本发明涉及食品检验检测技术领域，具体涉及一种食品中大肠杆菌的检验检测方法。
背景技术
大肠杆菌(escherichiacoli)，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，与人类疾病有关的大肠杆菌一般包括五种，即肠毒素性大肠杆菌(etec)，致病性大肠杆菌(spec)、出血性大肠杆菌(ehec)，侵袭性大肠杆菌(eiec)和粘附性大肠杆菌(eaec)。大肠杆菌常随粪便从人及动物体排出，广泛散播于自然界中，所以一旦检出大肠杆菌，即意味着直接或间接地被粪便污染，在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；并且由于大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近，它的出现也可能预示着某些肠道病原菌的存在，因此该细菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
大肠杆菌是水体污染程度的重要指示菌，是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌，近年来，由于大肠杆菌引发的食品安全事件层出不穷，每年由大肠杆菌引发的病例多达6.4亿。在我国，大肠杆菌是引起我国居民腹泻的首要病源，环境中的大肠杆菌己经成为人类病原存在的一个重要指标,成为环境保护、食品卫生、饮水卫生和流行性病学领域中最重要的研究对象之一。饮用水或食物中的大肠杆菌可引发霍乱、伤寒、痢疾等肠道疾病。
现有技术，一般采用无菌操作，将食品检样经过相应的处理后，做一定的倍比稀释，然后在一定条件下培养(如培养基成分、培养温度和时间、ph值、需氧性质等)，最后在电镜、显微镜下观察，根据菌落的颜色、形态等生化指标进行分辨，并计算平板的菌落数。该方法成本低，特别是对检测实验室的硬件设备要求低，曾一度被认为是微生物检测的经典方法，也是后来各种检测方法的基础平台，在各个国家都被认可，该标准在我国一直沿续至今，特别是一些病原细菌的检测。特别是一些病原细菌的检测。但是，该方法非常繁琐，需要耗费大量的人力物力，而且检测周期长、灵敏度低，难以满足目前国内外对食品安全检测的要求。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方便、快捷，成本低，灵敏度高，便于操作的大肠杆菌的检测方法。
本发明解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品：
a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗，然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散，加入生理盐水，充分混匀，高速分散机的转速为8500r-9500r/min，离心35-50s，离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤，过滤后得滤液，将滤液分装至5个无菌试管中；
b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释，依次做成1：4梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5；
(2)培养试验：
c.在无菌条件下，取出5份1ml的稀释液a1，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a2，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a3，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a4，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a5，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；
(3)染色试验：
d.观察所述步骤c中的lb培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性；若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。
进一步的，所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为3-6层。
进一步的，所述步骤a中过滤膜的厚度为0.3-0.4μm。
进一步的，所述步骤a中食品与生理盐水的质量比为1:6。
进一步的，所述步骤b中，所述培养基由如下原料组成：乳糖15～20g/l，琼脂16～22g/l，胆盐2～6g/l，氯化钠3～6g/l，亚碲酸钾3～7g/l,山梨醇12～18g/l，肌醇5g/l；
所述培养基由如下方法制备：按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇，加热溶解后，加去离子水定容至1l，混匀，280-300℃灭菌6-8min，即得。
优选的，所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为18-24℃，培养时间为22-26h；5份稀释液a2的培养温度为18-24℃，培养时间为22-26h。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为18-24℃，培养时间为22-26h；5份稀释液a4的培养温度为18-24℃，培养时间为22-26h；5份稀释液a5的培养温度为18-24℃，培养时间为22-26h。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1)采用本发明对食品中的大肠杆菌进行检测，方便、快捷，成本低，灵敏度高，便于操作食品样品处理不用多次离心，不用多次膜过滤，只需离心一次，过滤一次，省时省力，就能达到现有技术多次过滤的效果。
2)本发明提供特异性lb培养基，大肠杆菌在无氧条件下，把乳糖分解成乳酸等酸性物质，抑制除大肠杆菌以外其他细菌的生长。同时，本发明采用多个lb培养基进行对比试验，使得试验的结果对比明显，更加准确。
3)本检测方法灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就能判断出是否含有大肠杆菌，检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于工业化生产，可对食品中大肠杆菌进行初步鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
具体实施方式
为了本技术领域的人员更好的理解本发明，下面结合以下实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品：
a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗，然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散，加入生理盐水，所述食品与生理盐水的质量比为1:6。充分混匀，高速分散机的转速为8500r/min，离心35s，离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤，过滤后得滤液，将滤液分装至5个无菌试管中；
b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释，依次做成1：4梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5；
(2)培养试验：
c.在无菌条件下，取出5份1ml的稀释液a1，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a2，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a3，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a4，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a5，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；
(3)染色试验：
d.观察所述步骤c中的lb培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性；若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。
为了达到更好的检测效果，所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为3层。
为了达到更好的检测效果，所述步骤a中过滤膜的厚度为0.3μm。
实施例2：
(1)制备样品：
a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗，然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散，加入生理盐水，充分混匀，高速分散机的转速为9500r/min，离心50s，离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤，过滤后得滤液，将滤液分装至5个无菌试管中；
b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释，依次做成1：4梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5；
(2)培养试验：
c.在无菌条件下，取出5份1ml的稀释液a1，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a2，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a3，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a4，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a5，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；
(3)染色试验：
d.观察所述步骤c中的lb培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性；若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。
作为优选，所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为6层。
作为优选，所述步骤a中过滤膜的厚度为0.4μm。
为了达到快速、方便和更加灵敏的检测结果，所述步骤b中，所述培养基由如下原料组成：乳糖15～20g/l，琼脂16～22g/l，胆盐2～6g/l，氯化钠3～6g/l，亚碲酸钾3～7g/l,山梨醇12～18g/l，肌醇5g/l；
所述培养基由如下方法制备：按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇，加热溶解后，加去离子水定容至1l，混匀，280-300℃灭菌6-8min，即得。
优选的，所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为18℃，培养时间为22h；5份稀释液a2的培养温度为18℃，培养时间为22h。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为18℃，培养时间为22h；5份稀释液a4的培养温度为18℃，培养时间为22h；5份稀释液a5的培养温度为18℃，培养时间为22h。
实施例3：
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品：
a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗，然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散，加入生理盐水，充分混匀，高速分散机的转速为9000r/min，离心40s，离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤，过滤后得滤液，将滤液分装至5个无菌试管中；
b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入10倍质量的蒸馏水进行稀释，依次做成1：4梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5；
(2)培养试验：
c.在无菌条件下，取出5份1ml的稀释液a1，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a2，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a3，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a4，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a5，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；
(3)染色试验：
d.观察所述步骤c中的lb培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性；若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。
为了达到更好的检测效果，所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为5层。
为了达到更好的检测效果，所述步骤a中过滤膜的厚度为0.35μm。
为了达到更好的检测效果，所述步骤a中食品与生理盐水的质量比为1:6。
为了达到更好的检测效果，所述步骤b中，所述培养基由如下原料组成：乳糖18g/l，琼脂20g/l，胆盐4g/l，氯化钠5g/l，亚碲酸钾5g/l,山梨醇15g/l，肌醇5g/l；
所述培养基由如下方法制备：按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇，加热溶解后，加去离子水定容至1l，混匀，290℃灭菌7min，即得。
优选的，所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为23℃，培养时间为25h；5份稀释液a2的培养温度为23℃，培养时间为25h。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为20℃，培养时间为23h；5份稀释液a4的培养温度为23℃，培养时间为25h；5份稀释液a5的培养温度为23℃，培养时间为25h。
实施例4：
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品：
a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗，然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散，加入生理盐水，充分混匀，高速分散机的转速为9500r/min，离心35s，离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤，过滤后得滤液，将滤液分装至5个无菌试管中；
b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释，依次做成1：4梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5；
(2)培养试验：
c.在无菌条件下，取出5份1ml的稀释液a1，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a2，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a3，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a4，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；取出5份1ml的稀释液a5，分别移至lb培养基上培养；无氧条件下36℃培养18h；
(3)染色试验：
d.观察所述步骤c中的lb培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性；若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。
进一步的，所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为6层。
进一步的，所述步骤a中过滤膜的厚度为0.3μm。
进一步的，所述步骤a中食品与生理盐水的质量比为1:6。
进一步的，所述步骤b中，所述培养基由如下原料组成：乳糖15g/l，琼脂22g/l，胆盐6g/l，氯化钠3g/l，亚碲酸钾7g/l,山梨醇12g/l，肌醇5g/l；
所述培养基由如下方法制备：按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇，加热溶解后，加去离子水定容至1l，混匀，300℃灭菌6min，即得。
优选的，所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为24℃，培养时间为26h；5份稀释液a2的培养温度为24℃，培养时间为26h。
优选的，所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为24℃，培养时间为26h；5份稀释液a4的培养温度为24℃，培养时间为26h；5份稀释液a5的培养温度为24℃，培养时间为26h。
采用本发明对食品中的大肠杆菌进行检测，方便、快捷，成本低，灵敏度高，便于操作食品样品处理不用多次离心，不用多次膜过滤，只需离心一次，过滤一次，省时省力，就能达到现有技术多次过滤的效果。
本发明提供特异性lb培养基，大肠杆菌在无氧条件下，把乳糖分解成乳酸等酸性物质，抑制除大肠杆菌以外其他细菌的生长。同时，本发明采用多个lb培养基进行对比试验，使得试验的结果对比明显，更加准确。
本检测方法灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就能判断出是否含有大肠杆菌，检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于工业化生产，可对食品中大肠杆菌进行初步鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。