鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用与流程

本发明涉及一种鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物及其鉴别方法以及应用。

背景技术

根据国际病毒分类委员会(ictv)分类，腺病毒科(adenoviridae)下设5个属(genus)：禽腺病毒属(aviadenovirus)、富at腺病毒属(atadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(siadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(mastadenovirus)和美洲白鲟腺病毒属(ichtadenovirus)。腺病毒为双链dna无囊膜病毒，呈二十面体对称，衣壳由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(非顶点壳粒)，12个则是五邻体基底(顶点壳粒)，每个五邻体基底结合着1根至2根纤突。不同腺病毒的基因组大小有所差异，一般在26-45kb之间。按照腺病毒dna复制的起始时间不同，其基因组可以划分为早期转录基因(e)和晚期转录基因(l)。早期转录基因包含有el(e1a和e1b)、e2(e2a和e2b)、e3和e4四个区，主要负责调节控制病毒的增殖复制。晚期转录基因包括ll、l2、l3、l4和l5共五个区，主要功能为负责编码病毒的结构蛋白。

鸭腺病毒a型(duckatadenovirusa，dadv-a)属于腺病毒科(adenoviridae)、富at腺病毒属，也称为产蛋下降综合征病毒(eggdropsyndromevirus，edsv)，其基因组大小约为33.2kb。当鸭群免疫力降低时，感染edsv，会出现呼吸道症状。鸭腺病毒b型(duckaviadenovirusb，dadv-b)属于腺病毒科(adenoviridae)、禽腺病毒属(aviadenovirus)，基因组大小约为43.7kb。该病毒于1977年从法国爆发疾病的番鸭中分离得到，发病鸭临床表现为消瘦、跛行。鸭腺病毒c型(duckaviadenovirusc，dadv-c)是近年来新发现的鸭源腺病毒，属于腺病毒科(adenoviridae)、禽腺病毒属(aviadenovirus)，该病毒感染主要引起鸭出现肝脏肿大、出血及坏死，其基因组大小约为43.8kb。

鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型都属于禽腺病毒属(aviadenovirus)，而且两者之间全基因组的核苷酸同源性高达91％，常规分子生物学方法(如普通pcr)不容易区分，亟待一种鉴别鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高敏感、高特异性且能快速鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物和应用以及鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物，所述引物的序列如下：

上游引物f：5’-gctagacagatcgagggagg-3’

下游引物r：5’-gaagaagagcagagttggcg-3’。

一种鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的方法：

利用上游引物f：5’-gctagacagatcgagggagg-3’和下游引物r：5’-gaagaagagcagagttggcg-3’，以待检病毒样本的dna为模板，进行pcr扩增，之后利用限制性内切酶speⅰ对pcr扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型进行鉴别诊断。

所述的鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物的应用，在制备区分鸭腺病毒c型与鸭腺病毒b型试剂盒上的应用。

所述的鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物的应用，在检测鸭腺病毒c型与鸭腺病毒b型感染情况方面的应用。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.本发明的pcr引物特异性强，能够对鸭腺病毒b型以及鸭腺病毒c型进行有效的扩增，而对其他如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒等家禽常见病原并不能扩增出dna片段。

2.本发明根据鸭腺病毒b型和c型22k基因序列在342-347位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。可达到仅需一组引物，并结合两种鸭腺病毒22k基因核苷酸序列特征，利用speⅰ限制性内切酶进行酶切分析，即可特异性地对鸭腺病毒b型和c型进行鉴别诊断，当前国内外未见相关研究报道，本发明可填补相关领域空白。

3.本发明的鉴定方法简单、经济、方便高效、准确率较高，可用于鉴别鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型。

附图说明

图1是鸭腺病毒b型和c型酶切位点的比较图。

图2是本发明对鸭腺病毒b型和c型pcr扩增和酶切的电泳图。

图3是目的片段测序结果分析图。

图4是利用另一引物对鸭腺病毒b型和c型pcr扩增和酶切的电泳图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

一种鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物，所述引物的序列如下：

上游引物f：5’-gctagacagatcgagggagg-3’

