本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，确切地说是棉花逆境诱导启动子pGhWRKR2的克隆及其在转基因植物中的应用。
背景技术：
棉花在整个生育期内不可避免会受到多种不良环境变化的影响，如干旱、高盐、低温等。由于植物抗逆性状本身的复杂性及其与数量性状位点连锁关系的复杂性，用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难。在逆境胁迫下，植物能感知并传递胁迫信号，通过激活相应转录因子，启动抗逆功能基因的表达，使植物体内发生一系列的生理生化反应抵御不良环境的危害，从而提高植物的耐逆性。这些受环境影响而诱导表达的基因都是由诱导启动子调控其转录的，分离和研究这些基因的调控区域对于研究植物响应各种胁迫的生理机制以及研究农作物的抗逆基因工程无疑具有重要意义。诱导型启动子的启用，相当于在转基因的上游设置一个有效的“表达开关”，接受外界环境或诱导物质等因子的调控。当转基因植物受到逆境胁迫时就会表达相应蛋白，从而使转基因植物更好地适应逆境。因此，分离逆境胁迫诱导高效表达的启动子是解决植物抗逆基因工程的关键因素。
在以往的植物基因工程研究中，组成型启动子由于简单方便而得到广泛应用。组成型启动子驱动外源基因在棉花的不同时期和不同部位均能表达，而且组成型启动子的高表达、强启动效应容易积累大量异源蛋白或代谢产物，从而影响棉花正常生长。逆境胁迫诱导型启动子能驱动外源基因在植物处于逆境胁迫条件下(干早、高盐及低温等)特异表达，而不影响植物生长发育及生理代谢。因此，在植物的基因工程领域中，亟待获得有效的诱导表达启动子，使靶标基因精确地按需表达，从而为农业生产服务。国内外已有很多学者从事这方面的研究，并且有不少成功的例子。GhWRKY64(KF031101)基因上游启动子的表达不仅具有组织特异性，并且为病原菌所诱导。水稻干旱胁迫诱导启动子Oshox24P受脱落酸(ABA)的诱导，但对高盐和低温胁迫的反应并不明显。茄线粒体小分子热激蛋白(Lehsp23.8)的启动子融合GUS转化烟草，可鉴定其组织表达特异性及顺式表达元件。葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的上游启动子PCAN具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子转化马铃薯(Solanum tuberosum)具有低温诱导表达的能力。马铃薯低温诱导启动子(CIP)抑制马铃薯块茎发生"低温糖化"。鲁棉研GhSNAC3启动子是一个盐诱导型启动子，且具有组织特异性。水稻OsGSTLc上游启动子的不同启动子缺失系列均能启动下游GUS报告基因的表达。拟南芥冷诱导型启动子CBF3和农杆菌Ti质粒上的IPT基因使得转基因植株性状发生了很大的改变。木薯低温干旱诱导基因MeLTI6A的启动子可能通过对干旱胁迫激素信号响应以及逆境胁迫响应起作用。拟南芥AtPUB18的启动子驱动报告基因GUS的.组织化学染色结果表明，AtPUB18的表达受高盐胁迫诱导。小麦逆境诱导表达启动子mwcs120在单子叶和双子叶植物中均受低温和高盐逆境诱导表达。低温诱导GmERF9P启动子在低温处理下能够提高GUS基因的表达量,具有低温诱导启动活性。大麦启动子HVA1s、Dhn4s和Dhn8s可有效启动GFP和GUS基因在大麦幼苗中的瞬间表达。综上所述，在不少植物中发现了诱导型启动子，但关于棉花逆境诱导表达启动子的研究，有关的报道相对较少。棉花逆境诱导启动子能驱动外源基因在转基因植物中适时表达，不但可以降低植物耗能减轻对植物形态和生长发育的影响，还可以提高外源基因在特定时刻的表达浓度，增强转基因的效果，有目的地改良棉花的品质和产量。因此，分离、克隆胁迫诱导型启动子对于研究在转录水平上抗逆相关基因的上游表达调控机制具有重要意义。
本发明利用高效的棉花逆境诱导启动子pGhWRKR2代替组成型启动子，只有在植株受到合适的诱导信号时才会表达，从而将外源基因的表达对植株的负面影响降至最小。鉴于此，棉花逆境诱导启动子pGhWRKR2在棉花抗旱、抗高渗胁迫等转基因优良品种选育等方面具有很大潜力，具有广泛的应用前景。
技术实现要素：
本发明目的是解决现有植物基因工程技术中，因使用组成型启动子使外源基因在转基因植物中过量表达异源蛋白或代谢产物，使植物原有的代谢失衡，阻碍了植物的正常生长发育，甚至导致死亡。本发明主要是提供一种驱动外源基因在植物逆境中诱导表达的启动子pGhWRKR2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种植物逆境诱导启动子的克隆方法，具体操作步骤如下：
