一种提高春雷霉素含量方法与流程

本发明属于生物发酵的技术领域，具体涉及一种提高春雷霉素含量方法。

背景技术

春雷霉素（kasugamycin）又叫春日霉素、加收米，是一种防治农作物病害的微生物源农用杀菌剂，其化学名为（5-氨基-2-甲基-6-（2，3，4，5，6-羟基环己基氧代）四氢吡喃-3-基）氨基-α-亚氨醋酸，分子式c14h25n3o9，分子量379.4。春雷霉素纯品为白色结晶；盐酸盐为白色针状或片状结晶，纯品熔点:236～239℃分解，盐酸盐熔点：202～204℃(分解），易溶于水，在25℃水中溶解12.5%（w/v)，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、苯等有机溶剂。其结构式如下式所示：

春雷霉素对人畜无毒、无残留、无污染，符合现代环保要求，被农业部列为无公害农产品生产推荐生物农药。随着人们对农药安全意识的提高，春雷霉素高效、广谱、无公害的生物特性展示了越来越广泛的市场前景。

中国专利申请cn107987110a公开了一种春雷霉素浓缩液的脱盐方法，采用如下脱盐条件：设备：纳滤有机膜装置；溶质：含盐量2.0%～4.0%的6.0%～7.0%春雷霉素浓缩液，ph2.0～7.0；溶剂：电导率≤0.1us/cm，ph5.0～7.0的无盐水；溶剂：溶质=3:1～5:1；工作温度：20～40℃；工作ph值：2.0～7.0；工作压力：1.00～1.50mpa；工作通量≥25.0m3/h。该溶剂萃取脱盐的方法可降低原浓缩液中60.0%～70.0%的无机盐浓度。

超声波提取工艺是采用超声波辅助溶剂，将超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应应用到天然产物成分提取工艺中，通过破坏细胞壁，增加溶剂穿透力，从而提高物质提取率和缩短提取时间的物质提取技术。超声波提取技术具有提取物质的效率与其他提取方法相比较高，提取所需要的时间较短，提取温度低，适应性广，提取物杂质少、有效成分易于分离、纯化，提取工艺运行成本低，综合经济效益显著，操作简单易行、设备维护、保养方便等优点，使其具有传统提取工艺所不具有的优势。

技术实现要素：

为了解决现有春雷霉素发酵与分离纯化存在的不足之处，在春雷霉素分离与提纯工艺过程中获得高含量的春雷霉素原药，降低春雷霉素与其他农药组合物互配药效的不利影响，本发明提供一种提高春雷霉素含量的方法，实现春雷霉素的药效提高，进一步降低生产成本，提升该春雷霉素的产品品质，得到的高含量春雷霉素原药药效高效、安全、环保且有利于病菌抗性治理。

为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案，一种提高春雷霉素含量的方法，所述春雷霉素原药农药是经酸化、陶瓷膜过滤、离子交换树脂和喷雾干燥后获得，经过这些分离与纯化工艺所得的春雷霉素原药含春雷霉素质量百分比为60-70%，各分离与纯化工段均采用超声波处理，超声波频率为10-35khz，超声功率为1.0-3.0kw。

进一步，所述春雷霉素发酵液分离与纯化工段采用的超声波的超声频率为30khz，超声功率为2.0kw。

进一步，所述春雷霉素发酵液分离与纯化工段采用的超声波的超声功率为2.0kw。

进一步，为进一步确定酸化段、陶瓷膜过滤段、离子交换树脂段、纳滤过滤段和喷雾干燥段最佳超声时间，采用频率为30khz和功率2.0kw的超声波对各工段的处理液进行超声处理后，最佳超声时间分别为15min、45min、60min、30min、30min。

