本发明涉及天然产物的分离纯化领域，具体涉及一种锦葵素-3-o-半乳糖苷的分离纯化方法及其应用。
背景技术
糖尿病是世界范围内常见的慢性疾病之一，糖尿病患者通常伴随着高血糖症状，长期的高血糖能够引起神经、心脏、血管和肾脏等组织器官的损害，并引起多种急慢性并发症的发生。据世界卫生组织(who)统计数据显示，2014年全球有4.22亿的糖尿病患者，其中2型糖尿病最为常见。近年来随着人们饮食习惯、生活方式的改变及老龄化进程的加速，我国糖尿病的患病率急速上升，至2016年底我国的糖尿病患者数量已达到1.1亿。因此，有关糖尿病防治的研究有着极为重要的意义。
α-葡萄糖苷酶(alpha-d-glucosideglucohydrolase,ec3.2.1.20)又称为α-d-葡萄糖苷酶水解酶，是糖苷水解酶gh31家族中的膜结合酶，包括蔗糖酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶等，主要存在于小肠绒毛粘膜刷状缘细胞中。进食后，α-葡萄糖苷酶可以将食物中的碳水化合物水解为葡萄糖，葡萄糖被吸收后进入血液循环导致血糖升高，因此，α-葡萄糖苷酶是控制餐后血糖的主要靶酶之一。目前，国内上市的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，使用这些抑制剂通常会引起胃肠道的不良反应，如腹胀、排气等。因此，挖掘安全有效的食品功能因子，靶向抑制α-葡萄糖苷酶活性，对于降低糖尿病的发病率及改善糖尿病患者的健康状况将是一个行之有效的策略。当前国内外大量的研究人员已聚焦于食源性功能因子，试图从食物中筛选出活性优良且不会对人体造成副反应的α-葡萄糖苷酶抑制剂。目前，已有报道，食源性来源的黄酮类化合物、生物碱、酚类化合物、姜黄素类化合物、萜类化合物在体外具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且活性优于阳性药物阿卡波糖，但有关花色苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究报道不多，目前已发现矢车菊素-3-o葡萄糖苷具有α-葡萄糖苷酶活性。
蓝莓，又称越橘、蓝浆果，属杜鹃花科，越橘属植物，不仅富含人体所需的基础营养成分，而且还富含多种不同种类的花色苷，具有活化视网膜、降血糖、抗炎和抗肿瘤作用。我国的蓝莓栽培起步较晚，目前主要以直接鲜食消费为主，或加工成果酱、果汁、果酒等初级产品，有关高附加值的蓝莓产品在国内外市场上却寥寥无几。
因此，探索一种从蓝莓中分离制备高纯度花色苷单体的方法对蓝莓的深入研究及应用具有重大的意义。但由于花色苷类化合物结构相似，极性差异较小，导致高纯度花色苷单体的分离纯化极其困难。但目前，已经有报道分离纯化得到高纯度花色苷单体。
如公开号为cn106366141a的中国专利文献公开了一种分离制备天竺葵素-3-o-葡萄糖苷单体的方法，以草莓为原料，通过冷冻干燥、醇提浓缩、分级萃取、ab-8大孔树脂纯化制备得到。又如公开号为cn106831911a的中国专利文献公开了一种从蓬蘽中分离纯化天竺葵素-3-o-葡萄糖苷单体的方法，包括醇提浓缩、乙酸乙酯萃取、ab-8大孔树脂及高速逆流色谱。上述技术方案中虽然均制备得到了高纯度的花色苷单体，但主要原因在于草莓和蓬蘽中花色苷组成简单，仅含矢车菊素-3-o-葡萄糖苷、天竺葵素-3-o-葡萄糖苷和天竺葵素-3-o-芸香糖苷的3种花色苷化合物，其中天竺葵素-3-o-葡萄糖苷占总花色苷含量的80％以上。
但对于如蓝莓(含有至少12种结构相似的花色苷化合物)等花色苷组成复杂的原料，上述的技术方案则难以实现高纯度花色苷单体的纯化与制备。目前，通过单一的柱层析或色谱技术制备得到的高纯度花色苷均为花色苷混合物，而非高纯度花色苷单体。
如公开号为cn106905391a的中国专利文献中公开了一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法，将蓝莓榨汁与提取剂混合，在常温、压力为100～160mpa的条件下均质提取1～4次，过滤、合并滤液，得到蓝莓花色苷粗提物，再经hpd600大孔树脂进行分离纯化。该技术方案以ph＝1～2的80％乙醇溶液为提取剂，利用高压将蓝莓功效成分从生物细胞中释放，解决了蓝莓有效成分在保持高提取率的前提下，有效成分不被高温破坏的问题，但获得的提取物为花色苷混合物，而花色苷的含量仅为46.45％。
又如公开号为cn104109403a的中国专利文献中公开了一种野生蓝莓花青素提取、纯化新方法，制备工艺包括：生物酶解、微波回流提取、收集、粗过滤、微孔过滤、超滤、真空冷冻干燥、分相、高速逆流色谱纯化。该技术方案采用非热力高效提取分离技术，提高了萃取速度，但提取、纯化工艺过于复杂，难以实现大规模的工业化生产，且获得的提取物仍为花色苷混合物，花色苷的纯度最高仅为42.7％。
郭丹妮等(“葡聚糖凝胶色谱结合高速逆流色谱提取蓝莓中花青素”,郭丹妮,向灿辉,陈阳et.al,食品工业,2016年第2期)试验结合葡聚糖凝胶色谱及高速逆流色谱对野生蓝莓中的花青素进行了分离纯化，蓝莓粗提物先经过葡聚糖凝胶色谱初步分离，得到花青素含量高的组份，再经高速逆流色谱分离，以mtbe-正丁醇-乙腈-水(体积比1︰3︰1︰5)为两相溶剂体系，流速0.5ml/min、主机转速1860r/min以及检测波长280nm的条件下进行分离，从蓝莓的葡聚糖凝胶色谱柱分离产物中一次性分离得到两种花青素，纯度分别为65.0％和90.0％。该技术方案虽然公开其分离得到两种花青素，但从其图2的uplc分析色谱图中，仅可推断样品1和样品2可能是花青素，而无法确认无误的得出两种样品即为花青素的结论，更无法进一步确认两种样品的化学成分。
锦葵素-3-o-半乳糖苷，结构式如下，是蓝莓中主要的花色苷之一，也是蓝莓花色苷发挥生物活性的重要组成成分。
但目前还未发现从蓝莓中分离制备锦葵素-3-o-半乳糖苷单体的研究和报道，也未有该锦葵素-3-o-半乳糖苷单体在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
技术实现要素：
本发明为解决上述技术问题，提供了一种锦葵素-3-o-半乳糖苷的分离纯化方法，将液相色谱纯化与高速逆流色谱分离技术相结合，再通过对工艺参数的优化，从花色苷组成复杂的蓝莓原料中分离制备得到高纯度的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体；经活性试验发现，该锦葵素-3-o-半乳糖苷单体能够显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。
具体技术方案如下：
一种锦葵素-3-o-半乳糖苷的分离纯化方法，包括：
(1)醇提浓缩：以蓝莓为原料，经醇提浓缩得到蓝莓花色苷粗提液；
(2)大孔树脂吸附：将所述蓝莓花色苷粗提液注入大孔树脂，经洗脱及后处理得到蓝莓花色苷提取物冻干粉；
(3)制备液相色谱纯化：采用c18色谱柱，经流动相进行梯度洗脱，再经后处理得到锦葵素-3-o-半乳糖苷粗品冻干粉；
所述流动相：a相为纯甲醇或酸的体积百分浓度为0.1～1.5％的酸-甲醇体系，b相为甲酸体积百分浓度为1.5～5％的甲酸-水体系；
所述梯度洗脱的程序为：a相的体积百分浓度在0～5min内保持5％不变，在5～30min内从5％上升至60％，收集21～22min的洗脱物；
(4)高速逆流色谱分离：以正丁醇-甲基叔丁基醚-甲醇-水-三氟乙酸为两相溶剂体系，经分离得到锦葵素-3-o-半乳糖苷单体；
所述正丁醇、甲基叔丁基醚、甲醇、水和三氟乙酸的体积比为2：2：1：5：0.01～0.1。
如无特别说明，本发明中出现的所有原料的百分比均为体积百分浓度。
本发明中出现的各种溶液，如无特别说明，均以水作为溶剂。
步骤(1)中，所述醇提浓缩，具体为：
将洗净的蓝莓与酸性乙醇溶液混合，超声提取完全后过滤并收集滤液，滤液在40～50℃下真空旋转蒸发除去乙醇并浓缩，得到蓝莓花色苷粗提液；
所述酸性乙醇溶液为酸的体积百分浓度为0.1～1.5％的乙醇溶液；
所述酸选自盐酸、甲酸、乙酸、草酸中的至少一种；
所述乙醇溶液的体积百分浓度为50～95％；
所述蓝莓与酸性乙醇溶液的质量体积比(即料液比)为1：5～12g/ml。
优选地，所述超声提取时间为60～240min，该过程在25～49℃下、避光条件下进行。
为保证花色苷提取完全，将首次提取后得到的滤渣再按照相同条件重复提取若干次。
进一步优选，所述乙醇溶液的体积百分浓度为60～70％，蓝莓与酸性乙醇的质量体积比为1：5～8g/ml。
步骤(2)中，所述大孔树脂吸附，具体为：
将所述蓝莓花色苷提取液注入大孔树脂中，先用去离子水冲洗大孔树脂，再用体积百分浓度为2～22％的酸性醇溶液进行梯度洗脱，收集体积百分浓度为14～18％的酸性醇溶液的洗脱液，40～50℃下真空旋转蒸发除醇后，真空冷冻干燥得到蓝莓花色苷提取物冻干粉；
优选地，所述大孔树脂的牌号选自ab-8、hpd-100、d101或dm-130；
优选地，所述酸性醇溶液选自酸的体积百分浓度为0.1～1.5％的醇溶液；
醇溶液选自甲醇溶液或乙醇溶液，体积百分浓度为2～22％；
酸选自盐酸、甲酸、乙酸中的至少一种。
进一步优选，分别采用含0.5％(v/v，下同)盐酸的2％、6％、10％、14％、18％、22％的乙醇溶液以2倍柱体积(2bv)进行梯度洗脱，收集体积百分浓度为14～18％的0.5％盐酸-乙醇溶液的洗脱液。
本发明中，所述的酸性醇溶液，以含0.5％盐酸的2％的乙醇溶液为例，乙醇溶液的体积百分浓度为2％，而盐酸与乙醇溶液的体积比为0.5：99.5。
步骤(3)中，先将所述蓝莓花色苷提取物冻干粉经去离子水复溶后，再注入制备液相色谱仪中进行纯化；纯化后，所述的后处理包括减压浓缩和真空冷冻干燥。
优选地：
所述复溶后的浓度为20～120mg/ml，进样量为1～4ml；
所述c18色谱柱的规格为20mm×250mm，温度为30℃；
所述a相中的酸选自甲酸或三氟乙酸。
进一步优选：
所述复溶后的浓度为50～120mg/ml，进样量为3～4ml；
所述流动相：a相为纯甲醇，b相为甲酸体积百分浓度为1.5～5％的甲酸-水体系，流动相的流速为5～10ml/min。
步骤(4)中，所述高速逆流色谱分离，具体为：
配制所述两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，以20～30ml/min的流速将所述固定相泵入高速逆流色谱仪中，在25～35℃、主机转速为700～1000r/min的条件下，以1～8ml/min的流速泵入所述流动相，待两相达到平衡后，将所述锦葵素-3-o-半乳糖苷粗品冻干粉用流动相溶解后进样，经液相检测后，收集仅包含目标产物的流出液，再经减压浓缩、冷冻干燥后得到锦葵素-3-o-半乳糖苷单体。
优选地，所述锦葵素-3-o-半乳糖苷粗品冻干粉用流动相溶解后的浓度为10～30mg/ml；
所述检测的波长为280nm。
进一步优选，所述两相溶剂系统中，正丁醇-甲基叔丁基醚-甲醇-水-三氟乙酸的体积比为2：2：1：5：0.01；
以20～30ml/min的流速将所述固定相泵入高速逆流色谱仪中，在25～35℃、主机转速为850～910r/min的条件下，以3～4ml/min的流速泵入所述流动相；
所述锦葵素-3-o-半乳糖苷粗品冻干粉用流动相溶解后的浓度为13～27mg/ml。
经上述制备工艺优化后，分离纯化得到的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体的纯度高达99％。
经进一步的活性试验发现，分离纯化得到的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果，ic50值为0.14mm，明显优于阳性药物阿卡波糖(ic50＝0.52mm)，可作为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于控制餐后血糖。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次将制备液相色谱和高速逆流色谱技术结合，并通过对工艺参数的优化，从蓝莓中分离得到高纯度的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体，其纯度可高达99％。该分离方法具有样品处理量大、重复性好等优点，可大量制备得到高纯度的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体，使之能够实现工业化生产；经进一步活性试验发现，该锦葵素-3-o-半乳糖苷单体能够显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。