第一、以陆地棉基因组DNA为模板，用PCR方法扩增2基因，并根据经验证的已知DNA序列区(最好不少于500bp)依次设计从3′端到5′端的三条特异性引物：SP1、SP2、SP3(表1)。
第二、回收第三轮PCR扩增产物，与pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)在连接酶催化下进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄霉素抗性筛选，获得该启动子的阳性TA克隆。
第三、由于一次扩增得不到启动子全长，还需根据测序结果设计引物，朝3′端方向继续扩增，因此又分别设计了第二轮及第三轮扩增的SP1、SP2、SP3特异性引物(表1)，操作步骤同上，将扩增产物连pMD18-T载体送去测序。
第四、将三次扩增正确序列用DNAstar软件进行拼接和组装获得启动子全长序列。
本发明提供了一种“启动子-GUS报告基因”融合基因的构建及其在转基因拟南芥中逆境诱导表达。具体操作过程如下：
第一、以陆地棉C312的DNA基因组为模板，扩增pGhWRKR2启动子，在上下游引物中分别引入HindⅢ/和XbaI酶切位点，回收启动子片段。
第二、用限制性内切酶HindⅢ/和XbaI将35S启动子片段从植物表达载体pBI121上切下，用凝胶回收试剂盒进行回收载体大片段。
第三、混合上述pBI121载体大片段和pGhWRKR2启动子片段，在连接酶催化下进行连接反应，转化大肠杆菌并鉴定阳性克隆，完成逆境诱导表达启动子与GUS融合基因的构建。
植物逆境诱导表达启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了HindⅢ酶切位点，下游引物引入了XbaI酶切位点：
上游引物：5’-CCAAGCTT(HindⅢ)TCTGAGAATAGTGTATGCGGCGA-3'
下游引物：5’-GCTCTAGA(XbaI)TGGGAAGAATTGATGTTGAGGTC-3'
所述应用中的“启动子-GUS报告基因”在转基因拟南芥叶片中特异表达，操作过程如下：
拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral dip的方法(Clough and Bent1998)，获得的种子经过100mg/L卡那霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株移栽到蛭石中培养，利用组织化学染色的方法(Jefferson R A,1987)，检测转基因拟南芥GUS报告基因表达的表达特性。
本发明的启动子可作为构建植物表达载体构建旳元件，用于外源基因在逆境诱导表达的研究。本发明所述的pGhWRKR2启动子能驱动目的基因只有在受到合适的诱导信号时才会表达，从而将外源基因的表达对植株的负面影响降至最低。本发明提供的pGhWRKR2启动子对启动目的基因在逆境条件下的高表达，提高转基因植物对干旱等逆境的耐受性和抗性，具有重要意义。
与现有技术相比
附图说明
图1为启动子扩增产物。A为启动子第一轮扩增产物；M：DNA marker 2000，条带大小分别为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1泳道：PCR第一轮扩增产物800bp；B为启动子第二轮扩增产物；M：DNA marker 2000；2、3泳道：PCR第二轮扩增产物600bp；C为启动子第三轮扩增产物；M：DNA marker 2000；2泳道：PCR第三轮扩增产物600bp；D为启动子全长扩增产物；1、2、3、4泳道：启动子全长扩增到产物1.8kb。
图2为pGhWRKR2启动子融合GUS基因的染色活性分析。A为野生型拟南芥的染色情况；B为转拟南芥幼苗在处理前的GUS染色情况；C为转拟南芥幼苗在4℃处理24小时环境下幼苗中GUS的染色情况；D为转拟南芥幼苗在150mM NaCl处理24小时环境下幼苗中GUS的染色情况；E为转拟南芥幼苗在250mM Mannitol处理24小时环境下幼苗中GUS的染色情况；F转拟南芥幼苗在100mM ABA处理24小时环境下幼苗中GUS的染色情况。
图3为pGhWRKR2启动子依次缺失片段的扩增。1泳道：pGhWRKR2启动子缺失片段276bp；2泳道：pGhWRKR2启动子缺失片段653bp；3泳道：pGhWRKR2启动子缺失片段1094bp；4泳道：pGhWRKR2启动子缺失片段1276bp；M：DNA marker2000，条带大小分别为：4500bp，3000bp，2000bp，1200bp，800bp，500bp，200bp。
