本发明涉及dna测序技术领域，具体涉及一种荧光标记可剪切核苷酸及其合成方法以及在dna测序中的用途。
背景技术
基因测序，即测dna序列的技术。在分子生物学研究中，dna的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。基因测序技术被看作自疫苗问世以来疾病预防最重要的科技突破，它不仅可以大大降低遗传相关的疾病发生率，减少出生缺陷，还可以实现对疾病预测、预防、预警以及个体化诊疗；研究表明，人体内总共约有3万多个基因，除外伤，人类的疾病大多与基因相关，基因异常、基因受损都会引起对应的蛋白质或酶的功能变化，从而引起疾病。基因检测就是通过血液以及其他体液或细胞中的dna或rna进行检测的技术，从而使人们能了解自己的基因信息，预知身体患疾病的风险，通过改善生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。相关统计数据显示：目前约有2500多种疾病已经有了对应的基因检测方法，并在美国临床合法应用，甚至基因检测已成为美国疾病预防的常规手段之一。在我国，基因测序被人们广为熟知，应该归功于无创产前筛查高通量测序这一项目，即通过化验孕妇的血液，结合其他临床信息，来综合判断胎儿患有唐氏症的危险程度。
dna测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。成熟的dna测序技术始于20世纪70年代中期。1977年maxam和gilbert报道了通过化学降解测定dna序列的方法。同一时期,sanger发明了双脱氧链终止法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生a，t，c，g四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的page胶上电泳进行检测，从而获得dna序列。至此，开创了dna测序时代，20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将dna测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代dna测序技术。最近几年发展起来的第二代dna测序技术(边合成边测序，sequencingbysynthesis)，则使得dna测序进入了高通量、低成本的时代。边合成边测序(sequencingbysynthesis)就是加入改造过的dna聚合酶和带有4种荧光标记的dntp，这些特殊结构的核苷酸是“可逆终止子”(reversibletermination)，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板dna片段的序列。
为了达到边合成边测序的目的,这类“可逆终止子”(reversibletermination)，核苷酸有两个位点需要实现可逆,即3’-羟基和荧光基团与核苷酸相连的连接单元,俗称“桥”.3’-羟基的修饰有两种结构：一是3’-羟基接团被其他基团取代，从而使3’-羟基丧失进攻磷酸基团的能力而阻止下一个碱基的延伸；第二种结构虽然没有取代3’-羟基,但利用其他位置的基团的阻断效应如空间位阻等作用,使得3’-羟基无法进攻磷酸基团。
这类特殊结构的核苷酸除了要求3’-羟基阻断外，为了不影响下一个标记核苷酸的并入和识别，还要求“桥”连接单元是一个可剪切的基团,在下一个核苷酸并入之前，在温和的条件下使连接单元断裂，实现dna链的继续延伸，从而读出dna碱基序列。该连接单元的性能对dna测序的效率和读长有着至关重要的作用。它就要保证在链接聚合酶作用的条件下稳定，又要在相对温和的条件下被剪切。
目前这类“可逆终止子”(reversibletermination)，存在几类问题,一是剪切连接单元的条件不够温和导致整个核苷酸结构被破坏,或者剪切的效率不高,如荧光标记的不完全剪切,引起的荧光信号的互相干扰,二是3’-羟基被取代的碱基不易被聚合酶识别,或者3’-羟基剪切的效率不高,从而影响测序的长度和准度。
因此,设计合成新的在温和条件下能够高效率实现可剪切的“可逆终止子”，对发展新的测序方法有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种新的基于二硫键连接单元的可逆终止子，即荧光标记可剪切核苷酸，该类核苷酸在模拟dna测序的环境中一次只能延伸一个可逆终止子，二硫键在温和的还原剂三(2-羧乙基)膦(tcep)的作用下发生裂解，实现可逆终止子高效快捷的剪切，而断裂后的核苷酸片段可以在聚合酶的作用下继续延伸，这种基于二硫键连接单元的可逆终止子具有应用于dna测序的巨大潜力和价值；同时该可逆终止子合成方法操作简便、对设备要求低、成本低，设备使用效率高等特点，达到大规模生产应用的要求。
具体而言，本发明提供的荧光标记可剪切核苷酸具有如下通式(i)所示的结构：
所示通式(i)中：fluorescent代表荧光基团；本发明所述的荧光基团可以是荧光素系列、罗丹明系列、菁染料系列、香豆素系列、bodipy系列或alexafluor系列，或上述各系列的衍生物中的任意一种或几种。具体而言，所述荧光基团可以是6-rox、bodipy-fl-510、菁染料cy3、菁染料cy5或菁染料cy7。
所示通式(i)中：base代表碱基；本发明所述的碱基可以为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或上述各碱基的衍生物中的任意一种。
