即生物量达到最大，大约是对照组的1.3倍。褪黑素诱导培养至第13天，虾青素含量达到最大，且褪黑素浓度为10μmol/l时，虾青素含量最高，大约是对照组的3.1倍。