图4为pGhWRKR2启动子依次缺失片段融合GUS基因的染色活性分析。CaMV35S：CaMV35S：：GUS转基因拟南芥；276：pGhWRKR2启动子-1一-276区段驱动GUS基因转化拟南芥；653：pGhWRKR2启动子-1一-653区段驱动GUS基因转化拟南芥；1094：pGhWRKR2启动子-1一-1094区段驱动GUS基因转化拟南芥；1276：pGhWRKR2启动子-1一-1276区段驱动GUS基因转化拟南芥。
具体实施方式
下面详细说明本发明的优选实施方式。
实施例1提取陆地棉Coker 312基因组DNA
将陆地棉Coker 312种子播在装好蛭石与营养土混合的营养钵中，放在RXZ型智能人工气候培养箱中培养。种子出芽后采用Hoagland营养液培养，白天28℃，黑夜18℃，光照16h/d，光强3000lx，相对湿度75；取生长2周的棉花幼苗嫩叶，按照改良CTAB法小量提取棉花基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA在260nm和280nm处吸光度值，计算DNA浓度与纯度，所得DNA浓度为OD260/OD280＝1.81，纯度为460ng/μl；
实施例2棉花pGhWRKR2启动子的克隆。
采用Genome walking法克隆棉花pGhWRKR2启动子5′侧翼序列，具体操作步骤参照TaKaRa公司的Genome Walking Kit说明书，根据具体情况略有变动。以陆地棉基因表达谱芯片为参考，初步筛选出一个逆境诱导表达的基因GhWYKY2。将此表达序列标签ESTs序列在NCBI上Blast比对获得完整cDNA序列。根据该基因的最大开放阅读框(ORF)设计引物GhWRKR2-F及GhWRKR2-R(表1)进行基因全长扩增。
表1：引物及碱基组成
以基因组DNA为模板，用AP1、AP2、AP3及AP4Primer分别与特异性SP1Primer进行第一轮PCR；将1st PCR反应液稀释100倍后，取1μl作为2nd PCR反应的模板，分别以AP1、AP2、AP3、AP4Primer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行第二轮PCR反应。将2nd PCR反应液稀释100倍后，取1μl作为3rd PCR反应的模板，分别以AP1、AP2、AP3、AP4Primer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行第三轮PCR反应。
以1％琼脂糖凝胶电泳检测3轮PCR产物(图1)，用DNA凝胶回收试剂盒回收第三轮PCR产物中的单一条带；将回收产物与pMD18-T载体连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，进行Amp(100mg/ml)、IPTG/X-gal筛选；挑白色单菌落扩大培养后提取重组质粒，重组质粒经PCR鉴定后，将阳性克隆菌液送上海生工测序。由图1可见，启动子第一轮扩增得到800bp(图1A)，启动子第二轮扩增得到600bp(图1B)，启动子第三轮扩增得到600bp(图1C)。将三轮扩增产物进行拼接并除去重叠DNA序列，三轮扩增得到启动子序列总长度约1.8kb。
根据Genome walking法所得序列设计特异引物：pGhWRKR2-F、pGhWRKR2-R，以陆地棉Coker 312基因组DNA为模板进行扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在约1.8kb处有单一的特异条带(图1D)，大小与预计理论值相符。用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将纯化产物与pMDl8-T载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，进行氨苄霉素、蓝白斑筛选，选取重组质粒PCR及酶切鉴定均为阳性的克隆菌液送上海生工测序。测序结果分析显示：片段长度为1.8kb，克隆序列的部分序列已知序列部分几乎完全重叠，表明已成功克隆到棉花pGhWRKR2启动子序列；其碱基序列如序列表所示。
运用PlantCARE在线分析软件查找pGhWRKR2启动子序列的重要顺式作用元件，结果表明：pGhWRKR2启动子序列具有典型的TATA框和CAAT框，分别位于转录起始位点上游-419bp和-379bp处。WRKY家族特有的W-box位于位于转录起始位点上游-453bp处。启动子序列除了含有核心元件及顺式元件外，还存在光反应元件、MYB干旱诱导结合位点等多个特异性作用元件。
实施例3植物表达载体pBI121-pGhWRKR2及依次缺失片段载体的构建
根据PlantCARE在线分析启动子各元件，分别设计启动子元件依次缺失引物，构建启动子及启动子不同缺失序列与GUS融合的表达载体，通过GUS报告基因分析启动子调控关键区段与顺式作用元件。以棉花C312的DNA基因组为模板，扩增pGhWRKR2启动子依次缺失片段的上下游引物中分别引入HindⅢ/和XbaI酶切位点。经过PCR依次扩增，分别获得了276bp，653bp，1094bp，1276bp的启动子片段，如图3所示。用限制性内切酶HindⅢ和XbaI将35S启动子片段从植物表达载体pBI121上切下，用T4DNA连接酶将pGhWRKR2启动子连接至pBI121载体，转化大肠杆菌DH5α感受态并鉴定阳性克隆，从而获得诱导表达载体pBI121-pGhWRKR2。
实施例4农杆菌介导的拟南芥遗传转化及转基因植株的阳性筛选
用实施例3构建的诱导表达pGhWRKR2启动子-GUS融合基因转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导的Floral dip的方法(Clough and Bent,1998)，获得的种子经过100mg/L卡那霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南(第三版)》方法提取叶片基因组DNA，用相应引物进行PCR反应，反应体系如同实施例2。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现预期大小的启动子条带，证明目的片段已整合到植物基因组中。拟南芥农杆菌介导转化按参考文献操作，略有改动，同时以pBI121载体作为对照。
实施例5pGhWRKR2启动子在拟南芥叶片中的GUS组织化学分析
收集T1代种子并在筛选培养基(MS培养基添加100mg/L卡那霉素)上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至蛭石中培养，分别收获T2代种子再进行下一轮的卡那霉素筛选，挑选出绿苗：白苗为3：1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子(T3代)。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合转基因株系。
为了分析pGhWRKR2启动子对逆境胁迫的响应情况，对转基因拟南芥进行了多种胁迫处理。具体做法是：将在MS固体培养基平皿中培养两周的转基因拟南芥幼苗，用镊子小心夹取部分幼苗，移植到MS液体培养基中进行胁迫处理。胁迫处理条件设置为仅用MS液体培养基在4℃处理(代表低温)以及MS液体培养基中分别添加150Mmol NaCl(代表高盐)、250mM Mannitol(代表高渗或干旱)、100mM ABA在常温(22℃)下处理，对照组仅用MS液体培养基在常温下处理。在处理24h后，分别取材进行GUS染色，方法参照(Jefferson R A.,1987)。将植物材料置于含有X-Gluc反应液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0；0.5mmol/L K3[Fe(CN)6]；0.5mmol/L K4[Fe CN)6]；10mmol/LEDTA；0.1％Triton X-100；2mmol/L X-gluc)的离心管中，抽真空20min，37℃染色0.5h，最后用70％乙醇脱色，利用实体显微镜进行观察和照相。结果显示：野生型拟南芥幼苗在各种胁迫前后均不能被GUS染液染成蓝色，转入pGhWRKR2启动子后的转基因拟南芥幼苗在处理前，GUS染色没有变蓝；而在甘露醇及ABA处理24h后经过GUS染色明显使植株幼苗变蓝，而其它处理染色结果不明显。此外，与正常生长条件相比，Man处理后除CaMV35S株系的CUS染色无明显改变外，pGhWRKR2启动子各片段转基因株系的CUS染色强度均显著降低。pGhWRKR2启动子的不同长度片段在Man处理后整株总表达活性减弱，说明其表达活性与片段长度有一定关系。在Man诱导下，启动子能激活下游GUS基因的表达，在-1—-276区域内存在抑制启动子活性的调控元件，在-276—-653区域存在与干旱应答有关的重要调控元件。这说明pGhWRKR2启动子主要是受干旱胁迫诱导表达的，并且在逆境条件下通过各区域调控元件的共同作用参与干早肋迫应答反应。
上述的实施例结果表明，本发明所提供的陆地棉pGhWRKR2启动子具有高效的胁迫诱导表达性，可广泛应用于植物基因工程中使目的基因在植物中逆境诱导表达，在作物抗旱等抗逆育种上显示出巨大的应用潜力。
以上所述的仅是本发明/发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。