所示通式(i)中：r1～r8各自独立地选自氢原子、c1～c10的烷基、c1～c10的烷氧基，peg链、羧酸酯、取代或未取代的苯基；优选地，r1～r8各自独立地选自氢原子、c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基。所述烷基可以为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基；当所述烷基的碳原子数大于等于3时，所述烷基可以是直链烷基，也可以是支链烷基。所述烷氧基可以为甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、氧戊基、己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基或癸氧基；当所述烷氧基的碳原子数大于等于3时，所述烷基可以是直链烷氧基，也可以是支链烷氧基。具体而言，所述r1～r8可均为氢原子，或者r1、r2、r5、r8均为甲氧基且r3、r4、r6、r7均为氢原子，或者r1、r2均为丁氧基、r5、r8均为甲氧基且r3、r4、r6、r7均为氢原子，或者r1、r2、r5、r8均为甲氧基且r3、r4、r6、r7均为氢原子。
所示通式(i)中：m为0～10的整数，优选为1～5的整数，如1、2、3、4或5；n为0～10的整数，优选为1～5的整数，如1、2、3、4或5。所述m、n的取值可以相同，也可以不同。作为本发明的一种优选方案，所述m、n均为1。
作为本发明的一种优选方案，所述荧光基团为6-rox,碱基为尿嘧啶或胸腺嘧啶。
作为本发明的一种优选方案，所述荧光基团为bodipy-fl-510，碱基为胞嘧啶。
作为本发明的一种优选方案，所述荧光基团为菁染料cy5，碱基为腺嘌呤。
作为本发明的一种优选方案，所述荧光基团为菁染料cy7，碱基为鸟嘌呤。
作为本发明的一种优选方案，r1～r8均为氢原子，m为1，n为1。
作为本发明的一种优选方案，r1、r2、r5、r8均为甲氧基，r3、r4、r6、r7均为氢原子，m为1，n为1。
作为本发明的一种优选方案，r1、r2均为丁氧基，r5、r8均为甲氧基，r3、r4、r6、r7均为氢原子，m为1，n为1。
作为本发明的一种优选方案，r1、r2、r5、r8均为甲氧基，r3、r4、r6、r7均为氢原子，m为1,n为1。
作为本发明的优选方案，所述可剪切核苷酸选自如下结构中的一种或几种：
在上述四种结构中，所述m为0～1的整数，优选为1～5的整数，更优选为1；所述n为0～1的整数，优选为1～5的整数，更优选为1。
本发明所述的一种荧光标记可剪切核苷酸,选择二硫键作为可断裂基团。二硫键又称又称s－s键，是位于不同位置上的两个-sh基被氧化而形成的-s-s-形式的硫原子间的键。在生物化学的领域中，通常系指在肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键。此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。
二硫键的建立和打开，从化学反应机理上说，其实质是一个氧化还原反应。重要的是二硫键的建立和打开所需的反应条件都很温和，二硫键的建立一般是巯基在温和的氧化剂如空气，二甲基亚砜(dmso),n-碘代丁二酰亚胺(nis)等氧化下形成热力学稳定的二硫键，二硫键在温和的还原剂如巯基乙醇(b-me)，二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep)的作用下发生裂解。该裂解过程反应条件极其温和，不需要其他的催化剂或辅助剂参与，不会发生催化剂与其他核苷酸的副反应，不会对测序过程中的聚合酶有破坏或抑制作用。有利于较长片段dna的测序。本发明提供的荧光标记可剪切核苷酸在二代和三代测序平台具有重要的应用价值。
本发明所述的荧光标记可剪切核苷酸中的s-s连接单元，其结构是如下式所示：
其中r1～r8为h、c1-c10的烷基，烷氧基，peg链，羧酸酯，苯基中的一种或几种，m为0～10中任一整数，n为0～10中任一整数。
当优选方案r1,r2,r3,r4,r5,r6,r7,r8为h，m为1,n为1,结构式如下：
其二硫键连接单元在0.5mmtecp溶液中时，其半衰期为7秒。
当优选方案r1,r2,r5,r8为甲氧基(-och3)；r3,r4,r6,r7,为h，m为1,n为1,结构式如下：
其二硫键连接单元在0.5mmtecp溶液中时，其半衰期为72秒。
当优选方案r1,r2为丁氧基(-oc4h13)，r5,r8为甲氧基(-och3)，r3,r4,r6,r7,为h，m为1,n为1,结构式如下：
其二硫键连接单元在0.5mmtecp溶液中时，其半衰期为2480秒。
当优选方案r1,r2,r5,r8为甲氧基(-oc4h13)；r3,r4,r6,r7为h，m为1,n为1,结构式如下：
其二硫键连接单元在0.5mmtecp溶液中时，其半衰期为7685秒。
本发明进一步提供了所述荧光标记可剪切核苷酸的制备方法，所述方法具有如下合成路线：
包括如下具体步骤：
(1)以化合物a间甲基苯甲酸衍生物与n-溴代丁二酰亚胺为原料，发生溴代反应得到溴代产物化合物b；
(2)将所述溴代产物化合物b与硫脲进行反应，得到化合物c；
(3)所述化合物c通过氧化反应得到化合物d；
(4)所述化合物d与n-羟基丁二酰亚胺在缩合剂存在下反应生成单活化酯化合物d，再与单boc保护的烷氧基二胺化合物e反应得到化合物f；
(5)所述化合物f与n-羟基丁二酰亚胺在缩合剂存在的条件下下反应生成活化酯化合物g；
(6)所述化合物g与胺基烷基酸化合物h反应得到化合物i；
(7)所述化合物i脱去boc保护基团，再与荧光染料基团j发生缩合反应，得到荧光基团标记的衍生物化合物k；
(8)所述化合物k中与活化试剂反应生成荧光基团标记的衍生物活化酯,再与核苷酸衍生物化合物l发生缩合反应，即得目标产物tm。
上述制备方法中：
所述步骤(1)中：反应温度0～75℃，反应时间为1～8小时；反应溶剂为四氯化碳、三氯甲烷，四氢呋喃(thf)、苯或乙醚，优选为四氯化碳；反应中采用的自由基引发剂为过氧化环己酮、过氧化二苯甲酰、叔丁基过氧化氢、偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈，优选为偶氮二异丁腈。