下游引物r：5’-gaagaagagcagagttggcg-3’。

经分子生物学软件分析鸭腺病毒b型和c型22k基因的核苷酸序列发现，在342-347位这两种鸭腺病毒的酶切位点不同，鸭腺病毒b型的酶切位点为actagt，能被speⅰ限制性内切酶所识别，而鸭腺病毒c型该位点的序列为cctcgt(如图1所示)，不能被speⅰ限制性内切酶所识别。本发明就是根据鸭腺病毒b型和c型22k基因序列在342-347位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。

本发明的pcr引物对鸭腺病毒b型和c型均可扩增，扩增条带大小均为459bp。鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp，而鸭腺病毒c型扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后没有变化，还是原来pcr产物的片段。鸭腺病毒b型和c型混合扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可显示3条带，其中1条大小为459bp的条带是鸭腺病毒c型pcr扩增后未被speⅰ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为286bp，另1条大小为173bp)是鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ酶酶切后的产物。根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带(459bp)、2条带(286bp和173bp)还是3条带(459bp、286bp和173bp)即可特异性地对鸭腺病毒b型和c型进行鉴别诊断。

为了对鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型进行准确的区分，本发明的发明人设计了多组引物，但经实验发现该组引物(上游引物f以及下游引物r)的特异性最好，能够有效地对鸭腺病毒b型的dna以及鸭腺病毒c型的dna进行扩增，而对其他如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒等家禽常见病原并不能扩增出dna片段；之后结合speⅰ限制性内切酶酶切分析，能够清楚、快速、便捷的对鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型进行鉴别。

例如：本发明的发明人还设计了如下引物：

f1:atgacccaaaagcaagtgga

r1:cccttgagaattttrcacgc，

以该组引物对制备的鸭腺病毒b型的dna以及鸭腺病毒c型的dna，利用优化的条件进行pcr检测，反应结束后的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4中的1、2、3所示，图4中m为dl2000分子量标准；1为鸭腺病毒b型pcr扩增；2为鸭腺病毒c型pcr扩增；3为鸭腺病毒b型和c型混合pcr扩增；7为阴性对照，从图4大致可知：鸭腺病毒b型和c型均可扩增，扩增条带大小均为443bp。

对鸭腺病毒b型的pcr扩增产物、鸭腺病毒c型的pcr扩增产物以及鸭腺病毒b型和c型混合pcr扩增产物按酶切反应体系及反应条件进行speⅰ酶切，并将酶切后的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4中的4、5以及6所示，图4中，4为鸭腺病毒b型pcr扩增产物的酶切产物；5为鸭腺病毒c型pcr扩增产物的酶切产物；6为鸭腺病毒b型和c型混合pcr扩增产物的酶切产物；从图4大致可知，鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为342bp，另1条大小为101bp；而鸭腺病毒c型扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后没有变化，还是原来pcr产物的片段；鸭腺病毒b型和c型混合扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后，电泳可显示3条带，其中1条大小为443bp的条带是鸭腺病毒c型pcr扩增后未被speⅰ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为342bp，另1条大小为101bp)是鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ酶酶切后的产物。

虽然利用引物f1、r1与speⅰ限制性内切酶相配合可以勉强将鸭腺病毒b型和c型进行区分鉴别，但是深入研究图4，可以看出pcr扩增后有引物二聚体产生，pcr产物经酶切后电泳，鸭腺病毒b型的pcr产物酶切成的较大片段与鸭腺病毒c型未切开的pcr产物条带大小较接近，不好区分，而且鸭腺病毒b型的pcr产物酶切成的较小片段与pcr生成的引物二聚体条带相似，不易区分。所以引物的设计很关键，引物不仅需要能同时扩增鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型，而且要保证酶切后的条带大小容易区分，还要尽量不产生引物二聚体，以免影响后面酶切结果的分析。

一种鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的方法，

利用上游引物f：5’-gctagacagatcgagggagg-3’和下游引物r：5’-gaagaagagcagagttggcg-3’，以待检病毒样本的dna为模板，进行pcr扩增，之后利用限制性内切酶speⅰ对pcr扩增产物进行酶切，建立pcr-rflp检测方法；

所述引物对鸭腺病毒b型的dna以及鸭腺病毒c型的dna均可扩增，扩增条带大小均为459bp，对鸭腺病毒b型的dna以及鸭腺病毒c型的dna扩增的pcr产物进行speⅰ限制性内切酶酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒b型和鸭腺病毒c型进行鉴别诊断。

所述的鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的方法，它包括以下步骤：

(1)核酸的制备：制备病毒样本的dna；

(2)pcr扩增反应：

利用上游引物f：5’-gctagacagatcgagggagg-3’和下游引物r：5’-gaagaagagcagagttggcg-3’，以步骤(1)得到的dna作为模板，进行pcr扩增反应；

(3)pcr产物的酶切：

将步骤(2)扩增的pcr产物进行speⅰ酶切反应；

(4)琼脂糖凝胶电泳：

对步骤(3)酶切所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳，鸭腺病毒b型的dna扩增的pcr产物经speⅰ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp；鸭腺病毒c型的dna扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后没有变化，还是原来pcr产物的片段，即大小为459bp的片段；对于鸭腺病毒b型的dna和鸭腺病毒c型的dna混合扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后，琼脂糖凝胶电泳可显示3条片段，其中1条大小为459bp的片段是鸭腺病毒c型的dna经pcr扩增后未被speⅰ酶切开的产物；另2条片段是鸭腺病毒b型的dna扩增的pcr产物经speⅰ酶酶切后的产物，且2条片段中，1条大小为286bp，另1条大小为173bp。

其中，步骤(2)所述pcr扩增反应的优化体系为：在50μl体系中含有以下成分：

步骤(2)所述pcr扩增反应的反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min；10℃hold；

步骤(3)所述酶切反应的体系为：在30μl体系中含有以下成分：

步骤(3)所述酶切反应的反应条件为：37℃水浴反应5min。

下面结合具体实施例对本发明的内容作更细致的阐述：

实施例一：

1.材料：

1.1实验试剂与耗材：200μlpcr管购自corning公司；病毒核酸提取试剂盒easypureviraldna/rnakit、细菌基因组提取试剂盒easypurebacteriagenomicdnakit均购自北京全式金生物技术有限公司；premixtaq^tm(takarataq^tmversion2.0plusdye)pcr试剂盒和quickcut^tmspeⅰ限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2毒株：鸭腺病毒c型(dadv-c)、鸭瘟病毒(dpv)、番鸭细小病毒(mdpv)、鹅细小病毒(gpv)、减蛋综合征病毒(edsv)、鸭源大肠杆菌(e.coli)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(p.m.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。由于未获得鸭腺病毒b型病毒株，所以鸭腺病毒b型的22k基因(dna)由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。

2.鸭腺病毒b型和c型22k基因序列分析、酶切位点选择及引物设计：

2.1基因序列分析和酶切位点选择

结合软件oligo7和megalign比较分析鸭腺病毒b型和c型22k基因核苷酸序列的差异，发现在342-347位这两种鸭腺病毒的酶切位点不同，如图1所示，鸭腺病毒b型的酶切位点为actagt，能被speⅰ限制性内切酶所识别，而鸭腺病毒c型该位点的序列cctcgt，不能被speⅰ限制性内切酶所识别，所以选取该位点作为区分鸭腺病毒b型和c型的特异性酶切位点。

2.2引物设计

利用引物设计软件oligo7，针对鸭腺病毒b型和c型22k基因设计引物，引物序列如下：

上游引物f：5’-gctagacagatcgagggagg-3’

下游引物r：5’-gaagaagagcagagttggcg-3’

该引物需满足以下特征：①该引物对鸭腺病毒b型和c型均可扩增，扩增条带大小均为459bp。②鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp，而鸭腺病毒c型扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后没有变化，还是原来pcr产物的片段。③鸭腺病毒b型和c型混合扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后，电泳可显示3条带，其中1条大小为459bp的条带是鸭腺病毒c型pcr扩增后未被speⅰ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为286bp，另1条大小为173bp)是鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ酶酶切后的产物。根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带(459bp)、2条带(286bp和173bp)还是3条带(459bp、286bp和173bp)即可特异性地对鸭腺病毒b型和c型进行鉴别诊断。

3.pcr和speⅰ限制性内切酶酶切方法建立

3.1核酸的制备

核酸的提取：利用北京全式金生物技术有限公司的viraldna/rnakit核酸提取试剂盒，按照说明书的操作方法提取鸭腺病毒c型(ah06株)、鸭瘟病毒(dpv)、番鸭细小病毒(mdpv)、鹅细小病毒(gpv)、减蛋综合征病毒(edsv)的核酸。利用北京全式金生物技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒easypurebacteriagenomicdnakit，按照说明书的操作方法提取鸭源大肠杆菌(e.coli)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(p.m.)的核酸。

鸭腺病毒b型的22k基因的制备：由于未获得鸭腺病毒b型病毒株，所以鸭腺病毒b型的22k基因(dna)由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。

3.2pcr反应及其条件的优化

本发明使用的premixtaq^tm(takarataq^tmversion2.0plusdye)pcr试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，在结合试剂盒推荐的反应体系配置的基础上对pcr反应液进行了优化，优化出的50μl最佳反应体系的具体配置方法见表1，最佳反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min；10℃hold。

表1pcr反应液的配置

3.3pcr产物的酶切

将pcr产物进行speⅰ酶切分析。按照宝生物工程(大连)有限公司的quickcut^tmspeⅰ试剂盒推荐的酶切反应体系(30μl体系，具体配置见表2)配置反应液。反应条件：37℃水浴反应5min。酶切结果见图2。

表2酶切反应液的配置

4.pcr的特异性试验

以制备的dna为模板，利用优化的条件进行pcr检测，反应结束后的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，在图2中，m为dl2000分子量标准；1为鸭腺病毒b型pcr扩增；2为鸭腺病毒c型pcr扩增；3为鸭腺病毒b型和c型混合pcr扩增；7为阴性对照；8为鸭瘟病毒(dpv)；9为番鸭细小病毒(mdpv)；10为鹅细小病毒(gpv)；11为减蛋综合征病毒(edsv)；12为鸭源大肠杆菌(e.coli)；13为鸭源禽多杀性巴氏杆菌(p.m.)。

从图2可知：鸭腺病毒b型和c型均可扩增，扩增条带大小均为459bp。对家禽常见病原(dpv、mdpv、gpv、edsv、e.coli、p.m.)进行检测，没有扩增出任何条带，说明本发明的pcr引物的特异性好。

对鸭腺病毒b型的pcr扩增产物、鸭腺病毒c型的pcr扩增产物以及鸭腺病毒b型和c型混合pcr扩增产物按上述酶切反应体系及反应条件进行speⅰ酶切，并将酶切后的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2中的4、5以及6所示，图2中，4为鸭腺病毒b型pcr扩增产物的酶切产物；5为鸭腺病毒c型pcr扩增产物的酶切产物；6为鸭腺病毒b型和c型混合pcr扩增产物的酶切产物；从图2可知，鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp；而鸭腺病毒c型扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后没有变化，还是原来pcr产物的片段；鸭腺病毒b型和c型混合扩增的pcr产物经限制性内切酶speⅰ酶切后，电泳可显示3条带，其中1条大小为459bp的条带是鸭腺病毒c型pcr扩增后未被speⅰ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为286bp，另1条大小为173bp)是鸭腺病毒b型扩增的pcr产物经speⅰ酶酶切后的产物。

5临床应用

使用本研究建立的pcr和speⅰ限制性内切酶酶切方法和设计的引物对前期鉴定的鸭腺病毒c型fj06株、ah10株和人工合成的鸭腺病毒b型的22k基因进行检测，均和预期的相符，经特异性的pcr检测引物f2：5’-acccaaaagcaagtggacgc-3’，r2:5’-cggartcaccaccttcctcg-3’检测，也为鸭源禽腺病毒阳性，阳性符合率为100％。将目的片段进行克隆测序，序列分析也符合上述特征，如图3所示。

对临床送检的86份鸭源病料样品进行检测后发现，鸭腺病毒c型有2份阳性，阳性率为2.3％，未检测到鸭腺病毒b型阳性样品。

需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物及其鉴别方法以及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctagacagatcgagggagg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaagaagagcagagttggcg20