一种鸡传染性支气管炎病毒QX型毒株鉴别检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及鸡传染性支气管炎病毒qx毒株鉴别检测试剂盒。

背景技术

鸡传染性支气管炎(infectiousbronchitis，ib)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus，ibv)引起的急性、高度接触性传染病。该病可侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统以及消化系统等。是严重危害世界养禽业的重要传染病之一。

鸡传染性支气管炎病毒属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属。其基因组是不分节段的正链rna病毒，全长约27.6kb。病毒基因组从5’端到3’端依次为5’-1a-1b-s1-s2-3a-3b-3c-m-5a-5b-n-poly(a)-3’。ibv含4种主要结构蛋白：纤突蛋白(s)、膜蛋白(m)、核衣壳蛋白(n)、小囊膜蛋白(e)。ibv的抗原决定簇大部分位于s蛋白，s蛋白不仅能介导病毒与易感细胞发生融合，决定病毒的毒力，且决定病毒的抗原性。ibv在转录过程中使用相同的先导序列转录不同片段的独特转录机制，再加上rna酶缺乏校对机制，使ibv的基因组易出现点突变、缺失、插入和重组，最终导致ibv毒株的变异，不断出现新的血清型与基因型。大量研究表明，ibv的s1基因是变异频率与变异程度最高的基因，基于s1基因的ibv分型以及遗传进化分析成为近年来一大研究热点。

通过对ibv的s1基因进行系统进化分析后可将各种ibv分成不同基因型的毒株。目前在我国普遍流行的是qx基因型的ibv毒株。ibvqx型毒株过去在1990s只在中国流行，2000s以后已广泛流行于世界各地包括欧洲和俄罗斯等国家。常规疫苗对qx毒株的感染不能提供保护。因此qx毒株的流行给养鸡业造成了很大的经济损失。临床上急需对qx基因型的ibv毒株进行特异性快速鉴别诊断，以便及时指导疫苗的选用，减少ibv感染造成的损失。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种鸡传染性支气管炎病毒qx型毒株鉴别检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种用于鸡传染性支气管炎病毒qx型毒株鉴别检测的试剂盒，包括下述两对引物：用于扩增传染性支气管炎病毒的通用引物和用于特异性扩增qx基因型毒株的引物；其序列如下：

通用-f：5'-ccaaagtgccttcagacc-3'(如seqidno：3所示)

通用-r：5'-gctagaccaagccatacc-3'(如seqidno：4所示)

qx-f：5'-gtcatttctgagtcagtttgtg-3'(如seqidno：5所示)

qx-r：5'-tgcgttaatactaagggctc-3'(如seqidno：6所示)。

本发明中，所述试剂盒包括下述成分：

(1)rna提取试剂：trizol试剂；

(2)反转录试剂：5×反应缓冲液，10mm的dntpmix，0.2μg/μl的随机引物，20u/μlrnase抑制剂，200u/μl的反转录酶，nuclease-free水；

(3)pcr反应试剂：2×taqmastermix，灭菌双蒸水；

(4)分型引物：所述通用引物和qx基因型毒株特异性引物的浓度均为10μm；

(5)阳性对照样品：qx基因型毒株核酸抽提物的反转录产物cdna；

(6)阴性对照样品：正常鸡胚尿囊液抽提rna的反转录产物cdna。

本发明中，所述阳性对照样品是qx基因型毒株ibv-hf感染鸡胚的尿囊液抽提rna的反转录产物cdna。

本发明提供的试剂盒，其使用方法包括以下步骤：

(1)从待测拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品中提取总rna：

在1.5mlep管中加500μl处理好的拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品后(不足500μl的可以用灭菌pbs补足500μl)，加入500μltrizol试剂，充分混匀，室温静置5min；加200μl氯仿，充分混匀15s，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；取上清(400-600μl)加等体积的异丙醇，轻微混匀，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；弃去上清，加1ml75％乙醇，4℃，12000rpm离心7min；弃去上清，沉淀干燥10-15min，加10μlnuclease-free水溶解，得总rna。(注：rna抽提时所用的枪头和ep管应不含rna酶)