所述步骤(2)中：反应温度0～25℃，反应时间为1～4小时；反应溶剂为乙腈、四氢呋喃(thf)、二氧六环、dmf或丙酮，优选为丙酮。
所述步骤(3)中：反应溶剂由dmso与水以0.05～5:1组成、优选以0.3:1组成；反应体系的ph值为2～10，优选为6～7。
所述步骤(4)中：反应温度0～25℃，反应时间为6～24小时；反应溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷，四氢呋喃(thf)、二氧六环或乙腈，优选为二氯甲烷；反应中采用的有机碱为三甲胺、三乙胺、三正丁胺或二异丙基乙基胺，优选为三乙胺。
所述步骤(5)中：反应溶剂为二氯甲烷、dmf，四氢呋喃(thf)、二氧六环或乙腈，优选为dmf。
所述步骤(6)中：反应中采用的有机碱为有机胺为三甲胺、三乙胺、三正丁胺或二异丙基乙基胺，优选为三乙胺。
所述步骤(7)中：反应溶剂为二氯甲烷、dmf，四氢呋喃(thf)、二氧六环或乙腈，优选为dmf；反应中采用的酸为盐酸、硫酸、甲磺酸、醋酸或三氟乙酸，优选为三氟乙酸；反应中采用的有机碱为三甲胺、三乙胺、三正丁胺或二异丙基乙基胺，优选为二异丙基乙基胺。
所述步骤(8)中：反应溶剂为dmso、dmf，四氢呋喃(thf)、二氧六环或乙腈，优选为dmf；反应采用的缩合剂为tstu(o-(n-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)、hbtu(苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯)、tbtu(2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)、hatu(o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯)或dsc(n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)，优选为tstu。
本发明进一步保护所述的荧光标记可剪切核苷酸在dna测序中的应用。在实际应用时，测序体系中所含有的本发明所述的荧光标记可剪切核苷酸，应至少同时包括碱基分别为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及胸腺嘧啶的核苷酸；为了确保测序的准确性，不同碱基的核苷酸所连接的荧光基团应互不相同且无信号干扰。
具体而言，本发明提供了一种采用本发明所述荧光标记可剪切核苷酸进行dna测序的方法，包括如下步骤：
1)将引物连接在修饰过的载玻片或者树脂上(与引物5，端连接)；
2)将目标dna片段与所述连接在载玻片或者树脂上的引物杂交，形成引物/目标dna片段杂交复合物；
3)将步骤2)所得的杂交复合物放入含有本发明所述的碱基分别为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及胸腺嘧啶且荧光基团各异的荧光标记可剪切核苷酸、dntp(包括dttp、dctp、datp以及dgtp，共四种)以及聚合酶的混合溶液中，通过聚合酶反应生长复合物当中的引物链，得生长引物/目标dna片段杂交复合物；
4)清洗步骤3)所得的生长引物/目标dna片段杂交复合物；
5)通过毛细管电泳和荧光引物链程序鉴定经步骤4)清洗后的生长引物/目标dna片段杂交复合物的序列；
6)将步骤5)所述生长引物/目标dna片段杂交复合物中未反应的dna片段和引物加帽；
7)清洗步骤6)所得的加帽的引物/目标dna片段杂交复合物；
8)将步骤7)所述的连接在载玻片或者树脂上的杂交复合物放入还原剂中反应，以除去复合物引物片段中的终止部分；
9)将步骤8)所得的杂交复合物放入覆盖剂中反应，以覆盖经步骤反应后杂交复合物上存在的巯基-sh；
10)清洗步骤8)所得的剪切的引物/目标dna片段杂交复合物；
11)重复步骤3)至步骤10)一次或多次，以鉴定目标dna片段中的多个碱基。
上述测序方法中：
所述步骤2)中引物和目标dna片段可同步为多个目标片段。
所述步骤3)中聚合酶为dna聚合酶、末端转移酶和逆转录酶的组合；荧光标记的核苷酸和非标记核苷酸的浓度比为1:1～50，优选为1:40。
所述步骤8)中采用的还原剂为巯基乙醇(b-me)，二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep)，优选为三(2-羧乙基)膦(tcep)；所述还原剂的浓度为0.01mm-100mm,优选为1mm。
所述步骤9)中覆盖剂为马来酰亚胺或其衍生物的溶液，优选为马来酰亚胺溶液。
本发明提供的方案具有如下有益效果：(1)本发明合成了一类新的二硫键连接单元，该连接单元可以通过调整邻近苯环上的取代基的种类和位置可以调控二硫键在还原剂作用下的断裂速度，而这种断裂的速度对dna测序至关重要，从而可以比较温和的条件下实现可逆终止，且该断裂的过程对测序本身没有干扰，所以本发明提供的这种荧光标记可剪切核苷酸可以高效的运用在二代和三代基因测序技术中；(2)本发明在二硫键连接基团的基础上合成了荧光标记的核苷酸(可逆终端)，这类可剪切的核苷酸用于dna测序中表现出优异的性能，具体表现在该类核苷酸在dna聚合酶的作用下参与dna链延伸反应的效率达到100％，而且一次只能延伸一个碱基，反应完成后在弱的还原剂条件下，断裂的效率也为100％，当荧光基团被剪切之后，残留的核苷酸片段可以在dna聚合酶的作用下可以继续参与dna链延伸反应；(3)本发明提供的这种荧光标记的可剪切的核苷酸(可逆终端)相比于光敏感和酸敏感的同类核苷酸对结构的依赖性大大降低，可以通过核苷酸连接基团的结构修饰或者还原剂的种类和浓度来调节剪切速率，对dna链本身不会造成任何影响，可以极大的提高测序效率和测序读长；(4)本发明提供的可剪切的荧光标记核苷酸的制备方法其原料简单易得，均为常规的化学反应，具有操作简便、对设备要求低、成本低，设备使用效率高等特点，达到大规模生产应用的要求。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下各实施例所用试剂未加特别说明均为市售分析纯，使用前未经特别纯化。
以下实施例1～8涉及的合成路线如下所示：
上述合成路线中的数字与各实施例的序号对应，终产物即实施例8所得产物化合物tm。
实施例1
取1360克间甲基苯甲酸和20l四氯化碳加入50l带有温度计和搅拌的玻璃反应釜。抽去反应釜中的空气，通入氮气，反应体系逐渐冷却至0℃，加入82.1克偶氮二异丁腈(0.05eq)，分批加入1858克n-溴代丁二酰亚胺(1.05eq,分四批加入，约2小时加完)，加完后反应体系升温至75℃，继续反应4h，观察发现有大量的固体生成从体系中沉淀出来并黏附在反应釜内壁上。取样检测，液相相色谱结果表明，间甲基苯甲酸的转化率大于99％，间溴甲基苯甲酸收率为78％。由反应釜下层放料口将放出反应体系，过滤，收集滤液,滤液用蒸馏水洗涤(10lx3)有机相干燥后浓缩，即得到1670克间溴甲基苯甲酸粗品，该粗品用正己烷重结晶得到1386克间溴甲基苯甲酸纯品收率64.7％，纯度98.2％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cdcl3,ppm)δ:4.62(s,2h),7.412-7.437(m,1h,j＝11.2),7.635-7.655(d,1h,j＝5.9),8.278-8.282(d,1h,j＝3.7),8.31(s,1h),12.45-12.48(b,1h,j＝12.3).
esi-ms(m/z):214,m+
实施例2
取1284克间溴甲基苯甲酸,15l丙酮加入入50l带有温度计和搅拌的玻璃反应釜。抽去反应釜中的空气，通入氮气，反应体系逐渐升温至25℃，热熔约1小时，体系中的固体溶解完全，缓慢分批加入479克硫脲(1.05eq)，体系逐渐变为红色，继续在25℃反应16h，取样检测，液相相色谱结果表明，间溴甲基苯甲酸的转化率大于99％，向上述体系之中缓慢加入氢氧化钠水溶液(720克氢氧化钠溶解在5l蒸馏水中)，体系逐渐变为黄色乳状液，滴加完毕后，继续反应2小时后体系变为浅黄色澄清液，然后用6m盐酸调节ph值为2，用二氯甲烷(15lx3)萃取，合并滤液，有机相干燥后浓缩，即得到978克间溴巯甲基苯甲酸粗品，该粗品用乙腈重结晶得到736克间溴巯甲基苯甲酸纯品收率73％，纯度97.8％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cdcl3,ppm)δ:3.73(s,2h),7.40-7.412(m,1h,j＝6.3),7.739-7.742(d,1h,j＝4.3),7.99(s,h),8.043-8.052(d,1h,j＝9.6),12.62-12.78(b,1h,j＝11.7).
esi-ei(m/z):168
实施例3
取672克间溴巯甲基苯甲酸,2l二甲基亚砜和3l蒸馏水加入10l带有温度计和搅拌的玻璃反应瓶，调节ph值为6～7，反应体系逐渐升温至25℃，并缓慢向体系内通入空气，继续在25℃反应4h，取样检测，液相相色谱结果表明，间溴巯甲基苯甲酸的转化率大于99％，向上述体系之中加入二氯甲烷(3lx3)萃取，合并滤液，有机相干燥后浓缩，即得到668克间溴巯甲基苯甲酸粗品，该粗品用乙醇重结晶得到574克间溴巯甲基苯甲酸纯品收率86％，纯度98.3％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cdcl3,ppm)δ:3.71(s,4h),7.39-7.403(m,2h,j＝4.7),7.732-7.738(d,2h,j＝3.9),7.96(s,2h),8.056-8.062(d,2h,j＝8.3),12.60-12.77(b,1h,j＝11.7).esi-ms(m-h):333,m-
实施例4
取574克间溴巯甲基苯甲酸(1.72mol,4eq)和97.4克环己基碳二亚胺(dcc,0.473mol,1.1eq)，2l无水二氯甲烷加入5l带有温度计和搅拌的玻璃反应瓶，搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，反应体系逐渐冷却至0℃，缓慢滴加加入n-羟基琥珀酰亚胺(49克，0.43mol,1eq溶解在500ml二氯甲烷中),控制温度不超过5℃，加入完毕后，反应体系逐渐回到室温，继续搅拌6小时，体系逐渐变浑浊，取样检测，液相相色谱结果表明，n-羟基琥珀酰亚胺的转化率大于99％，再往反应体系中加入单boc保护2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-1-胺)(107克，0.43mol,1eq溶解在500ml二氯甲烷中)滴加完毕后，继续反应2小时，反应体系逐渐冷却至-20℃，静置1小时，过滤，滤渣用二氯甲烷(500mlx2)洗涤，合并滤液，有机相干燥后浓缩，即得到间溴巯甲基苯甲酸和化合物e粗品的混合物，该混合物用柱层析纯化(200-300目硅胶，塔板数5，淋洗剂:二氯甲烷/甲醇50/1～10/1)回收间溴巯甲基苯甲酸394克，得到化合物e196克,收率81％，纯度97.4％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cdcl3,ppm)δ:1.44(s,9h),3.042-3.048(t,2h,j＝6.8),3.282-3.299(t,2h,j＝6.9),3.282-3.299(t,2h,j＝6.7),3.671-3.678(t,2h,j＝7.3),3.712-3.718(t,2h,j＝6.8),6.71-6.837(b,1h,j＝10.2),7.36-7.412(m,2h,j＝5.7),7.740-7.765(d,2h,j＝4.9),7.99(s,2h),8.058-8.065(d,2h,j＝8.6),8.716-8.827(b,1h,j＝11.2),12.60-12.77(b,1h,j＝11.7).