附图说明
图1为实施例1中蓝莓花色苷提取物冻干粉的高效液相色谱图；
图2为实施例1中蓝莓花色苷提取物冻干粉经制备液相色谱纯化后的高效液相色谱图；
图3为实施例1中最终产物的高效液相色谱图；
图4为实施例1分离纯化的锦葵素-3-o-半乳糖苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线(a)，并给出阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线(b)作为对比；
图5为对比例2中最终产物的高效液相色谱图；
图6为对比例5中最终产物的高效液相色谱图；
图7为对比例6中最终产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
将1kg新鲜蓝莓洗净，按照料液比1：8(w/v，g/ml)的比例加入含0.1％(v/v)盐酸的70％的乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为70：30)充分混合，超声提取90min，(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后真空抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液。
将ab-8大孔树脂用乙醇浸泡24h后装入层析柱中，用纯水洗至无醇味后，使用0.5m的氢氧化钠溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水洗至流出液为中性；之后使用0.5m的盐酸溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水冲洗至中性。将花色苷粗提液以0.4bv/h的流速注入ab-8大孔树脂中，直至吸附体积达到树脂总体积的1/3。先用去离子水以2bv/h的流速冲洗树脂，然后分别用含0.5％(v/v)盐酸的2％，6％，10％，14％，18％，22％的乙醇水溶液以2bv/h的流速冲洗2h，并收集14％～18％％洗脱部分。在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓝莓花色苷提取物冻干粉。
使用制备液相柱unitaryc1820mm×250mm，流动相为：a相：纯甲醇，b相：甲酸(5％)：水(95％)；柱温为30℃，流速为10ml/min，梯度为：5％的a相0～5min，5％～60％a相5～30min。将花色苷提取物冻干粉用去离子水溶解，使其浓度达到50mg/ml，注入制备液相中分离，单次进样量为4ml。在紫外检测器下检测，收集21～22min的峰并减压浓缩除去甲醇，冷冻干燥，即可得到锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉。
将正丁醇：甲基叔丁基醚：甲醇：水：三氟乙酸按2：2：1：5：0.01的体积比置于分液漏斗中，充分摇匀，静置30min后，将上下相分开，超声脱气30min。将上相作为固定相，下相作为流动相。将高速逆流色谱仪启动预热30min后，循环水浴设置为30℃，将固定相以30ml/min的流速泵入仪器，然后正接正转，启动仪器，使主机转速至850r/min。转速稳定后，以3ml/min的流速泵入流动相，两相在管路中达到平衡后，将200mg锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉溶于15ml流动相中，进样并在紫外检测器下检测，收集目标峰组分并减压浓缩除去有机相，冻干即得到13.8mg的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体，纯度为98.92％。
通过对比图1～3的高效液相色谱图可知，蓝莓经过提取浓缩、大孔树脂梯度洗脱后，得到的蓝莓花色苷冻干粉主要是含有9个花色苷单体的混合物，进一步经过制备液相色谱纯化，收集21～22min的洗脱物，可以得到含有锦葵素-3-o-半乳糖苷和其他3个花色苷的混合物，最后通过高速逆流色谱分离，即可得到仅含锦葵素-3-o-半乳糖苷的单体花色苷，纯度高达98.92％。