进一步，为进一步确定酸化段、陶瓷膜过滤段、离子交换树脂段、纳滤过滤段和喷雾干燥段中最佳超声对象，采用功率为2.0kw和超声频率30khz超声各工段的发酵液，在各工段的最佳超声时间内处理各工段的发酵液，最终确定经陶瓷膜过滤液经功率为2.0kw和超声频率30khz处理获得春雷霉素原药含量74-76%，春雷霉素原药的含盐量从未经超声波处理的8-10%下降为2-4%。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用利用超声波对春雷霉素酸化液、陶瓷膜超滤液、离子交换树脂的交换液、纳滤液分段处理，春雷霉素发酵液酸化液进行超声波处理，春雷霉素含盐量为6-8%；陶瓷膜过滤液经超声波处理，春雷霉素含盐量为2-4%；离子交换树脂滤液经超声波处理，春雷霉素含盐量为4-6%；纳滤液经超声波处理，春雷霉素含盐量4-6%；未经超声波处理的对照组春雷霉素含盐量为8-10%。尤其是采用超声波频率为30khz和功率2.0kw的超声波处理使春雷霉素原药的含盐量从原先的8-10%下降为2-4%,陶瓷膜过滤液为最佳超声处理材料。本发明的处理方法在春雷霉素分离与提纯工艺过程中获得高含量的春雷霉素原药，降低春雷霉素与其他农药组合物互配药效的不利影响，实现春雷霉素的药效提高，得到的高含量春雷霉素原药药效高效、安全、环保且有利于病菌抗性治理，另外高含量的春雷霉素提高药效，有利于出口创汇。

附图说明

下面结合附图进一步说明：

图1超声波处理春雷霉素发酵原液时的离子浓度变化；

图2超声波处理春雷霉素酸化液时的离子浓度变化；

图3超声波处理春雷霉素陶瓷膜过滤液时的离子浓度变化；

图4超声波处理春雷霉素离子交换树脂过滤液时的离子浓度变化；

图5超声波处理春雷霉素纳滤液时的离子浓度变化。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于这些例子。

本发明所采用的测试手段如下：

1、春雷霉素质量分数的测定

所述试剂如下：

乙腈：色谱纯；水：新蒸二次蒸馏水；春雷霉素盐酸盐水合物标样：已知质量分数≥80.0%。

所述仪器如下：

高效液相色谱仪：具有可变波长紫外检测器；色谱数据处理机；色谱柱：150mm×3.9mm（id）不锈钢色谱柱，waterssymetryshieldrp18，粒径5μm；微量进样器：50μl。

高效液相色谱操作条件如下：

流动相：0.5%十二烷基硫酸钠水溶液∶乙腈=80∶20（v/v），用磷酸调ph值为2.5。

流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；温度:25℃；进样体积:10μl；保留时间：春雷霉素约10.7min。

计算：

将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中春雷霉素的面积分别进行平均，试样中春雷霉素的质量分数ω1（%）按式（1）计算：

式中：a1――标样溶液中，春雷霉素峰面积的平均值；

a2――试样溶液中，春雷霉素峰面积的平均值；

m1――春雷霉素标样的质量，单位为克(g)；

m2――试样的质量，单位为克(g)；

ω――标样中春雷霉素的质量分数（%）。

2、春雷霉素浓缩液中盐离子浓度的检测方法

一种春雷霉素浓缩液中盐离子浓度的检测方法，通过以下步骤实现：

（1）吸取样品1.0ml于150ml三角瓶中，加入30ml蒸馏水，加2滴0.1%甲基红指示剂，用氢离子浓度为0.1mol/l的酸溶液调溶液颜色为红色，然后再用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液红色消褪（呈黄色）。用移液管加入18%中性甲醛10ml，加入2滴0.5%酚酞指示剂，摇匀，静置5min，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液显浅红色，记录加入甲醛后氢氧化钠标准溶液消耗的体积v，同时用纯水做空白。

（2）盐离子含量计算可由式（2-2）计算

式中：v——滴定消耗氢氧化钠的体积ml；

v1——滴定空白消耗的氢氧化钠的体积ml；

c——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度mol/l；

v0——吸取的样品体积ml。

为了确定超声波最佳超声时间采用如下步骤：

（1）超声波直接作用于春雷霉素原液时的最佳超声时间

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，固定超声波频率为35khz，分5批次采用超声波仪器对其进行超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，并测定春雷霉素含量以及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。

（2）超声波作用于进人酸化工艺时的最佳超声时间

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次进人酸化工艺，即使用工业草酸加入发酵液搅拌器均匀搅拌直至春雷霉素原液酸化至ph值为3.5，并固定超声波频率为35khz，在其进人酸化工艺时采用超声波仪器对其进行超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。

（3）超声波作用于进人陶瓷膜过滤的最佳超声时间

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次对其进行酸化工艺处理，固定超声波频率为35khz，在其进人陶瓷膜过滤时采用超声波仪器对其进行前段超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。

（4）超声波作用于进入离子交换树脂段的最佳超声时间

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次对其进行酸化工艺处理以及陶瓷膜过滤，固定超声波频率为35khz，在其进入离子交换树脂段时采用超声波仪器对其进行前段超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。