esi-ms(m-1):563,m-
实施例5
取5.64克化合物e(10mmol,1eq)和1.21克n-羟基琥珀酰亚胺(10.5mmol,1.05eq)100ml无水二氯甲烷加入250ml,带有温度计和搅拌的三口瓶中，搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，反应体系逐渐冷却至0℃，加入2.27克环己基碳二亚胺(dcc,11mmol,1.1eq),控制温度不超过5℃，加入完毕后，反应体系逐渐回到室温，继续搅拌6小时，体系逐渐变浑浊，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物e的转化率大于99％，反应体系逐渐冷却至-20℃，静置1小时，过滤，滤渣用二氯甲烷(20mlx2)洗涤，合并滤液，有机相干燥后浓缩，即得到化合物f粗品，该粗品不用进一步纯化，直接投入下一步。
实施例6
取实施例5所得化合物f粗品(10mmol,1eq按收率100％计算)和1.44克6-氨基己酸(10.5mmol,1.1eq)和100ml无水dmf加入250ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，反应体系逐渐冷却至0℃，加入2.02克三乙胺(11mmol,1.1eq)继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物f的转化率大于99％，减压去除dmf,即得到g粗品,该粗品用柱层析纯化(200-300目硅胶，塔板数6，淋洗剂:二氯甲烷/甲醇40/1～10/1)，得到化合物g4.13克,收率61％，纯度97.2％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cdcl3,ppm)δ:1.311～1.356(m,2h,j＝8.2),1.45(s,9h),1.538～1.577(m,4h,j＝7.7),2.203-2.211(t,2h,j＝9.3),3.042-3.048(t,2h,j＝6.8),3.258-3.299(m,6h,j＝11.9),3.672-3.677(t,2h,j＝5.6),3.714-3.721(t,2h,j＝7.1),6.721-6.838(b,1h,j＝10.3),7.37-7.414(m,2h,j＝9.7),7.741-7.760(d,4h,j＝6.9),7.82(s,2h),8.636-8.727(b,1h,j＝12.1),12.60-12.77(b,2h,j＝11.7).
esi-ms(m-1):676,m-
实施例7
取3.38g实施例6所得化合物g(5mmol,1eq)和25ml无水二氯甲烷加入50ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，通入氯化氢气体，继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物g的转化率大于99％，停止通入氯化氢气体，浓缩除去溶剂二氯甲烷，加入25ml无水二氯甲烷，充分搅拌，浓缩除去溶剂，反复此操作三次，以便彻底去除体系中残留的氯化氢，加入10ml无水dmf通入氩气保护，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，在氩气保护下加入dipea(1.29g,10mmol,2eq),继续搅拌30分钟，然后在氩气保护下加入5-rox-se(3.156g,5mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，5-rox-se的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的乙醚中,有大量红色固体生成，过滤，滤饼用乙醚(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物h粗品，该粗品用柱层析纯化(200-300目硅胶，塔板数8，淋洗剂:二氯甲烷/甲醇30/1～10/1)，得到化合物h2.24克,收率42％，纯度98.6％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:1.323～1.376(m,2h,j＝7.1),1.49(s,9h),1.557～1.583(m,4h,j＝3.7),1.923～1.949(m,4h,j＝7.3),2.091～2.119(m,4h,j＝7.5),2.213-2.221(t,2h,j＝9.3),2.661～2.692(m,4h,j＝8.1),3.066～3.098(m,6h,j＝8.3),3.263-3.296(m,6h,j＝7.5),3.491～3.569(m,8h,j＝12.3),3.678-3.723(m,4h,j＝9.7),6.601(s,2h),7.37-7.414(m,2h,j＝9.7),7.450～7.470(d,1h,j＝3.2),7.747-7.762(d,4h,j＝6.9),7.86(s,2h),8.382～8.406(m,1h,j＝5.3),8.874～8.878(d,1h,j＝2.6)
tof-ms(m+na):1116
实施例8
取1.093g实施例7所得化合物h(1mmol,1eq)和7ml无水dmf加入25ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，通入氩气保护，搅拌使固体充分溶解，在室温(25℃)下待固体充分溶解后，在氩气保护下分别加入tstu(o-(n-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)(0.337g,1.1mmol,1.1eq)dipea(0.142g,1.1mmol,1.1eq),继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物h的转化率大于99％，然后在氩气保护下加入化合物i(0.518g,1mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物i的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的异丙醇中,有大量红色固体生成，过滤，滤饼用异丙醇(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物tm粗品，该出品用制备液相(c18制备柱，uv-254nm监测)纯化得到化合物tm0.573克,收率36％，纯度99.1％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:1.323～1.376(m,2h,j＝7.1),1.49(s,9h),1.557～1.583(m,4h,j＝3.7),1.923～1.949(m,4h,j＝7.3),2.091～2.119(m,4h,j＝7.5),2.213-2.221(t,2h,j＝9.3),2.661～2.692(m,4h,j＝8.1),3.066～3.098(m,6h,j＝8.3),3.263-3.296(m,6h,j＝7.5),3.491～3.569(m,8h,j＝12.3),3.678-3.723(m,4h,j＝9.7),6.601(s,2h),7.37-7.414(m,2h,j＝9.7),7.450～7.470(d,1h,j＝3.2),7.747-7.762(d,4h,j＝6.9),7.86(s,2h),8.382～8.406(m,1h,j＝5.3),8.874～8.878(d,1h,j＝2.6)；