实施例2
将5kg新鲜蓝莓洗净，按照料液比1：7(w/v)的比例加入含0.5％(v/v)盐酸的70％的乙醇水溶液充分混合，超声提取150min，(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后真空抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液。
将ab-8大孔树脂用乙醇浸泡24h后装入层析柱中，用纯水洗至无醇味后，使用0.5m的氢氧化钠溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水洗至流出液为中性；之后使用0.5m的盐酸溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水冲洗至中性。将花色苷粗提液以0.4bv/h的流速注入ab-8大孔树脂中，直至吸附体积达到树脂总体积的1/3。先用去离子水以2bv/h的流速冲洗树脂，然后分别用含0.5％(v/v)盐酸的2％，6％，10％，14％，18％，22％的乙醇水溶液以2bv/h的流速冲洗2h，并收集14％-18％％洗脱部分。在50℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓝莓花色苷提取物冻干粉。
使用制备液相柱unitaryc1820mm×250mm，流动相为：a相：纯甲醇，b相：甲酸(4％)：水；柱温为30℃，流速为10ml/min，梯度为：5％的a相0～5min，5％～60％a相5～30min。将花色苷提取物冻干粉用去离子水溶解，使其浓度达到80mg/ml，注入制备液相中分离，单次进样量为4ml。在紫外检测器下检测，收集21～22min的峰并减压浓缩，冷冻干燥，即可得到锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉。
将正丁醇：甲基叔丁基醚：甲醇：水：三氟乙酸按2：2：1：5：0.01的体积比置于分液漏斗中，充分摇匀，静置30min后，将上下相分开，超声脱气30min。将上相作为固定相，下相作为流动相。将高速逆流色谱仪启动预热30min后，循环水浴设置为25℃，将固定相以30ml/min的流速泵入仪器，然后正接正转，启动仪器，使主机转速至900r/min。转速稳定后，以3ml/min的流速泵入流动相，两相在管路中达到平衡后，将300mg锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉溶于15ml流动相中，进样并在紫外检测器下检测，收集目标峰组分并减压浓缩，冻干即得到66.3mg锦葵素-3-o-半乳糖苷，纯度为98.49％。
实施例3
将10kg新鲜蓝莓洗净，按照料液比1：5(w/v)的比例加入含0.1％(v/v)盐酸的60％的乙醇水溶液充分混合，超声提取200min，(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后真空抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液。
将ab-8大孔树脂用乙醇浸泡24h后装入层析柱中，用纯水洗至无醇味后，使用0.5m的氢氧化钠溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水洗至流出液为中性；之后使用0.5m的盐酸溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水冲洗至中性。将花色苷粗提液以0.4bv/h的流速注入ab-8大孔树脂中，直至吸附体积达到树脂总体积的1/3。先用去离子水以2bv/h的流速冲洗树脂，然后分别用含0.5％(v/v)盐酸的2％，6％，10％，14％，18％，22％的乙醇水溶液以2bv/h的流速冲洗2h，并收集14％～18％％洗脱部分。在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓝莓花色苷提取物冻干粉。
