本发明涉及单细胞测序文库构建技术领域，尤其涉及一种高通量单细胞测序文库构建方法。
背景技术
非基于培养的单细胞基因组学技术已成功实现，并被应用于各种微生物生态学研究。而对微生物细胞进行分析的难点在于，大多数微生物，如细菌和古细菌细胞，有着难以有效裂解的细胞外膜结构；原核微生物的rna半衰期短、稳定性低；此外，细胞大小远小于哺乳动物细胞(10～30皮克)，因此细胞内的rna分子的总浓度很低，大约为每个细胞4～10菲克,这一rna浓度远低于真核生物细胞中的rna浓度，为rna抽提和分析提生了很多挑战。虽然针对真核生物单细胞的全转录组分析技术已经建立，但针对原核微生物单细胞的全转录组分析的技术一直没能够完全建立。
生物可以根据构成的细胞数目分为单细胞生物和多细胞生物。单细胞生物只由单个细胞组成，而且经常会聚集成为细胞集落。地球上最早的生物大约在距今35亿年前至41亿年前形成，原核生物是最原始的生物，如细菌和蓝绿藻且是在温暖的水中发生。单细胞生物包括所有古细菌和真细菌和很多原生生物。根据旧的分类法有很多动物，植物和真菌多是多细胞生物。变形虫算作单细胞动物，它的一些种类却算作粘菌，带鞭毛的鞭毛虫如眼虫有时被归为单细胞藻类或者是单细胞动物。
经检索，专利号为cn201310481921.x提出一种基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法，微生物单细胞的分离：将新鲜微生物细胞培养样本，在常温下离心收集，立即悬浮于rna保护剂rnalater溶液中；使用显微注射系统在倒置显微镜下进行单细胞的选取分离，并将分离得到的微生物单细胞重悬于rnalater溶液中，如总rna抽提，总rna的线性扩增，以及用于rna测序文库的构建的多种商业试剂盒的应用效果比较评价，获得了一套完整的技术流程，最终实现了对微生物单细胞进行基于二代测序技术的全转录组分析，仅可以实现对不同微生物细胞个体间的基因表达差异的分析，还可以实现对极端环境下不可培养的微生物进行单细胞水平的生理功能分析；该申请文件在构建测序文库时，假阳性率不能通过简单地增加测序深度而减少，扩增错误是独立产生的，并可在线性扩增产物中稀释，为此，本发明提出一种高通量单细胞测序文库构建方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高通量单细胞测序文库构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种高通量单细胞测序文库构建方法，包括以下步骤，
s1，将来自所述单细胞的核酸接触第一物质和包含链置换活性的聚合酶，接触发生于4℃至约25℃温度范围的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含30％-40％的g或富含30％-40％的c；和包含限制性内切核酸酶位点，从而产生包含引物退火的核酸模板的混合物；对引物退火的核酸模板进行两轮或更多轮延伸、解链和退火步骤，由此产生核酸模板、线性产生的半扩增子和非线性产生的全扩增子的混合物；将所述混合物置于使全扩增子的两个末端能够彼此退火的条件下，从而产生成环的全扩增子；将所述成环的全扩增子接触限制性内切核酸酶，从而使得全扩增子不能与第一物质或第二物质退火，其中第二物质富含30％-40％的g或c；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子a；
s2，所述s1中的全扩增子a用作测序文库。
优选的，所述第二物质富含35％的g或c。
优选的，所述酶切采用的酶包含但不限于其中任意一种或几种：alui、taqαi、sphi、mspi、bamhi、apeki、banii、hpaii、hpych4v、bstni、haeiii、hpych4iii、bglii、bsssi和kpni。
优选的，所述第一物质和第二物质包括链置换活性的酶。
优选的，所述链置换活性的酶选自但不限于其中任意一种或几种：klenow片段、klenow片段、bstdna聚合酶、ventdna聚合酶、ventdna聚合酶、phi29dna聚合酶、deepventdna聚合酶、deepventdna聚合酶。
优选的，所述第一物质结构为：5’-特异性识别接头的序列-随机序列-cpg岛识别序列-3’，第二物质的结构为：5’-特异性识别接头的序列-随机序列-cpg岛识别序列-3’；或者第一物质的结构为：5’-特异性识别接头的序列-分子标签-随机序列-cpg岛识别序列-3’，第二物质的结构为：5’-特异性识别接头的序列-分子标签-随机序列-cpg岛识别序列-3’。
优选的，所述单细胞通过微流控技术，微流控技术可利用重力离心、流体力学、电场力来捕获细胞，也可以通过流体力学利用细胞大小、细胞表面标志物进行分选，同时可以整合细胞培养、细胞捕获分选、细胞裂解及后续的检测分析基于一体，可直观辨别目的细胞、实现高通量单细胞分离、自动化集成化。
优选的，所述s1中，将来自所述单细胞的核酸接触第一物质和包含链置换活性的聚合酶，接触发生于20℃温度范围的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含35％的g或富含35％的c。
优选的，所述第一物质中的随机序列的长度为4～20nt，所述第二物质中的随机序列的长度为4～20nt。
优选的，测序文库，使用美国nugen公司的nugenencore试剂盒，按照试剂盒说明书进行rna测序文库的构建。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过接触发生于4℃至约25℃温度范围的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含30％-40％的g或富含30％-40％的c，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域，使得其连接活性增强，提高接头连接效率，使得更多的修复dna片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引物进行扩增，进而得到了目的扩增片段含量更多的高通量测序文库；从而提高了微量起始量样本；通过第二物质富含30％-40％的g或c；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子a，测定线性产生的全扩增子与标准品相比其中一种或多种特定核苷酸是否存在，假阳性率通过本方法测序深度而减少，本发明设计巧妙，方法合理，高通量测序文库，效果好，准确性高，适合推广。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
一种高通量单细胞测序文库构建方法，包括以下步骤，
s1，将来自所述单细胞的核酸接触第一物质和包含链置换活性的聚合酶，接触发生于4℃温度的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含30％的g或富含30％的c；和包含限制性内切核酸酶位点，从而产生包含引物退火的核酸模板的混合物；对引物退火的核酸模板进行两轮或更多轮延伸、解链和退火步骤，由此产生核酸模板、线性产生的半扩增子和非线性产生的全扩增子的混合物；将所述混合物置于使全扩增子的两个末端能够彼此退火的条件下，从而产生成环的全扩增子；将所述成环的全扩增子接触限制性内切核酸酶，从而使得全扩增子不能与第一物质或第二物质退火，其中第二物质富含30％的g或c；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子a；
s2，所述s1中的全扩增子a用作测序文库；
所述酶切采用的酶包含但不限于其中任意一种或几种：alui、taqαi、sphi、mspi、bamhi、apeki、banii、hpaii、hpych4v、bstni、haeiii、hpych4iii、bglii、bsssi和kpni。
实施例二
一种高通量单细胞测序文库构建方法，包括以下步骤，
s1，将来自所述单细胞的核酸接触第一物质和包含链置换活性的聚合酶，接触发生于20℃温度的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含35％的g或富含35％的c；和包含限制性内切核酸酶位点，从而产生包含引物退火的核酸模板的混合物；对引物退火的核酸模板进行两轮或更多轮延伸、解链和退火步骤，由此产生核酸模板、线性产生的半扩增子和非线性产生的全扩增子的混合物；将所述混合物置于使全扩增子的两个末端能够彼此退火的条件下，从而产生成环的全扩增子；将所述成环的全扩增子接触限制性内切核酸酶，从而使得全扩增子不能与第一物质或第二物质退火，其中第二物质富含35％的g或c；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子a；
s2，所述s1中的全扩增子a用作测序文库；
所述链置换活性的酶选自但不限于其中任意一种或几种：klenow片段、klenow片段、bstdna聚合酶、ventdna聚合酶、ventdna聚合酶、phi29dna聚合酶、deepventdna聚合酶、deepventdna聚合酶。
实施例三
一种高通量单细胞测序文库构建方法，包括以下步骤，
s1，将来自所述单细胞的核酸接触第一物质和包含链置换活性的聚合酶，接触发生于25℃温度的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含40％的g或富含40％的c；和包含限制性内切核酸酶位点，从而产生包含引物退火的核酸模板的混合物；对引物退火的核酸模板进行两轮或更多轮延伸、解链和退火步骤，由此产生核酸模板、线性产生的半扩增子和非线性产生的全扩增子的混合物；将所述混合物置于使全扩增子的两个末端能够彼此退火的条件下，从而产生成环的全扩增子；将所述成环的全扩增子接触限制性内切核酸酶，从而使得全扩增子不能与第一物质或第二物质退火，其中第二物质富含40％的g或c；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子a；
s2，所述s1中的全扩增子a用作测序文库；
所述第一物质结构为：5’-特异性识别接头的序列-随机序列-cpg岛识别序列-3’，第二物质的结构为：5’-特异性识别接头的序列-随机序列-cpg岛识别序列-3’；或者第一物质的结构为：5’-特异性识别接头的序列-分子标签-随机序列-cpg岛识别序列-3’，第二物质的结构为：5’-特异性识别接头的序列-分子标签-随机序列-cpg岛识别序列-3’；
所述单细胞通过微流控技术，微流控技术可利用重力离心、流体力学、电场力来捕获细胞，也可以通过流体力学利用细胞大小、细胞表面标志物进行分选，同时可以整合细胞培养、细胞捕获分选、细胞裂解及后续的检测分析基于一体，可直观辨别目的细胞、实现高通量单细胞分离、自动化集成化。
本发明在使用时，通过接触发生于4℃至约25℃温度范围的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含30％-40％的g或富含30％-40％的c，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域，使得其连接活性增强，提高接头连接效率，使得更多的修复dna片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引物进行扩增，进而得到了目的扩增片段含量更多的高通量测序文库；从而提高了微量起始量样本；通过第二物质富含30％-40％的g或c；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子a，测定线性产生的全扩增子与标准品相比其中一种或多种特定核苷酸是否存在，假阳性率通过本方法测序深度而减少，本发明设计巧妙，方法合理，高通量测序文库，效果好，准确性高，适合推广。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。