（5）超声波作用于进入纳滤膜过滤的最佳超声时间

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次对其进行酸化工艺处理、陶瓷膜过滤以及离子交换树脂段处理，固定超声波频率为35khz，在其进入纳滤膜过滤时采用超声波仪器对其进行前段超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。

实施例1

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次，并固定超声波频率为35khz，功率2.0kw对发酵原液进行超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。从图1可知，发酵液中各离子的初始浓度不同，但随着超声时间越来越长，各离子浓度都呈现先增后减的变化趋势，都是在15min后浓度开始下降，且离子半径越大，15min下降越明显，故其最佳超声时间为15min。

实施例2

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次进入酸化工艺，即使用工业草酸加入发酵液搅拌器均匀搅拌直至春雷霉素原液酸化至ph值为3.5，并固定超声波频率为35khz，在其进入酸化工艺时采用超声波仪器对其进行超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。

进入酸化工艺时的春雷霉素原液中的各种离子的初始浓度不同，随着超声时间越来越长，各离子浓度都呈现先增后减的变化趋势，且离子半径越小上升越明显，下降也越明显，这是因为小金色链霉菌因酸化破坏了细胞膜，草酸与蛋白质、脂类、糖类分子参加反应；图2表明各离子浓度在45min时达到最大，故最佳超声时间为45min。

实施例3

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次对其进行酸化工艺处理，固定超声波频率为35khz，在其进人陶瓷膜过滤时采用超声波仪器对其进行前段超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。具体结果见图3，由从图3可以看出，进入陶瓷膜过滤的春雷霉素原液中的各种离子的初始浓度不同，在60min之前，各离子浓度依次升高，且幅度较大，而60min之后，各离子浓度随超声时间的变化不大，故其最佳超声时间为60min。

实施例4

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次对其进行酸化工艺处理以及陶瓷膜过滤，固定超声波频率为35khz，在其进入离子交换树脂段时采用超声波仪器对其进行前段超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。从图4可以看出，进人离子交换树脂段的春雷霉素原液中的各种离子的初始浓度不同，在30min之前，各离子浓度依次升高，而30min后，各离子浓度依次递减，且离子半径越大减少越多，故其最佳超声时间为30min。

实施例5

选取在春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时发酵时的春雷霉素原液，分5批次对其进行酸化工艺处理、陶瓷膜过滤以及离子交换树脂段处理，固定超声波频率为35khz，在其进入纳滤膜过滤时采用超声波仪器对其进行前段超声波处理，超声时间为15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，然后依次进行后续工艺步骤，测定春雷霉素含量及ca²⁺、mg²⁺、na⁺、co³⁺、zn²⁺、fe²⁺、mn²⁺、cr³⁺的离子浓度，通过对比确定其最佳超声时间。具体结果见图5，由图5可见进入纳滤膜过滤的春雷霉素原液中的各种离子的初始浓度不同，在30min之前，各离子浓度依次升高，而30min后，各离子浓度依次递减，但离子半径与离子浓度减少并没有直接关系，故其最佳超声时间为30min。

实施例6

为了确定超声波最佳超声频率，采用相同功率2.0kw，而频率为10khz、15khz、20khz、25khz、30khz、35khz超声波震荡仪，对春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时的春雷霉素原液进行处理，处理时间为15min,然后处理液依次经酸化、陶瓷膜过滤、离子交换树脂、纳滤和喷雾干燥后，实验结果所得原药春雷霉素含量在超声10-30khz区段内，春雷霉素含量依次随频率升高而升高，30khz后春雷霉素变化不大，最佳超声频率为30khz。

实施例7

为了确定超声波最佳超声功率，采用相同频率30khz，而功率1kw、1.5kw、2.0kw、3.0kw超声波震荡仪，对春雷霉素生产工艺30吨发酵罐178小时的春雷霉素原液进行处理，处理时间为15min,然后处理液依次经酸化、陶瓷膜过滤、离子交换树脂、纳滤和喷雾干燥后，实验组与对照组相比，相同频率30khz，功率依次1kw、1.5kw、2.0kw、3.0kw的实验组的春雷霉素含量随功率依次有所增加，但增加幅度不大，至2.0kw时春雷霉素含量最高，其值为72%，对照组为68.5%，随后功率增至3.0kw春雷霉素含量测定值为72%，即使增加功率对含量没有太大影响。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。