使用制备液相柱unitaryc1820mm×250mm，流动相为：a相：纯甲醇，b相：甲酸(1.5％)：水；柱温为30℃，流速为10ml/min，梯度为：5％的a相0～5min，5％～60％a相5～30min。将花色苷提取物冻干粉用去离子水溶解，使其浓度达到120mg/ml，注入制备液相中分离，单次进样量为4ml。在紫外检测器下检测，收集21～22min的峰并减压浓缩，冷冻干燥，即可得到锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉。
将正丁醇：甲基叔丁基醚：甲醇：水：三氟乙酸按2：2：1：5：0.01的体积比置于分液漏斗中，充分摇匀，静置30min后，将上下相分开，超声脱气30min。将上相作为固定相，下相作为流动相。将高速逆流色谱仪启动预热30min后，循环水浴设置为35℃，将固定相以30ml/min的流速泵入仪器，然后正接正转，启动仪器，使主机转速至910r/min。转速稳定后，以4ml/min的流速泵入流动相，两相在管路中达到平衡后，将400mg锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉溶于15ml流动相中，进样并在紫外检测器下检测，收集目标峰组分并减压浓缩，冻干即得到130mg锦葵素-3-o-半乳糖苷，纯度为98.08％。
对比例1
将10kg新鲜蓝莓洗净，按照料液比1：7(w/v)的比例加入含0.1％(v/v)盐酸的60％的乙醇水溶液充分混合，超声提取200min，(控制温度在45℃以下，避光)，超声结束后真空抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液。
将ab-8大孔树脂用乙醇浸泡24h后装入层析柱中，用纯水洗至无醇味后，使用0.5m的氢氧化钠溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水洗至流出液为中性；之后使用0.5m的盐酸溶液以2bv/h的流速冲洗1h，然后用去离子水冲洗至中性。将花色苷粗提液以0.4bv/h的流速注入ab-8大孔树脂中，直至吸附体积达到树脂总体积的1/3。先用去离子水以2bv/h的流速冲洗树脂，然后分别用含0.5％(v/v)盐酸的2％，6％，10％，14％，18％，22％的乙醇水溶液以2bv/h的流速冲洗2h，并收集14％-18％％洗脱部分。在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏，将所述浸膏用少量的去离子水溶解，之后冷冻干燥得到蓝莓花色苷提取物冻干粉。
使用制备液相柱unitaryc1820mm×250mm，流动相为：a相：纯甲醇，b相：甲酸(0.1％)：水；柱温为30℃，流速为10ml/min，梯度为：5％的a相0～5min，5％～60％a相5～30min。将花色苷提取物冻干粉用去离子水溶解，使其浓度达到120mg/ml，注入制备液相中分离，单次进样量为3ml。在紫外检测器下检测，收集21～22min的峰并减压浓缩，冷冻干燥，即可得到锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉。
将正丁醇：甲基叔丁基醚：甲醇：水：三氟乙酸按2：2：1：5：0.1的体积比置于分液漏斗中，充分摇匀，静置30min后，将上下相分开，超声脱气30min。将上相作为固定相，下相作为流动相。将高速逆流色谱仪启动预热30min后，循环水浴设置为35℃，将固定相以30ml/min的流速泵入仪器，然后正接正转，启动仪器，使主机转速至910r/min。转速稳定后，以4ml/min的流速泵入流动相，两相在管路中达到平衡后，将400mg锦葵素-3-o-半乳糖苷粗提物冻干粉溶于15ml流动相中，进样并在紫外检测器下检测，收集目标峰组分并减压浓缩，冻干即得到162mg锦葵素-3-o-半乳糖苷，纯度为88.13％。
对比例2
对比于实施例1，去掉制备液相色谱纯化的步骤，其他步骤不变，经测试，只能得到含有锦葵素-3-o-半乳糖苷的混合物，无法得到锦葵素-3-o-半乳糖苷单体，最终产物的高效液相色谱图如图5所示。