(2)以上一步骤提取的总rna为模板，进行反转录反应。反应的体系为：11μl总rna模板，4μl的5×反应缓冲液,2μl的10mm的dntpmix,1μl的0.2μg/μl的随机引物，1μl20u/μl的rnase抑制剂,1μl200u/μl的反转录酶，共20μl。混匀后在42℃恒温反应1h，然后70℃恒温终止反应10min，得cdna。

(3)以所述反转录产物cdna为模板，利用两对分型引物进行pcr扩增，所述pcr体系为：2×taqmastermix12.5μl，10μm通用上下游引物(通用-f,通用-r)各0.8μl，10μmqx基因型引物(qx-f,qx-r)各0.4μl，cdna模板1μl，加灭菌双蒸水(ddh2o)至25μl。

所述pcr反应体系的反应条件为：95℃预变性5min，然后进入95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s循环，共35个循环，72℃延伸10min，16℃5min；

(4)取所述pcr反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，eb染色后判断结果。

本发明中，对qx基因型ibv毒株rt-pcr扩增获得约200bp和340bp的两条带，对非qx毒株扩增仅获得约200bp一条带。qx毒株ibv-hf扩增获得的pcr产物为seqidno:1和seqidno:2所示的两段核苷酸序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明通过设计qx基因型的特异性引物，建立有效的rt-pcr检测方法。仅需通过一次rt-pcr反应就能达到对qx基因型的ibv进行分型检测的目的。

2、该试剂盒在同一pcr反应条件下，将2对引物加入同一个pcr体系中，既能有效地检测出临床样品或鸡胚尿囊液中的ibv，也能特异性地将qx型基因型的ibv区分出来。

3、该检测方法快速高效、准确，对于指导疫苗的选用以及ib的快速防控都具有很大的意义。

附图说明

图1为试剂盒rt-pcr扩增ibv-hf毒株(qx型)、m41(非qx型)的结果。

图中，m.100bpmarker；1.阴性对照；2.m41；3.ibv-hf

图2为试剂盒rt-pcr特异性扩增ibv的结果。

图中，m.100bpmarker；1.阴性对照；2-6.ndv、aivh5亚型、aivh7亚型、aivh9亚型、ibdv；7.m41；8.ibv-hf。

图3为试剂盒检测所选毒株的验证结果。

图中，m.100bpmarker；1.阴性对照；2-6.ndv、aivh5亚型、aivh7亚型、aivh9亚型、ibdv；7.ibv-gx-1023(ldt-3型)；8.4/91；9-14.m41、h120、h52、zj971、jh06011、jh06111(mass型)；15-18.ibv-sd、ibv-qx-h120、ibv-gx-0808、ibv-hf(qx型)。

具体实施方式

本发明中所利用的试剂盒组成包括：

(1)rna提取试剂：trizol试剂；

(2)反转录试剂：5×反应缓冲液，10mm的dntpmix，0.2μg/μl的随机引物，20u/μlrnase抑制剂，200u/μl的反转录酶，nuclease-free水。

(3)pcr反应试剂：2×taqmastermix，灭菌双蒸水。

(4)分型引物：所述通用引物和qx基因型毒株特异性引物(如seqidno:3-6所示)的浓度均为10μm；

(5)阳性对照样品：qx基因型毒株核酸抽提物的反转录产物cdna；

(6)阴性对照样品：正常鸡胚尿囊液抽提rna的反转录产物cdna。

上述试剂盒的使用方法，依次包括下列步骤：

(1)从待测拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品中提取总rna：

在1.5mlep管中加500μl处理好的拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品后(不足500μl的可以用灭菌pbs稀释)，加入500μltrizol试剂，充分混匀，室温静置5min；加200μl氯仿，充分混匀15s，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；取上清(400-600μl)加等体积的异丙醇，轻微混匀，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；弃去上清，加1ml75％乙醇，4℃，12000rpm离心7min；弃去上清，沉淀干燥10-15min，加10μlnuclease-freewater水溶解，得总rna。(注：rna抽提时所用的枪头于ep管应不含rna酶)

(2)以上一步骤提取的总rna为模板，进行反转录反应，体系为：11μl总rna模板，4μl的5×反应缓冲液,2μl的10mm的dntpmix,1μl的0.2μg/μl的随机引物,1μl20u/μl的rnase抑制剂,1μl200u/μl的反转录酶，共20μl。混匀后在42℃恒温反应1h，然后70℃恒温终止反应10min，得cdna。

(3)以所述反转录产物cdna为模板，利用两对分型引物进行pcr扩增，所述pcr体系为：2×taqmastermix12.5μl，10μm通用上下游引物(通用-f,通用-r)各0.8μl，10μmqx基因型引物(qx-f,qx-r)各0.4μl，cdna模板1μl，加灭菌双蒸水(ddh2o)至25μl。

所述pcr反应体系的反应条件为：95℃预变性5min，然后进入95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s的循环，共进行35个循环，72℃延伸10min，16℃5min；

(4)扩增产物电泳检测：取上述反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，取5μl扩增产物点样于1％琼脂糖凝胶中，250v电泳25min，凝胶成像系统观察。对qx基因型毒株rt-pcr扩增获得约200bp和340bp的两条带，对非qx基因型毒株仅获得约200bp一条带。

(5)扩增产物测序：取阳性对照株ibv-hf扩增获得的特异性条带送测序公司进行测序确定。扩增获得的pcr产物为seqidno:1-2所示的两段核苷酸序列，大小分别为193bp和339bp；

(6)本设计的方法对其它qx基因型、非qx基因型毒株扩增获得类似的结果：扩增qx基因型毒株获得大约200bp和340bp左右两条带，扩增非qx基因型毒株时，仅获得约200bp一条带。

下面结合实施例和附图作进一步说明。应该理解这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。

[实施例1]rna抽提

1检测样品处理

组织样品的处理：采取病死鸡气管、肾脏等易分离ibv的组织，用剪刀剪碎后按照1:3体积比加入灭菌pbs充分研磨。将匀浆好的组织悬液于-20℃(或更低温度)-室温反复冻融3次后12,000rpm离心10min，取上清液200μl于新的灭菌离心管中。

拭子样品的处理：新鲜的咽喉或泄殖腔拭子加入1ml灭菌pbs，振荡搅匀之后，弃掉拭子(尽量将拭子中的液体收集完全)。浸出液12,000rpm离心10min，取上清液200μl于新的灭菌离心管中。

尿囊液处理：收集病毒感染的鸡胚尿囊液进行12,000rpm离心10min，取上清液200μl于新的灭菌离心管中。

2病毒rna提取

在1.5mlep管中加500μl处理好的拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品后，加入500μltrizol试剂，充分混匀，室温静置5min；加200μl氯仿，充分混匀15s，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；取上清500μl加等体积的异丙醇，轻微混匀，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；弃去上清，加1ml75％乙醇，4℃，12000rpm离心7min；弃上清，将管中剩余液体瞬离后小心吸尽(注意枪头不要碰到沉淀)，将ep管开口放于干净的纸上晾干15min,加10μlnuclease-free水溶解，得总rna。(注：rna抽提时所用的枪头与ep管应不含rna酶)

[实施例2]反转录反应(rt反应)

(4)以上一步骤提取的总rna为模板，进行反转录反应，反转录反应的体系为：

11μl总rna模板，4μl的5×反应缓冲液,2μl的10mm的dntpmix,1μl的0.2μg/μl的随机引物,1μl20u/μl的rnase抑制剂,1μl200u/μl的反转录酶，共20μl。混匀后在42℃恒温反应1h，然后70℃恒温终止反应10min，得cdna。储存于-20℃

[实施例3]pcr反应

1.引物设计

收集genebank上近年来在我国流行的ibvqx型毒株以及一些经典qx株的s1基因序列，共计212条。同时从genebank选取各种不同基因型的非qx型毒株的s1基因序列共49条。使用dnaman软件对这261条s1基因进行序列比对，使用引物设计软件premierprimer5根据qx型毒株s1基因的保守区设计1对引物(qx-f，qx-r),且这对引物在非qx型的毒株上不保守。通用引物(通-f,通-r，表1)参考凌吉飞的硕士论文。引物均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，page纯化。引物信息如表1所示。

表1试剂盒分型引物信息

2.阳性标准品制备

ibv-hf(qx型)毒株接种9-11日龄spf鸡胚，鸡胚感染后36-72h收获感染鸡胚尿囊液。按前述方法处理好鸡胚尿囊液后，从尿囊液中提取总rna，反转录成cdna。

然后测定cdna浓度，-20℃保存备用。

3.pcr反应体系优化

使用上述制备的cdna作为模板，分别对pcr程序中的引物浓度、退火温度、延伸时间、pcr循环次数等条件进行优化。

对反应体系和扩增程序优化的结果如下：

在25μlpcr反应体系中，2×taqmastermix12.5μl，通用上下游引物(通用-f,通用-r)各0.8μl，qx基因型引物(qx-f,qx-r)各0.4μl，cdna模板1μl，ddh2o9.1μl。

所述pcr反应体系的反应条件为：95℃预变性5min，然后进入95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s的循环，共35个循环，72℃延伸10min，16℃5min；

利用优化后的体系对阳性标准品pcr扩增结果如图1所示，qx型毒株(ibv-hf)扩增出约200bp和340bp的两条带，非qx型ibv毒株(m41)仅扩增出约200bp一条带(图1)。扩增结果与预期设计的相符。

4.pcr产物测序验证

将阳性标准品扩增得到的pcr产物进行回收，送测序公司测序分析，验证扩增的序列与预期的理论序列完全一致，经blast分析也显示，扩增的序列为相应片段。具体的毒株扩增片段序列为seqidno1-2所示。还对其他4株qx基因型毒株的340bp左右条带进行测序验证，结果blast分析显示均与qx型毒株序列具有极高的相似性。

[实施例4]试剂盒的特异性验证

选取常见禽类病毒包括禽流感病毒(aiv)h5、h7和h9亚型病毒、鸡新城疫病毒(ndv)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)感染的鸡胚尿囊液或尿囊膜，抽提rna，反转录成cdna，用ibv分型检测试剂盒优化好的体系进行pcr检测。特异性验证结果如图2所示，用于阳性对照的ibv-hf毒株的cdna扩增到了特异性的目的条带，非qx型毒株亦扩增得到了目的条带，而对常见禽类病毒aiv(h5、h7、h9亚型)、ndv、ibdv不能扩出任何条带(图2)。

[实施例5]不同基因型毒株样品检测验证

取浙江大学农业部动物病毒学重点实验室保存的部分毒株以及广西大学动物科技学院禽病研究室惠赠的部分毒株cdna作为验证对象。验证的毒株包括4/91类型毒株、ldt-3型毒株(ibv-gx-1023)、mass型毒株(m41、h120、h52、zj971、jh06011、jh06111)、qx型毒株(ibv-sd、ibv-qx-h120、ibv-gx-0808、ibv-hf)以及常见禽类病毒aiv(h5、h7、h9亚型)、ndv、ibdv。这些毒株感染鸡胚尿囊液的核酸抽提物分别用本发明的试剂盒检测，结果qx基因型ibv毒株均扩增出200bp和340bp左右的dna条带，非qx型ibv毒株扩增出200bp左右的条带，非ibv毒株未扩增出条带(图3)。验证了ibvrt-pcr分型检测试剂盒的特异性和有效性。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种鸡传染性支气管炎病毒qx型毒株鉴别检测试剂盒

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>193

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccaaagtgcctttaggcctccaaatggatggcatttgcaagggggtgcttatgcagtagt60

gaattctactaattatactagtaatgccgattctgcaagtgggtgcactgttggtattat120

taaggacgtctataatcaaagtgcggcttccatagctatgacagcacctcctcagggtat180

ggcttggtctaag193

<210>2

<211>339

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtcatttctgggtcagtttgtgtataaggcaagtgattttatgtatgggtcttatcatcc60

taggtgttcttttagaccagaaaccattaatagtggtttatggtttaattccttgtcagt120

ttctcttacttatggacccctacagggagggtgtaagcaatctgtttttagtggtaaggc180

aacgtgttgttatgcctactcttataatggccctagagcatgtaaaggtgtttattcagg240

tgaattaagcaagacttttgaatgtggattgctggtttatgttactaagagtgatggctc300

tcgtatacaaactagaacggagcccttagtattaacgca339

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccaaagtgccttcagacc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gctagaccaagccatacc18

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtcatttctgagtcagtttgtg22

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tgcgttaatactaagggctc20