31p-nmr:(160mhz,cd3od,ppm)δ:-10.169(m,2h,j＝7.1),-21.660(m,1h,j＝5.4)
tof-ms(m+na):1616.4
以下实施例9～10涉及的合成路线如下所示：
实施例9
取3.38g实施例6所得化合物g(5mmol,1eq)和25ml无水二氯甲烷加入50ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，通入氯化氢气体，继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物g的转化率大于99％，停止通入氯化氢气体，浓缩除去溶剂二氯甲烷，加入25ml无水二氯甲烷，充分搅拌，浓缩除去溶剂，反复此操作三次，以便彻底去除体系中残留的氯化氢，加入10ml无水dmf通入氩气保护，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，在氩气保护下加入dipea(1.29g,10mmol,2eq),继续搅拌30分钟，然后在氩气保护下加入cy5-se(3.686g,5mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，cy5-se的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的乙醚中,有大量蓝色固体生成，过滤，滤饼用乙醚(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物j粗品，该粗品用柱层析纯化(200-300目硅胶，塔板数9，淋洗剂:二氯甲烷/甲醇25/1～10/1)，得到化合物j3.04克,收率35％，纯度97.8％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:1.242～1.281(m,5h,j＝7.1),1.301～1.384(m,8h,j＝10.3),1.492～1.547(m,8h,j＝9.3),1.690.(s,12h),2.134～2.213(m,6h,j＝11.5),3.240～3.282(m,6h,j＝8.7),3.523(t,4h,j＝7.2),3.672(t,2h,j＝7.7),3.713～3.776(m,4h,j＝8.5),3.823(s,4h),4.092～4.144(m,4h,j＝9.1),6.285～6.331(m,2h,j＝8.1),6.571～6.592(m,1h,j＝6.7),7.313～7.374(m,4h,j＝9.7),7.636～7.658(m,4hj＝9.2),7.811～7.858(m,6hj＝9.9),7.86(s,2h),8.331～8.396(m,2h,j＝10.3)
tof-ms(m+h):1216.44
实施例10
取1.215g实施例9所得化合物j(1mmol,1eq)和7ml无水dmf加入25ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，通入氩气保护，搅拌使固体充分溶解，在室温(25℃)下待固体充分溶解后，在氩气保护下分别加入tstu(o-(n-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)(0.337g,1.1mmol,1.1eq)dipea(0.142g,1.1mmol,1.1eq),继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物h的转化率大于99％，然后在氩气保护下加入化合物k(0.540g,1mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物k的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的异丙醇中,有大量蓝色固体生成，过滤，滤饼用异丙醇(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物tm-a粗品，该出品用制备液相(c18制备柱，uv-254nm监测)纯化得到化合物tm-a0.563克,收率32％，纯度99.1％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,d2o,ppm)δ:1.251(s,6h),1.284～1.323(m,8h,j＝9.3),1.413～1.442(b,9h,j＝10.5),1.541～1.547(m,2h,j＝7.1),1.613～1.619(m,2h,j＝6.9),2.116～2.133(b,5h,j＝11.8),2.358～2.366(m,1h,j＝8.7)3.241～3.286(m,6h,j＝7.9),3.521-3.529(t,4h,j＝5.2),3.652-3.673(m,4h,j＝7.7),3.713～3.720(t,2h,j＝6.5),3.823-3.851(m,5h,j＝8.3),4.031～4.072(m,3h,j＝9.1),4.218～4.286(m,2h,j＝7.1),4.401～4.408(m,1h,j＝7.3),5.951～5.958(m,1h,j＝6.3),6.255～6.331(m,2h,j＝8.1,),6.551～6.572(m,2h,j＝6.7),7.193(s,1h),7.331～7.374(m,7h,j＝6.8),7.491(s,1h),7.651～7.662(m,2hj＝9.2),7.812～7.856(m,4hj＝9.6),8.27(s,1h),8.951～8.962(m,2h,j＝6.4)
31p-nmr:(160mhz,cd3od,ppm)δ:-8.9(d,1h,j＝19.8),-10.6(d,1h,j＝19.8),-22.2(d,1h,j＝19.8)；
tof-ms(m+na):1760.4
以下实施例11～12涉及的合成路线如下所示：
实施例11
取3.38g实施例6所得化合物g(5mmol,1eq)和25ml无水二氯甲烷加入50ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，通入氯化氢气体，继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物g的转化率大于99％，停止通入氯化氢气体，浓缩除去溶剂二氯甲烷，加入25ml无水二氯甲烷，充分搅拌，浓缩除去溶剂，反复此操作三次，以便彻底去除体系中残留的氯化氢，加入10ml无水dmf通入氩气保护，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，在氩气保护下加入dipea(1.29g,10mmol,2eq),继续搅拌30分钟，然后在氩气保护下加入bodipy-se(1.796g,5mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，bodipy-se的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的乙醚中,有大量固体生成，过滤，滤饼用乙醚(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物l粗品，该粗品用柱层析纯化(200-300目硅胶，塔板数8，淋洗剂:二氯甲烷/甲醇30/1～15/1)，得到化合物l1.63克,收率39％，纯度97.3％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:1.331～1.342(m,2h,j＝7.6),1.541～1.546(m,4h,j＝5.1),2.071～2.123(m,2h,j＝7.8),2.207～2.213(d,2h,j＝6.7),3.240～3.282(m,6h,j＝8.4),3.521-3.528(t,4h,j＝7.7),3.672～3.713(m,4h,j＝8.3),3.823～3.877(m,6h,j＝7.1),5.711～5.718(d,1h,j＝6.3),6.021～6.029(m,1h,j＝7.2),6.633～6.638(d,1h,j＝6.3),7.368～7.374(m,3h,j＝9.2),7.492(s,1h),7.652～7.658(m,2hj＝8.1),7.811～7.858(m,4hj＝8.5),
tof-ms(m+na):860.3
实施例12
取0.838g实施例11所得化合物l(1mmol,1eq)和7ml无水dmf加入25ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，通入氩气保护，搅拌使固体充分溶解，在室温(25℃)下待固体充分溶解后，在氩气保护下分别加入tstu(o-(n-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)(0.337g,1.1mmol,1.1eq)dipea(0.142g,1.1mmol,1.1eq),继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物h的转化率大于99％，然后在氩气保护下加入化合物m(0.517g,1mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物i的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的异丙醇中,有大量固体生成，过滤，滤饼用异丙醇(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物tm-c粗品，该出品用制备液相(c18制备柱，uv-254nm监测)纯化得到化合物tm-c0.494克,收率37％，纯度98.7％。
所得产物的表征信息如下：
1h-nmr:(400mhz,d2o,ppm)δ:1.328～1.341(m,2h,j＝7.8),1.542～1.549(m,4h,j＝5.3),2.073～2.125(m,3h,j＝7.9),2.209～2.214(d,2h,j＝6.9),2.351～2.359(m,3h,j＝7.2),3.243～3.285(m,6h,j＝8.7),3.521-3.528(t,4h,j＝7.7),3.672～3.713(m,4h,j＝8.3),3.821～3.878(m,7h,j＝7.3),3.972(s,2h),4.031～4.038(m,1h,j＝6.3),4.296～4.401(m,2h,j＝12.3),5.712～5.719(d,1h,j＝6.4),6.023～6.031(m,1h,j＝7.5),6.632～6.639(d,1h,j＝6.8),7.369～7.378(m,3h,j＝9.5),7.495(s,1h),7.653～7.660(m,2hj＝8.1),7.812～7.859(m,4hj＝8.5),8.702(s,1h)
31p-nmr:(160mhz,cd3od,ppm)δ:-9.1(d,1h,j＝18.7),-10.8(d,1h,j＝18.7),-22.4(d,1h,j＝18.7)；
tof-ms(m+na):1359.3
以下实施例13～14所涉及的合成路线如下所示：
实施例13
取3.38g实施例6所得化合物g(5mmol,1eq)和25ml无水二氯甲烷加入50ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，通入氯化氢气体，继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物g的转化率大于99％，停止通入氯化氢气体，浓缩除去溶剂二氯甲烷，加入25ml无水二氯甲烷，充分搅拌，浓缩除去溶剂，反复此操作三次，以便彻底去除体系中残留的氯化氢，加入10ml无水dmf通入氩气保护，在室温(25℃)下搅拌使固体充分溶解，待固体充分溶解后，在氩气保护下加入dipea(1.29g,10mmol,2eq),继续搅拌30分钟，然后在氩气保护下加入5-rox-se(3.156g,5mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，5-rox-se的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的乙醚中,有大量红色固体生成，过滤，滤饼用乙醚(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物h粗品，该粗品用柱层析纯化(200-300目硅胶，塔板数8，淋洗剂:二氯甲烷/甲醇30/1～10/1)，得到化合物n2.24克,收率42％，纯度98.6％。
所得产物的表征信息如下所示：
1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:1.243～1.286(m,5h,j＝7.3),1.308～1.386(m,8h,j＝11.7),1.491～1.546(m,8h,j＝9.4),1.695.(s,12h),2.131～2.215(m,6h,j＝11.7),3.243～3.286(m,6h,j＝8.9),3.527～3.537(t,4h,j＝7.3),3.678～3.691(t,2h,j＝7.6),3.711～3.772(m,4h,j＝10.5),3.828(s,4h),4.095～4.148(m,4h,j＝9.2),5.213～5.331(m,2h,j＝10.2),6.512～6.556(m,5h,j＝7.8),7.312～7.370(m,4h,j＝8.9),7.632～7.653(m,4hj＝9.2),7.812～7.857(m,6hj＝9.6),7.873(s,2h),8.329～8.397(m,2h,j＝10.5)
tof-ms(m+na):1264.5
实施例14
取1.093g实施例13所得化合物n(1mmol,1eq)和7ml无水dmf加入25ml带有温度计和搅拌的三口瓶中，通入氩气保护，搅拌使固体充分溶解，在室温(25℃)下待固体充分溶解后，在氩气保护下分别加入tstu(o-(n-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)(0.337g,1.1mmol,1.1eq)dipea(0.142g,1.1mmol,1.1eq),继续反应2小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物h的转化率大于99％，然后在氩气保护下加入化合物i(0.518g,1mmol,1eq)继续反应1小时，取样检测，液相相色谱结果表明，化合物i的转化率大于99％，将反应体系逐渐加入250ml事先预冷至0℃的异丙醇中,有大量红色固体生成，过滤，滤饼用异丙醇(25mlx2)洗涤，干燥，即得到化合物tm-g粗品，该出品用制备液相(c18制备柱，uv-254nm监测)纯化得到化合物tm-g0.573克,收率36％，纯度99.1％。
所得产物的表征信息如下所示：
1h-nmr:(400mhz,d2o,ppm)δ:1.259～1.268(m,5h,j＝6.7),1.327～1.383(m,8h,j＝77),1.483～1.524(m,8h,j＝8.3),1.713.(s,12h),2.124～2.215(m,7h,j＝10.3),2.357～2.364(m,1h,j＝8.3),3.258～3.297(m,6h,j＝8.9),3.538～3.549(t,4h,j＝7.2),3.687～3.701(t,2h,j＝7.5),3.726～3.786(m,4h,j＝10.7),3.838～3.856(m,5h,j＝6.5),3.978(s,2h),4.085～4.136(m,5h,j＝7.9),4.273～4.286(m,1h,j＝7.3),4.403～4.416(m,1h,j＝7.8),5.232～5.441(m,2h,j＝10.1),5.951～5.963(m,1h,j＝9.7),6.523～6.564(m,5h,j＝7.5),7.327～7.436(m,5h,j＝9.8),7.651～7.675(m,4hj＝8.1),7.832～7.869(m,6hj＝9.4),7.896(s,2h),8.332～8.412(m,2h,j＝11.7)
31p-nmr:(160mhz,cd3od,ppm)δ:-10.238(m,2h,j＝7.2),-21.637(m,1h,j＝5.5)
tof-ms(m+na):1802.5
实施例15
本实施例对二硫键连接单元的断裂速率进行研究。
三(2-羧乙基)膦(tcep)溶液的配制：0.29克三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶解在1000毫升去离子水中，得到1mm三(2-羧乙基)膦(tcep)溶液,三(2-羧乙基)膦(tcep)性质稳定，但最好现用现制。
样品的配制：各连接单元样品溶解在适量的dmf中,配制成100mm的溶液备用。
断裂速率研究：取10ul连接单元样品溶液，加入990ul新配制的1mm三(2-羧乙基)膦(tcep)溶液中，在振荡器上振荡2-3秒，静置2-3秒，断裂是样品的浓度为1mm。
本发明所述的一种荧光标记可剪切核苷酸中的s-s连接单元，其结构是如下式所示：
当所述r1～r8均为h，m为1,n为1,结构式如下，其二硫键连接单元在1mmtecp溶液中时，其半衰期为4秒。
当r1、r2、r5、r8为甲氧基(-och3)；r3、r4、r6、r7为h，m为1,n为1,结构式如下，其二硫键连接单元在1mmtecp溶液中时，其半衰期为39秒。
当r1、r2为丁氧基(-oc4h13)，r5、r8为甲氧基(-och3)；r3、r4、r6、r7为h，m为1,n为1,结构式如下，其二硫键连接单元在1mmtecp溶液中时，其半衰期为190秒。
当r1、r2、r5、r8为甲氧基(-oc4h13)；r3、r4、r6、r7为h，m为1,n为1,结构式如下，其二硫键连接单元在1mmtecp溶液中时，其半衰期为300秒。
实施例16
本实施例对荧光标记可剪切核苷酸用于测序的可行性进行验证研究。
验证基因序列(pcr扩增至>10000拷贝/ul)：
序列1、人类cyp2c19基因序列片段rs4986893(代表常规基因):
aacatcaggattgtaagcaccccctg[a/g]atccaggtaaggccaagttttttgc；
该序列的测序引物为:
正向引物：ccagagcttggcatattgtatct
反向引物：tcttggtgttcttttactttctc
序列2、人类adrb1基因序列片段rs1801253(代表高gc序列，gc％>70％):
ccccgacttccgcaaggccttccag[c/g]gactgctctgctgcgcgcgcagggc
该序列的测序引物为:
正向引物：cttcaaccccatcatctactgc
反向引物：gtcgtcgtcgtcgtccgaggc
序列3、人y染色体串联重复序列(str)dys622：[gaaa]6agaag[gaaa]n
该序列的测序引物为:
正向引物：gcctcggtgataagagtg
反向引物:tgtatgtcccagaaatgt
测序采用的四种不同碱基的荧光标记可剪切核苷酸分别为实施例8、实施例10、实施例12以及实施例14提供的核苷酸；且上述四个实施例提供的四种核苷酸带有四种不同的荧光基团，各荧光基团彼此之间的荧光谱不互相干扰。
简易测序设备：普通pcr仪+基因芯片阅读仪
验证程序：制备测序芯片(将引物连接到修饰过的玻片上)，每种引物重复500次；按前述程序进行200次循环，每次延伸后用基因芯片阅读仪读取测序图；记录测序数据；同ncbi数据库中的序列数据相比对。
验证结果：三种目标基因序列片段总计得到1500个read，每个read读长170-200，共计27万bp数据，经比对测序错误16个，均为漏检错误，错误率<0.001％。本次试验证明本发明提供的可剪切核苷酸可用于测序目的。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。