对比例3
制备工艺与实施例1的相同，区别仅在于将高速逆流色谱分离的溶剂体系替换为：正丁醇：甲基叔丁基醚：甲醇：水：三氟乙酸按1：3：1：5：0.01的体积比混合。经测试，无法得到锦葵素-3-o-半乳糖苷单体。
对比例4
制备工艺与实施例1的相同，区别仅在于将高速逆流色谱分离的溶剂体系替换为：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水：三氟乙酸按2：2：1：5：0.01的体积比混合。经测试，可以分离得到锦葵素-3-o-半乳糖苷单体，但其纯度仅为89.31％，低于实施例1制备得到的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体的纯度(98.92％)。
对比例5
制备工艺与实施例1的相同，区别仅在于：制备液相色谱纯化工艺中的流动相b，将甲酸-水溶液体系替换为水溶液，即不加甲酸，其他步骤不变，经测试，得到的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体纯度仅为68.57％，最终产物的高效液相色谱图如图6所示。
对比例6
制备工艺与实施例1的相同，区别仅在于改变制备液相色谱纯化过程中组分收集时间，若组分收集时间不处在21～22min的范围，则无法得到锦葵素-3-o-半乳糖苷单体，若组分收集时间包含且宽于1～22min范围，则得到的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体纯度低于98％，高效液相色谱图如图7所示。
应用例1
将实施例1制备得到的锦葵素-3-o-半乳糖苷用水溶解，配成一系列浓度(0.1mmol/l,0.2mmol/l,0.5mmol/l,0.7mmol/l,1mmol/l)作为抑制剂。将α-葡萄糖苷酶用0.1mol/l的磷酸缓冲液(pbs，ph＝6.9)稀释至酶活为0.5u/ml。底物对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)用0.1mol/l的磷酸缓冲液(pbs，ph＝6.9)配制成浓度为1mmol/l.酶促反应体系为20μl的酶与10μl的抑制剂混合，加入130μl的缓冲液和40μl的底物，在37℃下反应30min，之后加入200μl的1mol/l的碳酸钠溶液，于405nm下检测吸光值。空白组将抑制剂用缓冲液替代。酶活抑制率根据如下公式计算：抑制率％＝(a空白-a实验)/a空白*100％。在该反应体系下测得的锦葵素-3-o-半乳糖苷的ic50值为0.14mmol/l，阳性对照阿卡波糖为0.52mmol/l。
应用例2
将已报道具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的矢车菊素-3-o-葡萄糖苷(市售)配成一系列浓度(0.1mmol/l,1mmol/l,2mmol/l,5mmol/l,10mmol/l)作为抑制剂。将α-葡萄糖苷酶用0.1mol/l的磷酸缓冲液(pbs，ph＝6.9)稀释至酶活为0.5u/ml。底物对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)用0.1mol/l的磷酸缓冲液(pbs，ph＝6.9)配制成浓度为1mmol/l.酶促反应体系为20μl的酶与10μl的抑制剂混合，加入130μl的缓冲液和40μl的底物，在37℃下反应30min，之后加入200μl的1mol/l的碳酸钠溶液，于405nm下检测吸光值。空白组将抑制剂用缓冲液替代。酶活抑制率根据如下公式计算：抑制率％＝(a空白-a实验)/a空白*100％。在该反应体系下测得的矢车菊素-3-o-葡萄糖苷的ic50值为1.03mmol/l，阳性对照阿卡波糖为0.52mmol/l。
通过对比可知，本发明分离制备得到的锦葵素-3-o-半乳糖苷对α-葡萄糖苷酶的抑制效果显著优于阳性对照阿卡波糖和矢车菊素-3-o-葡萄糖苷。因此，从蓝莓中分离制备得到的飞燕草素-3-o-半乳糖苷可作为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂。